Lyse ultrasonique des cellules issues de la bio-ingénierie dans la production industrielle

Les espèces de bactéries issues de la bio-ingénierie, telles que E. coli, ainsi que les types de cellules de mammifères et de plantes génétiquement modifiées sont largement utilisés en biotechnologie pour exprimer des molécules. Pour libérer ces biomolécules synthétisées, une technique fiable de désintégration des cellules est nécessaire. L'ultrasonication à haute performance est une méthode éprouvée pour une lyse cellulaire efficace et fiable. – facilement extensible à de grands débits. Hielscher Ultrasonics vous propose un équipement ultrasonique de haute performance pour une lyse cellulaire efficace afin de produire de grands volumes de biomolécules de haute qualité.

Extraction de molécules à partir d'usines cellulaires

Pour la production d'une large gamme de biomolécules, divers microbes et cellules végétales peuvent être utilisés comme usines cellulaires microbiennes, notamment Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana et des algues, parmi beaucoup d'autres. Ces usines cellulaires peuvent produire des protéines, des lipides, des produits biochimiques, des polymères, des biocarburants et des produits oléochimiques, qui sont utilisés comme aliments ou matières premières pour des applications industrielles. Les cellules utilisées comme usines cellulaires sont cultivées dans des bioréacteurs fermés, où elles peuvent atteindre un haut niveau d'efficacité, de spécificité et de faibles besoins énergétiques.
Pour isoler les molécules cibles des cultures cellulaires issues de la bio-ingénierie, les cellules doivent être désintégrées afin que le matériel intracellulaire soit libéré. Les broyeurs cellulaires à ultrasons sont reconnus comme une technique très fiable et efficace pour la désintégration des cellules et la libération des composés.

Les usines cellulaires microbiennes sont des cellules métaboliquement modifiées utilisées pour la synthèse de divers composés précieux. La désintégration cellulaire par ultrasons est une méthode efficace et fiable pour libérer les composés précieux de l'intérieur de la cellule.étude et graphique : ©Villaverde, 2010.

Avantages des broyeurs de cellules à ultrasons

Technologie non thermique, douce et pourtant très efficace, les perturbateurs ultrasoniques sont utilisés en laboratoire et dans l'industrie pour lyser les cellules et produire des extraits de haute qualité, par exemple pour isoler des molécules à partir d'usines cellulaires.

Les ultrasons de puissance pour une perturbation efficace des usines cellulaires microbiennes

Mécanisme et effets des perturbateurs cellulaires ultrasoniques :
La perturbation cellulaire par ultrasons a utilisé la puissance des ondes ultrasonores. L’homogénéisateur à ultrasons ? Cell Disruptor est équipé d’une sonde (alias Sonotrode) en alliage de titane qui oscille à une fréquence élevée d’environ 20 kHz. Cela signifie que la sonde à ultrasons couple 20 000 vibrations par seconde dans le liquide soniqué. Les ondes ultrasonores couplées au liquide sont caractérisées par une alternance de haute pression ? cycles à basse pression. Lors d’un cycle à basse pression, le liquide se dilate et de minuscules bulles de vide se forment. Ces très petites bulles se développent sur plusieurs cycles de pression alternés jusqu’à ce qu’elles ne puissent plus absorber d’énergie. À ce stade, les bulles de cavitation implosent violemment et créent localement un environnement extraordinairement dense en énergie. Ce phénomène est connu sous le nom de cavitation acoustique et se caractérise par des températures localement très élevées, des pressions très élevées et des forces de cisaillement. Ces contraintes de cisaillement brisent efficacement les parois cellulaires et augmentent le transfert de masse entre l’intérieur de la cellule et le solvant environnant. En tant que technique purement mécanique, les forces de cisaillement générées par les ultrasons sont largement utilisées et la procédure recommandée pour la rupture des cellules bactériennes, ainsi que pour l’isolement des protéines. En tant que méthode simple et rapide de rupture cellulaire, la sonication est idéale pour l’isolement de petits, moyens et grands volumes. Les ultrasonisateurs numériques de Hielscher sont équipés d’un menu clair de paramètres pour un contrôle précis de la sonication. Toutes les données de sonication sont automatiquement stockées sur une carte SD intégrée et sont simplement accessibles. Des options sophistiquées de dissipation de la chaleur, telles que le refroidissement externe, la sonication en mode pulsé, etc. pendant le processus de désintégration par ultrasons, garantissent le maintien de la température idéale du processus et donc l’intégrité des composés sensibles à la chaleur extraits.

La recherche souligne les atouts de la désintégration et de l'extraction cellulaires par ultrasons

Le Prof. Chemat et al. (2017) reprennent dans leur étude que “L’extraction assistée par ultrasons est une alternative verte et économiquement viable aux techniques conventionnelles pour les produits alimentaires et naturels. Les principaux avantages sont la réduction du temps d’extraction et de traitement, la quantité d’énergie et de solvants utilisés, les opérations unitaires et le CO₂ Émissions.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) ont utilisé un homogénéisateur à haute pression et un désintégrateur cellulaire à ultrasons dans leur étude pour la lyse des spores afin de libérer de l’ADN. En comparant les deux méthodes de perturbation cellulaire, l’équipe de recherche conclut qu’en ce qui concerne la lyse cellulaire de l’ADN des spores, “L’analyse a été effectuée en utilisant des lysats cellulaires issus de l’homogénéisation à haute pression. Par la suite, nous nous sommes rendu compte qu’une rupture de cellule par ultrasons présentait des avantages exceptionnels à cet effet. Il est assez rapide et peut être traité pour de petits volumes d’échantillons.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolécules issues des usines cellulaires pour la production alimentaire

Les usines cellulaires microbiennes sont une méthode de production viable et efficace utilisant des organismes microbiens pour produire des rendements élevés de métabolites natifs et non natifs par bio-ingénierie métabolique de micro-organismes microbiens tels que les bactéries, les levures, les champignons, etc. Les enzymes en vrac sont par exemple produites à l'aide de micro-organismes tels qu'Aspergillus oryzae, des champignons et des bactéries. Ces enzymes en vrac sont utilisées pour la production d'aliments et de boissons, ainsi que dans l'agriculture, la bioénergie et l'entretien ménager.
Certaines bactéries telles que Acetobacter xylinum et Gluconacetobacter xylinus produisent de la cellulose au cours du processus de fermentation, où les nanofibres sont synthétisées selon un processus ascendant. La cellulose bactérienne (également appelée cellulose microbienne) est chimiquement équivalente à la cellulose végétale, mais elle présente un degré élevé de cristallinité et de pureté (sans lignine, hémicellulose, pectine et autres composants biogènes) ainsi qu'une structure unique de réseau tridimensionnel (3D) réticulé de nanofibres de cellulose. (Par rapport à la cellulose d'origine végétale, la cellulose bactérienne est plus durable et la cellulose produite est pure, ne nécessitant pas d'étapes de purification complexes. L'ultrasonication et l'extraction par solvant à l'aide de NaOH ou de SDS (sodium dodécyl sulfate) sont très efficaces pour isoler la cellulose bactérienne des cellules bactériennes.

Biomolécules provenant d'usines cellulaires pour la production de produits pharmaceutiques et de vaccins

L'insuline humaine est l'un des produits pharmaceutiques les plus connus issus des usines cellulaires. Pour la production d'insuline par génie biologique, on utilise principalement E. coli et Saccharomyces cerevisiae. Étant donné que les molécules nanométriques biosynthétisées présentent une biocompatibilité élevée, les nanoparticules biologiques telles que la ferritine sont avantageuses pour de nombreuses applications de biofabrication. En outre, la production dans des microbes métaboliquement modifiés est souvent beaucoup plus efficace dans les rendements obtenus. Par exemple, la production d'acide artémisinique, de resvératrol et de lycopène a été multipliée par dix, voire par plusieurs centaines, et est déjà établie ou en cours de développement pour une production à l'échelle industrielle. (cf. Liu et al. ; Microb. Cell Fact. 2017)
Par exemple, les biomolécules nanométriques à base de protéines ayant des propriétés d'auto-assemblage, telles que la ferritine et les particules de type virus, sont particulièrement intéressantes pour le développement de vaccins, car elles imitent à la fois la taille et la structure des agents pathogènes et se prêtent à la conjugaison d'antigènes en surface pour favoriser l'interaction avec les cellules immunitaires. Ces molécules sont exprimées dans ce que l'on appelle des usines cellulaires (par exemple, des souches d'E. coli modifiées), qui produisent une certaine molécule cible.

Protocole de lyse ultrasonique d'E. coli BL21 pour la libération de ferritine

La ferritine est une protéine dont la fonction principale est le stockage du fer. La ferritine présente des capacités prometteuses en tant que nanoparticules auto-assemblées dans les vaccins, où elle est utilisée comme vecteur de vaccination (par exemple, les protéines de pointe SARS-Cov-2). La recherche scientifique de Sun et. al. (2016) montre que la ferritine recombinante peut être libérée sous forme soluble à partir d'Escherichia coli à de faibles concentrations de NaCl (≤50 mmol/L). Afin d'exprimer la ferritine dans E. coli BL21 et de libérer la ferritine, le protocole suivant a été appliqué avec succès. Le plasmide recombinant pET-28a/ferritine a été transformé dans la souche E coli BL21 (DE3). Les cellules E coli BL21 (DE3) ferritinées ont été cultivées dans un milieu de croissance LB avec 0,5 % de kanamycine à 37 °C et induites à une OD600 de 0,6 avec 0,4 % d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside pendant 3 heures à 37 °C. La culture finale a ensuite été récoltée par centrifugation à 8000g pendant 10 minutes à 4°C, et le culot a été recueilli. Ensuite, le culot a été remis en suspension dans le milieu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% d'extrait de levure)/tampon de lyse (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) et différentes concentrations de solution de NaCl (0, 50, 100, 170, et 300 mmol/L), respectivement. Pour la lyse des cellules bactériennes, la sonication a été appliquée en mode pulsé : par exemple, à l'aide de la touche Ultrasonateur UP400St à 100% d'amplitude avec un cycle de 5 secondes ON, 10 secondes OFF, pendant 40 cycles) et ensuite centrifugé à 10 000g pendant 15 minutes à 4°C. Le surnageant et le précipité ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE). Tous les gels colorés au dodécyl sulfate de sodium ont été scannés avec un scanner haute résolution. Les images des gels ont été analysées à l'aide du logiciel Magic Chemi 1D. Pour une clarté optimale, les bandes de protéines ont été détectées en ajustant les paramètres. Les données relatives aux bandes ont été générées à partir de triplicats techniques. (cf. Sun et al., 2016)

Perturbateurs cellulaires à ultrasons pour la lyse industrielle des usines de cellules

La lyse et l'extraction ultrasoniques constituent une méthode fiable et confortable pour libérer les métabolites des usines cellulaires et favoriser ainsi une production efficace de molécules cibles. Les broyeurs cellulaires à ultrasons sont disponibles de la taille du laboratoire à la taille industrielle et les processus peuvent être mis à l'échelle de façon complètement linéaire.
Hielscher Ultrasonics est votre partenaire compétent pour les perturbateurs à ultrasons de haute performance et dispose d'une longue expérience dans le domaine de l'implantation de systèmes à ultrasons en laboratoire et en milieu industriel.
En ce qui concerne le matériel et les logiciels sophistiqués, les systèmes de broyage cellulaire Hielscher Ultrasonics répondent à toutes les exigences en matière de contrôle optimal des processus, de facilité d'utilisation et de convivialité. Les clients et les utilisateurs des appareils à ultrasons Hielscher apprécient le fait que les broyeurs et extracteurs de cellules à ultrasons Hielscher permettent une surveillance et un contrôle précis du processus. – par l'intermédiaire d'un écran tactile numérique et d'une télécommande à navigateur. Toutes les données de sonification importantes (par exemple l'énergie nette, l'énergie totale, l'amplitude, la durée, la température, la pression) sont automatiquement stockées sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée. Cela permet d'obtenir des résultats reproductibles et répétables et facilite la normalisation des processus ainsi que le respect des bonnes pratiques de fabrication (cGMP).
Bien entendu, les processeurs à ultrasons Hielscher sont conçus pour fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, à pleine charge, et peuvent donc être utilisés de manière fiable dans des environnements de production industrielle. Grâce à une grande robustesse et à une maintenance réduite, les temps d'arrêt des équipements à ultrasons sont très faibles. Les fonctions CIP (clean-in-place) et SIP (sterilize-in-place) minimisent le nettoyage laborieux, d'autant plus que toutes les parties humides sont des surfaces métalliques lisses (pas d'orifices ou de buses cachés).

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons :