Lyse par ultrasons de cellules issues de la bio-ingénierie en production industrielle

Des espèces bactériennes issues de la bio-ingénierie telles que E. coli, ainsi que des types de cellules de mammifères et de plantes génétiquement modifiées, sont largement utilisées en biotechnologie pour exprimer des molécules. Afin de libérer ces biomolécules synthétisées, une technique fiable de disruption cellulaire est nécessaire. L’ultrasonication haute performance est une méthode éprouvée pour une lyse cellulaire efficace et fiable – facilement transposable à de grandes capacités de traitement. Hielscher Ultrasonics vous propose des équipements à ultrasons haute performance pour une lyse cellulaire efficace afin de produire de grands volumes de biomolécules de haute qualité.

Extraction de molécules à partir d’usines cellulaires

Pour la production d’un large éventail de biomolécules, divers microbes et cellules végétales modifiés peuvent être utilisés comme usines cellulaires microbiennes, notamment Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, les cyanobactéries, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana et les algues, parmi bien d’autres. Ces usines cellulaires peuvent produire des protéines, des lipides, des produits biochimiques, des polymères, des biocarburants et des produits oléochimiques, qui sont utilisés comme aliments ou comme matières premières pour des applications industrielles. Les cellules utilisées comme usines cellulaires sont cultivées dans des bioréacteurs fermés, où elles peuvent atteindre une efficacité élevée, une grande spécificité et de faibles besoins énergétiques.
Pour isoler les molécules cibles des cultures de cellules issues de la bio-ingénierie, les cellules doivent être rompues afin que le matériel intracellulaire soit libéré. Les disrupteurs cellulaires à ultrasons sont bien établis comme technique hautement fiable et efficace pour la désintégration cellulaire et la libération de composés.

Les usines cellulaires microbiennes sont des cellules modifiées métaboliquement, utilisées pour la synthèse de divers composés précieux. La disruption cellulaire par ultrasons est une méthode efficace et fiable pour libérer les composés précieux de l’intérieur des cellules.
étude et graphique : ©Villaverde, 2010.

Avantages des disrupteurs cellulaires à ultrasons

En tant que technologie non thermique, douce et pourtant hautement efficace, les disrupteurs à ultrasons sont utilisés en laboratoire et dans l’industrie pour lyser des cellules et produire des extraits de haute qualité, utilisés par ex. pour l’isolement de molécules à partir d’usines cellulaires.

Ultrasons de puissance pour une disruption efficace des usines cellulaires microbiennes

Mécanisme et effets des disrupteurs cellulaires à ultrasons :
La disruption cellulaire par ultrasons utilise la puissance des ondes ultrasonores. L’homogénéisateur à ultrasons / disrupteur cellulaire est équipé d’une sonde (également appelée sonotrode) en alliage de titane qui oscille à une fréquence élevée d’env. 20 kHz. Cela signifie que la sonde à ultrasons transmet 20 000 vibrations par seconde au liquide soumis à la sonication. Les ondes ultrasonores couplées dans le liquide sont caractérisées par une alternance de cycles haute pression / basse pression. Pendant un cycle basse pression, le liquide se dilate et de minuscules bulles de vide apparaissent. Ces très petites bulles grossissent sur plusieurs cycles de pression alternés jusqu’à ce qu’elles ne puissent plus absorber d’énergie. À ce stade, les bulles de cavitation implosent violemment et créent localement un environnement extraordinairement dense en énergie. Ce phénomène est connu sous le nom de cavitation acoustique et se caractérise localement par des températures très élevées, des pressions très élevées et des forces de cisaillement. Ces contraintes de cisaillement rompent efficacement les parois cellulaires et augmentent le transfert de masse entre l’intérieur de la cellule et le solvant environnant. En tant que technique purement mécanique, les forces de cisaillement générées par ultrasons sont largement utilisées et constituent la procédure recommandée pour la disruption des cellules bactériennes ainsi que pour l’isolement de protéines. En tant que méthode de disruption cellulaire simple et rapide, la sonication est idéale pour l’isolement de petits, moyens et grands volumes. Les ultrasonicateurs numériques de Hielscher sont équipés d’un menu de réglages clair pour un contrôle précis de la sonication. Toutes les données de sonication sont automatiquement enregistrées sur une carte SD intégrée et sont facilement accessibles. Des options sophistiquées de dissipation de la chaleur, telles que le refroidissement externe, la sonication en mode pulsé, etc., pendant le processus de désintégration par ultrasons garantissent le maintien de la température de processus idéale et donc l’intégrité des composés thermosensibles extraits.

La recherche souligne les atouts de la disruption cellulaire et de l’extraction par ultrasons

Le Prof. Chemat et al. (2017) résument dans leur étude que « l’extraction assistée par ultrasons est une alternative verte et économiquement viable aux techniques conventionnelles pour les aliments et les produits naturels. Les principaux avantages sont la réduction du temps d’extraction et de traitement, de la quantité d’énergie et de solvants utilisés, des opérations unitaires et des émissions de CO₂ . »
Gabig-Ciminska et al. (2014) ont utilisé un homogénéisateur haute pression et un désintégrateur cellulaire à ultrasons dans leur étude pour la lyse de spores afin de libérer l’ADN. En comparant les deux méthodes de disruption cellulaire, l’équipe de recherche conclut, concernant la lyse cellulaire pour l’ADN des spores, que « l’analyse a été réalisée en utilisant des lysats cellulaires issus de l’homogénéisation haute pression. Par la suite, nous avons constaté qu’une disruption cellulaire par ultrasons présente des avantages remarquables à cette fin. Elle est plutôt rapide et peut être réalisée pour de petits volumes d’échantillons. » (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolécules issues d’usines cellulaires pour la production alimentaire

Les usines cellulaires microbiennes constituent une méthode de production viable et efficace, qui utilise des organismes microbiens pour produire des rendements élevés de métabolites natifs et non natifs grâce à la bio-ingénierie métabolique de micro-organismes tels que les bactéries, les levures, les champignons, etc. Des enzymes en vrac sont par exemple produites à l’aide de micro-organismes tels que Aspergillus oryzae, des champignons et des bactéries. Ces enzymes en vrac sont utilisées pour la production d’aliments et de boissons, ainsi que dans l’agriculture, la bioénergie et l’entretien ménager.
Certaines bactéries telles que Acetobacter xylinum et Gluconacetobacter xylinus produisent de la cellulose au cours du processus de fermentation, où des nanofibres sont synthétisées selon un processus ascendant (bottom-up). La cellulose bactérienne (également appelée cellulose microbienne) est chimiquement équivalente à la cellulose végétale, mais elle présente un degré de cristallinité élevé et une grande pureté (exempte de lignine, d’hémicellulose, de pectine et d’autres composants biogènes) ainsi qu’une structure unique de réseau réticulé tridimensionnel (3D) tissé de nanofibres de cellulose. (cf. Zhong, 2020) Par rapport à la cellulose d’origine végétale, la cellulose bactérienne est plus durable et la cellulose produite est pure, sans nécessiter d’étapes de purification complexes. L’ultrasonication et l’extraction par solvant à l’aide de NaOH ou de SDS (dodécylsulfate de sodium) sont très efficaces pour l’isolement de la cellulose bactérienne à partir des cellules bactériennes.

Biomolécules issues d’usines cellulaires pour la production pharmaceutique et vaccinale

L’un des produits pharmaceutiques les plus importants issus d’usines cellulaires est l’insuline humaine. Pour la production d’insuline par bio-ingénierie, on utilise principalement E. coli et Saccharomyces cerevisiae. Étant donné que les molécules de taille nanométrique biosynthétisées offrent une biocompatibilité élevée, les nanoparticules biologiques telles que la ferritine sont avantageuses pour de nombreuses applications de biofabrication. De plus, la production dans des microbes modifiés métaboliquement est souvent nettement plus efficace en termes de rendements obtenus. Par exemple, la production d’acide artémisinique, de resvératrol et de lycopène a été multipliée par dix à plusieurs centaines, et elle est déjà établie ou en cours de développement pour une production à l’échelle industrielle. (cf. Liu et al. ; Microb. Cell Fact. 2017)
Par exemple, les biomolécules protéiques de taille nanométrique dotées de propriétés d’auto-assemblage, telles que la ferritine et les particules pseudo-virales, sont particulièrement intéressantes pour le développement de vaccins, car elles imitent à la fois la taille et la structure des agents pathogènes et se prêtent à la conjugaison d’antigènes à leur surface afin de favoriser l’interaction avec les cellules immunitaires. De telles molécules sont exprimées dans des usines cellulaires (par ex. des souches modifiées d’E. coli), qui produisent une molécule cible déterminée.

Protocole de lyse par ultrasons d’E. coli BL21 pour la libération de ferritine

La ferritine est une protéine dont la fonction principale est le stockage du fer. La ferritine présente des capacités prometteuses en tant que nanoparticules auto-assemblées dans les vaccins, où elle est utilisée comme vecteur d’administration vaccinale (par ex. pour les protéines spike du SARS-Cov-2). Les travaux scientifiques de Sun et al. (2016) montrent que la ferritine recombinante peut être libérée sous forme soluble à partir d’Escherichia coli à de faibles concentrations de NaCl (≤50 mmol/L). Afin d’exprimer la ferritine dans E. coli BL21 et de libérer la ferritine, le protocole suivant a été appliqué avec succès. Le plasmide recombinant pET-28a/ferritine a été transformé dans la souche E coli BL21 (DE3). Les cellules E coli BL21 (DE3) à ferritine ont été cultivées dans un milieu de culture LB avec 0,5% de kanamycine à 37°C et induites à une OD600 de 0,6 avec 0,4% d’isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside pendant 3 heures à 37°C. La culture finale a ensuite été récoltée par centrifugation à 8000g pendant 10 minutes à 4°C, et le culot a été recueilli. Ensuite, le culot a été remis en suspension dans du milieu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extrait de levure)/tampon de lyse (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) et dans différentes concentrations de solution de NaCl (0, 50, 100, 170 et 300 mmol/L), respectivement. Pour la lyse des cellules bactériennes, la sonication a été appliquée en mode pulsé : par ex. à l’aide de l’ ultrasonicateur UP400St à 100% d’amplitude avec un cycle de service de 5 secondes ON, 10 secondes OFF, pendant 40 cycles) puis centrifugé à 10 000g pendant 15 minutes à 4°C. Le surnageant et le précipité ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Tous les gels colorés au dodécylsulfate de sodium ont été numérisés avec un scanner haute résolution. Les images des gels ont été analysées à l’aide du logiciel Magic Chemi 1D. Pour une clarté optimale, les bandes protéiques ont été détectées en ajustant les paramètres. Les données relatives aux bandes ont été générées à partir de triplicats techniques. (cf. Sun et al., 2016)

Disrupteurs cellulaires à ultrasons pour la lyse industrielle d’usines cellulaires

La lyse et l’extraction par ultrasons constituent une méthode fiable et pratique pour libérer des métabolites à partir d’usines cellulaires, contribuant ainsi à une production efficace de molécules cibles. Les disrupteurs cellulaires à ultrasons sont disponibles de la taille laboratoire à la taille industrielle et les processus peuvent être transposés de manière entièrement linéaire.
Hielscher Ultrasonics est votre partenaire compétent pour les disrupteurs à ultrasons haute performance et possède une longue expérience dans l’implantation de systèmes à ultrasons en environnement de paillasse et industriel.
En matière de matériel et de logiciel sophistiqués, les systèmes de disruption cellulaire de Hielscher Ultrasonics remplissent toutes les exigences d’un contrôle optimal du processus, d’une utilisation facile et d’une grande convivialité. Les clients et utilisateurs des ultrasonicateurs Hielscher apprécient le fait que les disrupteurs et extracteurs cellulaires à ultrasons Hielscher permettent une surveillance et un contrôle précis du processus – via un écran tactile numérique et une commande à distance par navigateur. Toutes les données de sonication importantes (par ex. énergie nette, énergie totale, amplitude, durée, température, pression) sont automatiquement enregistrées sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée. Cela permet d’obtenir des résultats reproductibles et répétables et facilite la standardisation des processus ainsi que le respect des Bonnes Pratiques de Fabrication (cGMP).
Bien entendu, les processeurs à ultrasons Hielscher sont conçus pour un fonctionnement 24/7 à pleine charge et peuvent donc être exploités de manière fiable dans des environnements de production industrielle. Grâce à leur grande robustesse et à leur faible besoin d’entretien, les temps d’arrêt des équipements à ultrasons sont vraiment réduits. Les fonctions CIP (nettoyage en place) et SIP (stérilisation en place) minimisent les nettoyages fastidieux, d’autant plus que toutes les pièces en contact avec le liquide sont des surfaces métalliques lisses (sans orifices ni buses cachés).

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicateurs :