Les espèces bactériennes issues de la bio-ingénierie, telles que E. coli, ainsi que les types de cellules mammaliennes et végétales génétiquement modifiées sont largement utilisés en biotechnologie pour exprimer des molécules. Afin de libérer ces biomolécules synthétisées, une technique fiable de désintégration cellulaire est nécessaire. L'ultrasonication haute performance est une méthode éprouvée pour une lyse cellulaire efficace et fiable. – facilement adaptable à de grands débits. Hielscher Ultrasonics vous propose des équipements à ultrasons de haute performance pour une lyse cellulaire efficace afin de produire de grands volumes de biomolécules de haute qualité.

Extraction de molécules à partir d'usines cellulaires

Pour la production d'une large gamme de biomolécules, divers microbes et cellules végétales modifiés peuvent être utilisés comme usines cellulaires microbiennes, notamment Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana et les algues. Ces usines cellulaires peuvent produire des protéines, des lipides, des produits biochimiques, des polymères, des biocarburants et des produits oléochimiques, qui sont utilisés comme aliments ou matières premières pour des applications industrielles. Les cellules utilisées comme usines cellulaires sont cultivées dans des bioréacteurs fermés, où elles peuvent atteindre un haut niveau d'efficacité, de spécificité et de faibles besoins énergétiques.
Pour isoler les molécules cibles des cultures cellulaires issues de la bio-ingénierie, les cellules doivent être désintégrées afin de libérer le matériel intracellulaire. Les broyeurs cellulaires à ultrasons sont reconnus comme une technique très fiable et efficace pour la désintégration des cellules et la libération des composés.

Les usines cellulaires microbiennes sont des cellules métaboliquement modifiées utilisées pour la synthèse de divers composés précieux. La désintégration cellulaire par ultrasons est une méthode efficace et fiable pour libérer les composés de valeur de l'intérieur de la cellule.
étude et graphique : ©Villaverde, 2010.

Avantages des broyeurs cellulaires à ultrasons

En tant que technologie non thermique, douce mais très efficace, les perturbateurs ultrasoniques sont utilisés en laboratoire et dans l'industrie pour lyser les cellules et produire des extraits de haute qualité, par exemple pour l'isolement de molécules à partir d'usines cellulaires.

Des ultrasons puissants pour perturber efficacement les usines de cellules microbiennes

Mécanisme et effets des perturbateurs cellulaires ultrasoniques :
La désintégration cellulaire par ultrasons utilise la puissance des ondes ultrasonores. L'homogénéisateur / broyeur cellulaire à ultrasons est équipé d'une sonde (appelée sonotrode) en alliage de titane qui oscille à une fréquence élevée d'environ 20 kHz. Cela signifie que la sonde à ultrasons transmet 20 000 vibrations par seconde au liquide à traiter par ultrasons. Les ondes ultrasonores couplées dans le liquide sont caractérisées par une alternance de cycles haute pression / basse pression. Pendant un cycle de basse pression, le liquide se dilate et de minuscules bulles de vide apparaissent. Ces très petites bulles grossissent sur plusieurs cycles de pression alternés jusqu'à ce qu'elles ne puissent plus absorber d'énergie. À ce moment-là, les bulles de cavitation implosent violemment et créent localement un environnement extraordinairement dense en énergie. Ce phénomène est connu sous le nom de cavitation acoustique et se caractérise par des températures localement très élevées, des pressions très fortes et des forces de cisaillement. Ces forces de cisaillement brisent efficacement les parois cellulaires et augmentent le transfert de masse entre l'intérieur de la cellule et le solvant environnant. En tant que technique purement mécanique, les forces de cisaillement générées par les ultrasons sont largement utilisées et constituent la procédure recommandée pour la désintégration des cellules bactériennes, ainsi que pour l'isolement des protéines. En tant que méthode de désintégration cellulaire simple et rapide, la sonication est idéale pour l'isolement de volumes de petite, moyenne et grande taille. Les ultrasons numériques de Hielscher sont équipés d'un menu clair de réglages pour un contrôle précis de la sonication. Toutes les données de sonication sont automatiquement stockées sur une carte SD intégrée et sont facilement accessibles. Des options sophistiquées de dissipation de la chaleur, telles que le refroidissement externe, la sonication en mode pulsé, etc. pendant le processus de désintégration par ultrasons, garantissent le maintien de la température idéale du processus et donc l'intégrité des composés thermosensibles extraits.

La recherche souligne les atouts de la désintégration et de l'extraction cellulaire par ultrasons

Le professeur Chemat et al. (2017) résume dans leur étude que " l'extraction assistée par ultrasons est une alternative verte et économiquement viable aux techniques conventionnelles pour les aliments et les produits naturels. Les principaux avantages sont la diminution du temps d'extraction et de traitement, de la quantité d'énergie et de solvants utilisés, des opérations unitaires et des émissions de CO₂ de l'UE."
Gabig-Ciminska et al. (2014) ont utilisé un homogénéisateur à haute pression et un désintégrateur cellulaire à ultrasons dans leur étude pour la lyse des spores afin de libérer l'ADN. En comparant les deux méthodes de désintégration cellulaire, l'équipe de recherche conclut que concernant la lyse cellulaire pour l'ADN des spores, " l'analyse a été faite en employant des lysats cellulaires provenant de l'homogénéisation à haute pression. Par la suite, nous avons réalisé que la désintégration cellulaire par ultrasons présentait des avantages exceptionnels à cet égard. Elle est assez rapide et peut être traitée pour de petits volumes d'échantillons". (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolécules issues d'usines cellulaires pour la production alimentaire

Les usines cellulaires microbiennes sont une méthodologie de production viable et efficace utilisant des organismes microbiens pour produire des rendements élevés de métabolites natifs et non natifs par bio-ingénierie métabolique de micro-organismes microbiens tels que des bactéries, des levures, des champignons, etc. Les enzymes en vrac sont par exemple produites à l'aide de micro-organismes tels que Aspergillus oryzae, des champignons et des bactéries. Ces enzymes en vrac sont utilisées pour la production d'aliments et de boissons, ainsi que dans l'agriculture, la bioénergie et les soins ménagers.
Certaines bactéries telles que Acetobacter xylinum et Gluconacetobacter xylinus produisent de la cellulose pendant le processus de fermentation, où les nanofibres sont synthétisées selon un processus ascendant. La cellulose bactérienne (également appelée cellulose microbienne) est chimiquement équivalente à la cellulose végétale, mais elle présente un degré élevé de cristallinité et une grande pureté (exempte de lignine, d'hémicellulose, de pectine et d'autres composants biogènes) ainsi qu'une structure unique de réseau réticulé tridimensionnel (3D) de nanofibres de cellulose. (cf. Zhong, 2020) Par rapport à la cellulose d'origine végétale, la cellulose bactérienne est plus durable et la cellulose produite est pure et ne nécessite pas d'étapes de purification complexes. L'ultrasonication et l'extraction par solvant à l'aide de NaOH ou de SDS (dodécylsulfate de sodium) sont très efficaces pour isoler la cellulose bactérienne des cellules bactériennes.

Biomolécules issues d'usines cellulaires pour la production de produits pharmaceutiques et de vaccins

L'insuline humaine est l'un des produits pharmaceutiques les plus connus dérivés d'usines cellulaires. Pour la production d'insuline par génie biologique, on utilise principalement E. coli et Saccharomyces cerevisiae. Comme les molécules nanométriques biosynthétisées offrent une biocompatibilité élevée, les nanoparticules biologiques telles que la ferritine sont avantageuses pour de nombreuses applications de bioproduction. En outre, la production dans des microbes modifiés sur le plan métabolique est souvent beaucoup plus efficace au niveau des rendements obtenus. Par exemple, la production d'acide artémisinique, de resvératrol et de lycopène a été multipliée par dix ou par plusieurs centaines, et est déjà établie ou en cours de développement pour une production à l'échelle industrielle. (cf. Liu et al. ; Microb. Cell Fact. 2017)
Par exemple, les biomolécules nanométriques à base de protéines ayant des propriétés d'auto-assemblage, comme la ferritine et les particules de type viral, sont particulièrement intéressantes pour le développement de vaccins, car elles imitent à la fois la taille et la structure des agents pathogènes et se prêtent à la conjugaison d'antigènes en surface pour favoriser l'interaction avec les cellules immunitaires. Ces molécules sont exprimées dans ce que l'on appelle des usines cellulaires (par exemple, des souches d'E. coli modifiées), qui produisent une certaine molécule cible.

Protocole pour la lyse par ultrasons et de E. coli BL21 pour la libération de ferritine

La ferritine est une protéine dont la fonction principale est le stockage du fer. La ferritine présente des capacités prometteuses en tant que nanoparticules auto-assemblées dans les vaccins, où elle est utilisée comme véhicule d'administration du vaccin (par exemple, les protéines de pointe SARS-Cov-2). La recherche scientifique de Sun et. al. (2016) montre que la ferritine recombinante peut être libérée sous une forme soluble à partir d'Escherichia coli à de faibles concentrations de NaCl (≤50 mmol/L). Afin d'exprimer la ferritine dans E. coli BL21 et de libérer la ferritine, le protocole suivant a été appliqué avec succès. Le plasmide recombinant pET-28a/ferritine a été transformé dans la souche E coli BL21 (DE3). Les cellules de ferritine E coli BL21 (DE3) ont été cultivées dans un milieu de croissance LB avec 0,5% de kanamycine à 37°C et induites à une OD600 de 0,6 avec 0,4% d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside pendant 3 heures à 37°C. La culture finale a ensuite été récoltée par centrifugation à 8000g pendant 10 minutes à 4°C, et le culot a été collecté. Ensuite, le culot a été remis en suspension dans le milieu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extrait de levure)/tampon de lyse (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) et différentes concentrations de solution de NaCl (0, 50, 100, 170, et 300 mmol/L), respectivement. Pour la lyse des cellules bactériennes, la sonication a été appliquée en mode pulsé : par exemple, en utilisant le bouton ultrasonateur UP400St à 100 % d'amplitude avec un rapport cyclique de 5 secondes ON, 10 secondes OFF, pendant 40 cycles) puis centrifugé à 10 000g pendant 15 minutes à 4°C. Le surnageant et le précipité ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Tous les gels colorés au dodécylsulfate de sodium ont été scannés avec un scanner haute résolution. Les images de gel ont été analysées à l'aide du logiciel Magic Chemi 1D. Pour une clarté optimale, les bandes de protéines ont été détectées en ajustant les paramètres. Les données relatives aux bandes ont été générées à partir de triplicats techniques. (cf. Sun et al., 2016)

Perturbateurs cellulaires à ultrasons pour la lyse industrielle des usines de cellules

La lyse et l'extraction par ultrasons constituent une méthode fiable et confortable pour libérer les métabolites des usines cellulaires et favoriser ainsi une production efficace de molécules cibles. Les broyeurs cellulaires à ultrasons sont disponibles du laboratoire à la taille industrielle et les processus peuvent être mis à l'échelle de manière totalement linéaire.
Hielscher Ultrasonics est votre partenaire compétent en matière de perturbateurs ultrasoniques de haute performance et possède une longue expérience dans le domaine de l'implantation de systèmes ultrasoniques en paillasse et en milieu industriel.
En ce qui concerne le matériel et le logiciel sophistiqués, les systèmes de broyage cellulaire Hielscher Ultrasonics répondent à toutes les exigences en matière de contrôle optimal du processus, de facilité d'utilisation et de convivialité. Les clients et les utilisateurs des appareils à ultrasons Hielscher apprécient le fait que les broyeurs et extracteurs de cellules à ultrasons Hielscher permettent de surveiller et de contrôler précisément le processus. – via un écran tactile numérique et une télécommande par navigateur. Toutes les données importantes de sonication (énergie nette, énergie totale, amplitude, durée, température, pression) sont automatiquement enregistrées sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée. Cela permet d'obtenir des résultats reproductibles et répétables et facilite la normalisation des processus ainsi que le respect des bonnes pratiques de fabrication (cGMP).
Bien entendu, les processeurs à ultrasons Hielscher sont conçus pour fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, à pleine charge, et peuvent donc être utilisés de manière fiable dans des environnements de production industrielle. En raison de leur grande robustesse et de leur faible maintenance, le temps d'arrêt de l'équipement à ultrasons est vraiment faible. Les fonctions CIP (clean-in-place) et SIP (sterilize-in-place) minimisent le nettoyage laborieux, d'autant plus que toutes les pièces humides sont des surfaces métalliques lisses (pas d'orifices ou de buses cachés).

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators: