Production biosynthétique d’oligosaccharides du lait humain

La biosynthèse des oligosaccharides du lait humain (HMO) par fermentation ou par réactions enzymatiques est un processus complexe, consommateur de ressources et souvent à faible rendement. L’ultrasonication augmente le transfert de masse entre le substrat et les usines cellulaires et stimule la croissance et le métabolisme cellulaires. La sonication intensifie ainsi la fermentation et les processus biochimiques, ce qui se traduit par une production accélérée et plus efficace des HMO.

Oligosaccharides du lait humain

Les oligosaccharides du lait humain (HMO), également appelés glycanes du lait humain, sont des molécules de sucre qui font partie du groupe des oligosaccharides. Parmi les exemples marquants de HMO figurent le 2’-fucosyllactose (2′-FL), le lacto-N-néotétraose (LNnT), le 3’-galactosyllactose (3′-GL) et le difucosyllactose (DFL).
Alors que le lait maternel humain est composé de plus de 150 structures de HMO différentes, seuls le 2′-fucosyllactose (2′-FL) et le lacto-N-néotétraose (LNnT) sont actuellement produits à l’échelle commerciale et utilisés comme additifs nutritionnels dans les préparations pour nourrissons.
Les oligosaccharides du lait humain (HMO) sont connus pour leur importance dans la nutrition du bébé. Les oligosaccharides du lait humain sont un type unique de nutriments qui agissent comme prébiotiques, antimicrobiens anti-adhésifs et immunomodulateurs dans l’intestin du nourrisson et contribuent de manière substantielle au développement du cerveau. Les HMO se trouvent exclusivement dans le lait maternel humain ; les laits des autres mammifères (p. ex. vache, chèvre, brebis, chamelle, etc.) ne présentent pas cette forme spécifique d’oligosaccharides.
Les oligosaccharides du lait humain sont le troisième composant solide le plus abondant du lait humain ; ils peuvent être présents dans l’eau sous forme dissoute, émulsionnée ou en suspension. Le lactose et les acides gras sont les solides les plus abondants du lait humain. Les HMO sont présents à une concentration de 0,35–0,88 onces (9,9–24,9 g)/ L. Environ 200 oligosaccharides du lait humain structurellement différents sont connus. L’oligosaccharide dominant chez 80% de toutes les femmes est le 2′-fucosyllactose, présent dans le lait maternel humain à une concentration d’environ 2,5 g/ L.
Les HMO n’étant pas digérés, ils n’apportent pas de contribution calorique à la nutrition. En tant que glucides indigestibles, ils agissent comme prébiotiques et sont fermentés de manière sélective par la microflore intestinale bénéfique, en particulier les bifidobactéries.

Biosynthèse des oligosaccharides du lait humain

Les usines cellulaires et les systèmes enzymatiques / chimio-enzymatiques sont les technologies actuellement utilisées pour la synthèse des HMO. Pour la production de HMO à l’échelle industrielle, la fermentation par usines cellulaires microbiennes, la synthèse biochimique et différentes réactions enzymatiques sont des voies réalisables de bioproduction des HMO. Pour des raisons économiques, la biosynthèse par usines cellulaires microbiennes est actuellement la seule technique utilisée au niveau de la production industrielle des HMO.

Fermentation des HMO à l’aide d’usines cellulaires microbiennes

E.coli, Saccharomyces cerevisiae et Lactococcus lactis sont des usines cellulaires couramment utilisées pour la bioproduction de molécules biologiques telles que les HMO. La fermentation est un processus biochimique qui utilise des micro-organismes pour convertir un substrat en molécules biologiques ciblées. Les usines cellulaires microbiennes utilisent des sucres simples comme substrat, qu’elles convertissent en HMO. Les sucres simples (p. ex. le lactose) étant un substrat abondant et bon marché, le processus de biosynthèse reste rentable.
La croissance et le taux de bioconversion sont principalement influencés par le transfert de masse des nutriments (substrat) vers les micro-organismes. Le taux de transfert de masse est un facteur majeur qui affecte la synthèse du produit pendant la fermentation. L’ultrasonication est bien connue pour favoriser le transfert de masse.
Pendant la fermentation, les conditions dans le bioréacteur doivent être constamment surveillées et régulées afin que les cellules puissent croître le plus rapidement possible pour ensuite produire les biomolécules ciblées (p. ex. des oligosaccharides tels que les HMO ; l’insuline ; des protéines recombinantes). En théorie, la formation du produit commence dès que la culture cellulaire commence à croître. Cependant, en particulier dans les cellules génétiquement modifiées telles que les micro-organismes modifiés, elle est généralement induite plus tard par l’ajout au substrat d’une substance chimique qui régule à la hausse l’expression de la biomolécule ciblée. Les bioréacteurs à ultrasons (sono-bioréacteurs) peuvent être contrôlés avec précision et permettent une stimulation spécifique des microbes. Il en résulte une biosynthèse accélérée et des rendements plus élevés.
Lyse et extraction par ultrasons : la fermentation de HMO complexes peut être limitée par de faibles titres de fermentation et par des produits qui restent intracellulaires. La lyse et l’extraction par ultrasons sont utilisées pour libérer le matériel intracellulaire avant la purification et les processus en aval.

Fermentation favorisée par ultrasons

Le taux de croissance de microbes tels qu’Escherichia coli, E.coli modifié, Saccharomyces cerevisiae et Lactococcus lactis peut être accéléré en augmentant le taux de transfert de masse et la perméabilité de la paroi cellulaire grâce à une ultrasonication contrôlée à basse fréquence. En tant que technique de traitement douce et non thermique, l’ultrasonication applique des forces purement mécaniques au bouillon de fermentation.
Cavitation acoustique : le principe de fonctionnement de la sonication repose sur la cavitation acoustique. La sonde à ultrasons (sonotrode) couple des ondes ultrasonores à basse fréquence dans le milieu. Les ondes ultrasonores se propagent dans le liquide en créant des cycles alternés de haute pression (compression) / basse pression (raréfaction). En comprimant et en étirant le liquide en cycles alternés, de minuscules bulles de vide apparaissent. Ces petites bulles de vide grossissent sur plusieurs cycles jusqu’à atteindre une taille à laquelle elles ne peuvent plus absorber d’énergie supplémentaire. À ce point de croissance maximale, la bulle de vide implose violemment et génère localement des conditions extrêmes, connues sous le nom de phénomène de cavitation. Au « point chaud » de cavitation, on peut observer des différentiels élevés de pression et de température ainsi que d’intenses forces de cisaillement avec des jets de liquide atteignant jusqu’à 280m/sec. Grâce à ces effets de cavitation, on obtient un transfert de masse approfondi ainsi que la sonoporation (la perforation des parois et des membranes cellulaires). Les nutriments du substrat sont acheminés vers et dans les cellules entières vivantes, de sorte que les usines cellulaires sont nourries de manière optimale et que les taux de croissance et de conversion sont accélérés. Les bioréacteurs à ultrasons constituent une stratégie simple mais très efficace pour traiter la biomasse dans un processus de biosynthèse en un seul récipient (one-pot).
Il est bien connu qu’une sonication douce et contrôlée avec précision intensifie les processus de fermentation.
La sonication améliore « la productivité de nombreux bioprocédés impliquant des cellules vivantes grâce à une meilleure absorption du substrat, une production ou une croissance accrues par l’augmentation de la porosité cellulaire, et potentiellement une libération accrue des composants cellulaires. » (Naveena et al. 2015)
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Naveena et al. (2015) ont constaté que l’intensification par ultrasons offre plusieurs avantages lors des bioprocédés, notamment de faibles coûts d’exploitation par rapport à d’autres options de traitement d’amélioration, une simplicité d’utilisation et des besoins énergétiques modestes.

Réacteurs de fermentation à ultrasons haute performance

Les processus de fermentation font intervenir des micro-organismes vivants tels que des bactéries ou des levures, qui fonctionnent comme des usines cellulaires. Si la sonication est appliquée pour favoriser le transfert de masse et augmenter la croissance et le taux de conversion des micro-organismes, il est crucial de contrôler précisément l’intensité des ultrasons afin d’éviter la destruction des usines cellulaires.
Hielscher Ultrasonics est spécialisé dans la conception, la fabrication et la distribution d’ultrasonicateurs haute performance, qui peuvent être contrôlés et surveillés avec précision pour garantir des rendements de fermentation supérieurs.

Le contrôle du procédé n’est pas seulement essentiel pour obtenir des rendements élevés et une qualité supérieure, il permet aussi de répéter et de reproduire les résultats. En particulier lorsqu’il s’agit de stimuler des usines cellulaires, l’adaptation des paramètres de sonication à chaque type de cellule est essentielle pour obtenir des rendements élevés et empêcher la dégradation cellulaire. C’est pourquoi tous les modèles numériques des ultrasonicateurs Hielscher sont équipés d’un logiciel intelligent qui vous permet d’ajuster, de surveiller et de réviser les paramètres de sonication. Les paramètres du procédé ultrasonore tels que l’amplitude, la température, la pression, la durée de sonication, les cycles de service et l’apport d’énergie sont essentiels pour favoriser la production de HMO par fermentation.
Le logiciel intelligent des ultrasonicateurs Hielscher enregistre automatiquement tous les paramètres importants du procédé sur la carte SD intégrée. L’enregistrement automatique des données du processus de sonication constitue la base de la standardisation du procédé et de la reproductibilité / répétabilité, requises par les bonnes pratiques de fabrication (BPF, GMP).

Réacteurs à ultrasons pour la fermentation

Hielscher propose des sondes à ultrasons de tailles, longueurs et géométries variées, qui peuvent être utilisées aussi bien pour des traitements en batch qu’en flux continu. Les réacteurs à ultrasons, également appelés sono-bioréacteurs, sont disponibles pour tout volume et couvrent le biotraitement par ultrasons, des petits échantillons de laboratoire jusqu’au niveau pilote et à la production entièrement commerciale.
Il est bien connu que l’emplacement de la sonotrode dans la cuve de réaction influence la distribution de la cavitation et du micro-écoulement (micro-streaming) dans le milieu. La sonotrode et le réacteur à ultrasons doivent être choisis en fonction du volume de bouillon cellulaire à traiter. Bien que la sonication puisse être réalisée aussi bien en batch qu’en mode continu, l’utilisation d’une installation en flux continu est recommandée pour les grands volumes de production. En passant à travers une cellule à circulation à ultrasons, tout le milieu cellulaire reçoit exactement la même exposition à la sonication, ce qui garantit le traitement le plus efficace. La large gamme de sondes à ultrasons et de réacteurs à cellule à circulation de Hielscher Ultrasonics permet d’assembler la configuration idéale de biotraitement par ultrasons.

Hielscher Ultrasonics – du laboratoire au pilote et à la production

Hielscher Ultrasonics couvre tout le spectre des équipements à ultrasons, des homogénéisateurs à ultrasons portatifs compacts pour la préparation d’échantillons aux systèmes de paillasse et pilotes, jusqu’aux puissantes unités à ultrasons industrielles qui traitent facilement des camions entiers par heure. Polyvalents et flexibles dans leurs options d’installation et de montage, les ultrasonicateurs Hielscher s’intègrent facilement dans tous les types de réacteurs batch, de fed-batch ou de configurations en flux continu.
Divers accessoires ainsi que des pièces sur mesure permettent d’adapter idéalement votre configuration à ultrasons aux exigences de votre procédé.
Conçus pour un fonctionnement 24/7 à pleine charge et en service intensif dans des conditions exigeantes, les processeurs à ultrasons Hielscher sont fiables et ne nécessitent que peu d’entretien.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicateurs :