Préparation de plasmides par ultrasonication

L’ultrasonication est une technique fiable pour fragmenter l’ADN plasmidique. Une amplitude contrôlable avec précision, un mode pulsé et une régulation de la température sont les caractéristiques les plus importantes d’un ultrasonicateur pour une fragmentation des plasmides sans dommage. En outre, l’utilisation de certains agents contribue à protéger contre la dégradation des plasmides. Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la fragmentation contrôlée des plasmides, depuis des flacons individuels et la sonication simultanée de nombreux échantillons jusqu’aux plaques multipuits. Découvrez-en plus sur la réussite de la fragmentation des plasmides par ultrasons !

Cisaillement des plasmides par ultrasonication

Lorsque des échantillons d’ADN sont soumis à des ondes ultrasonores, les vibrations générées par ultrasons créent dans le liquide une cavitation acoustique qui cisaille ou rompt les molécules d’ADN de haut poids moléculaire par des forces mécaniques. La sonication est la méthode la plus utilisée pour les expériences de cisaillement d’ADN en vrac, y compris pour des applications telles que l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), pour lesquelles de petites tailles de fragments sont absolument essentielles pour obtenir une haute résolution. (cf. Tseng et al., 2012)
L’ADN plasmidique (ADNp) est une forme spécifique d’ADN, caractérisée par sa forme circulaire, que l’on trouve chez les bactéries et certains eucaryotes.
L’ADNp superenroulé est la forme souhaitée de l’ADN plasmidique, car il donne les meilleurs résultats dans les processus en aval tels que le séquençage automatisé et la transfection. L’ultrasonication permet de fragmenter avec succès l’ADNp, y compris l’ADNp superenroulé.
Thompson et al. (2008) ont démontré que la sonication des plasmides, connue pour fragmenter l’ADN superenroulé, est un moyen efficace d’améliorer les longueurs de lecture phred20 des séquences au point qu’elles ne diffèrent pas significativement de celles du modèle de contrôle de Beckman Coulter ou des plasmides linéarisés par voie enzymatique.

Utilisation de vecteurs plasmidiques

Les plasmides sont souvent utilisés comme outils pour cloner, transférer et manipuler des gènes. Lorsque des plasmides sont utilisés expérimentalement à ces fins, on les appelle des vecteurs. Des fragments d’ADN ou des gènes peuvent être insérés dans un vecteur plasmidique, créant ainsi un plasmide dit recombinant. Les vecteurs plasmidiques servent de véhicules pour introduire l’ADN recombinant dans une cellule hôte et constituent un élément clé du clonage moléculaire.
« Les vecteurs non viraux font l’objet d’études approfondies quant à leur utilisation potentielle en thérapie génique pour traiter diverses maladies complexes. Les vecteurs non viraux protègent l’ADN plasmidique contre la dégradation physique, chimique et enzymatique et acheminent la molécule d’ADN jusqu’au site cible. Par exemple, les liposomes cationiques, le chitosane et d’autres nanoparticules chargées positivement forment des complexes avec l’ADN plasmidique par interactions électrostatiques. Cependant, les complexes liposomes cationiques/ADN plasmidique qui se forment facilement sont relativement gros (c.-à-d. 300–400 nm) et de nature hétérogène, ce qui les rend difficiles à utiliser dans des applications pharmaceutiques. Les complexes volumineux et hétérogènes ADN plasmidique/liposomes, ADN plasmidique/aérosols et ADN plasmidique/peptides peuvent être réduits en particules plus petites et homogènes par ultrasonication. » (Sarker et al., 2019)
Un exemple marquant de l’utilisation de vecteurs plasmidiques est CRISPR–Cas9. Le système CRISPR–Cas9 est généralement introduit dans les cellules sous la forme d’un seul grand plasmide ou de plusieurs plasmides plus petits qui codent une séquence cible, un guide CRISPR et Cas9.

Préparation par ultrasons de nanoparticules de PLGA chargées d’ADN par nanoprécipitation

Jo et al. (2020) ont utilisé le poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) afin de former un vecteur nanoparticulaire pour l’administration d’un plasmide CRISPR–Cas9 modèle dans des macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse. Pour la nanoprécipitation des nanoparticules de PLGA, du PLGA avec deux groupes terminaux différents (groupes ester et amine) a été utilisé, dans le but que les extrémités amine chargées positivement augmentent l’efficacité d’encapsulation et le taux de charge grâce aux interactions de charge entre celles-ci et le squelette chargé négativement de l’ADN. Dans un tube à centrifuger conique en polypropylène de 50 mL, 100 mg de Pluronic F127 ont été dissous dans 20 mL d’eau désionisée autoclavée par agitation au vortex, suivie de 30 min de sonication douce dans un bain à ultrasons (voir CupHorn). Un barreau d’agitation magnétique autoclavé a été ajouté et la solution a été mélangée à 600 RPM pendant 30 min pendant la préparation des autres solutions. Du matériel de laboratoire en plastique a été utilisé à la place de la verrerie tout au long de l’expérience afin de minimiser l’adsorption non spécifique de l’ADN. Des solutions de PLGA dissous dans du DMF (44,48 mg/ ml) et de pentacène TIPS dissous dans du THF (0,667 mg/ml) ont été préparées séparément. Le PLGA a été laissé au repos pour se mouiller dans le DMF pendant 30 min avant d’être soniqué pendant 30 min. (pour le protocole complet, voir Jo et al., 2020)

Protection de l’ADN plasmidique pendant la sonication

L’ADN, y compris les plasmides et les plasmides superenroulés, est très sensible à la dégradation. Toutes les méthodes de fragmentation disponibles présentent certains inconvénients connus. La fragmentation de l’ADN par ultrasons est l’une des méthodes privilégiées, car une sonication contrôlée combinée à des mesures de protection permet de réduire les dommages aux brins d’ADN induits par le cisaillement et la chaleur.
Outre des réglages d’amplitude faibles, le mode pulsé et la régulation de la température pendant le cisaillement de l’ADN par ultrasons, l’utilisation de certains agents a montré un effet protecteur significatif contre la dégradation de l’ADN. Par exemple, divers polymères, peptides et lipides protègent l’ADN plasmidique pendant l’ultrasonication.

La stabilité de l’ADN plasmidique et des nanocomplexes ADN plasmidique/IL face à la contrainte de cisaillement ultrasonore a été étudiée au moyen d’un test d’électrophorèse sur gel d’agarose. L’ADN plasmidique et les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont tous deux été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonore pendant différentes durées. L’ADN plasmidique a été exposé à la contrainte de cisaillement ultrasonore pendant 0, 10, 20, 30 et 40 minutes. En revanche, les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été exposés à la contrainte de cisaillement ultrasonore pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 minutes.
(étude et image : ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) ont démontré que lorsque les nanostructures ADN plasmidique / liquide ionique (ADNp/IL) étaient soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonore pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min et complexées avec l’agent cationique de transfert de gènes disponible dans le commerce lipofectamine, le pourcentage de cellules positives en fluorescence était respectivement de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% et 50% (voir le graphique ci-dessous). Le pourcentage de cellules positives en fluorescence a augmenté lorsque les nanostructures ont été soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonore pendant 10 et 20 min, puis a diminué lentement.

Influence du liquide ionique [Bmim][PF6] sur l’introduction de l’ADN plasmidique dans les cellules COS7. Des nanocomplexes ADN plasmidique/IL (liquide ionique) ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonore pendant une durée allant jusqu’à 120 minutes et complexés avec LA avant d’être introduits dans des cellules COS7. Les données indiquent le nombre moyen (%) de cellules HeLa positives à la GFP comptées dans 10 champs microscopiques différents, et l’expérience a été réalisée à plusieurs reprises sur trois jours différents. (Étude et graphique : ©Sarker et al., 2019)

Préparation de lysats par ultrasons

Protocole de lyse cellulaire par ultrasons
Commencez par un échantillon enrichi de cellules préparé au moyen d’une méthode de séparation cellulaire (p. ex. séparation cellulaire immunomagnétique, tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), centrifugation en gradient de densité, isolement cellulaire par immunodensité).
Les échantillons cellulaires doivent présenter un volume de tampon de lyse adapté à l’objectif expérimental et à l’ultrasonicateur à sonde.
Les tampons hypotoniques sont privilégiés, car ils améliorent la lyse cellulaire par ultrasons. Il est important d’utiliser les additifs et la concentration en sel de manière appropriée.
Choisissez votre appareil de lyse par ultrasons : pour la sonication indirecte de flacons, le VialTweeter ou le CupHorn sont recommandés. Pour les plaques multipuits, l’UIP400MTP est l’ultrasonicateur idéal. Et pour la sonication classique par sonde, un homogénéisateur à ultrasons tel que l’UP100H ou l’UP200Ht avec une microsonde est le plus adapté.
Protocole pour la sonication par sonde : Placez la sonde de l’ultrasonicateur dans le volume d’échantillon contenu dans un tube de microcentrifugation et soniquez pendant env. 10 secondes. Selon l’échantillon d’ADN, la sonication peut être répétée une ou deux fois de plus. L’apport d’énergie ultrasonore requis (Ws/mL) dépend de la viscosité de l’échantillon et du type d’ADN. Le refroidissement par bain de glace et le mode pulsé de l’ultrasonicateur contribuent à éviter la dégradation thermique de l’échantillon.
Après la lyse par ultrasons, l’échantillon est centrifugé afin de séparer les débris du culot (contenant les cellules non lysées, les noyaux et les organites non lysés)
Si l’échantillon n’est pas traité immédiatement, il peut être conservé à une température appropriée afin de préserver sa viabilité.

Ultrasonicateurs pour la fragmentation de l’ADN

Hielscher Ultrasonics propose diverses plateformes à ultrasons pour la fragmentation de l’ADN, de l’ARN et de la chromatine. Ces différentes plateformes comprennent des sondes à ultrasons (sonotrodes), des solutions de sonication indirecte pour la préparation simultanée d’échantillons dans plusieurs tubes ou plaques multipuits (p. ex. plaques 96 puits, plaques de microtitration), des sonoréacteurs et des cuphorns à ultrasons. Toutes les plateformes de cisaillement de l’ADN sont alimentées par des processeurs à ultrasons haute performance à fréquence accordée, contrôlables avec précision et fournissant des résultats reproductibles.

Processeurs à ultrasons pour tout nombre et toute taille d’échantillons

Avec les ultrasonicateurs multi-échantillons de Hielscher, le VialTweeter (pour jusqu’à 10 tubes à essai) et l’UIP400MTP (pour microplaques/ plaques multipuits), il devient facilement possible de réduire le temps de traitement des échantillons grâce à une ultrasonication intense et contrôlable avec précision, tout en obtenant la distribution de taille des fragments d’ADN et le rendement souhaités. La fragmentation de l’ADN par ultrasons rend les étapes de préparation des plasmides efficaces, fiables et extrapolables. Les protocoles peuvent être transposés linéairement d’un échantillon à de nombreux échantillons en appliquant des paramètres ultrasonores constants.
Les ultrasonicateurs à sonde comportant un à cinq doigts sont idéaux pour la préparation d’un plus petit nombre d’échantillons. Les ultrasonicateurs de laboratoire de Hielscher sont disponibles avec différents niveaux de puissance, afin que vous puissiez choisir le disrupteur à ultrasons idéal pour votre application liée à l’ADN.