L'ultrasonication est une technique fiable pour fragmenter l'ADN plasmidique. L'amplitude précisément contrôlable, le mode de pulsation et le contrôle de la température sont les caractéristiques les plus importantes d'un ultrasoniseur pour une fragmentation non dommageable des plasmides. En outre, l'utilisation de certains agents permet de se protéger contre la dégradation des plasmides. Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la fragmentation contrôlée des plasmides à partir de flacons uniques, la sonication simultanée de nombreux échantillons ainsi que des plaques multi-puits. Apprenez-en plus sur la fragmentation réussie des plasmides par ultrasons !

Cisaillement des plasmides par ultrasonication

Lorsque des échantillons d'ADN sont soumis à des ondes ultrasonores, les vibrations générées par les ultrasons créent une cavitation acoustique dans le liquide qui cisaille ou brise les molécules d'ADN de poids moléculaire élevé par des forces mécaniques. La sonication est la méthode la plus utilisée pour les expériences de cisaillement d'ADN en vrac, y compris pour des applications telles que l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), pour lesquelles la petite taille des fragments est absolument cruciale pour obtenir une haute résolution. (cf. Tseng et al., 2012)
L'ADN plasmidique (ADNp) est une forme spécifique d'ADN, caractérisée par sa forme annulaire, que l'on trouve chez les bactéries et certains eucaryotes.
L'ADNp super enroulé est la forme souhaitée d'ADN plasmidique car il donne les meilleurs résultats dans les processus en aval tels que le séquençage et la transfection automatisés. L'ultrasonication permet de fragmenter l'ADNp, y compris l'ADNp super enroulé, avec succès.
Thompson et al. (2008) ont démontré que la sonication des plasmides, qui est connue pour fragmenter l'ADN super enroulé, est un moyen efficace d'améliorer les longueurs de lecture de la séquence phred20 au point qu'elles ne sont pas significativement différentes de celles du modèle de contrôle de Beckman Coulter ou des plasmides linéarisés par voie enzymatique.

Utilisation de vecteurs plasmides

Les plasmides sont souvent utilisés comme outils pour cloner, transférer et manipuler des gènes. Lorsque les plasmides sont utilisés expérimentalement à ces fins, ils sont appelés vecteurs. Des fragments d'ADN ou des gènes peuvent être insérés dans un vecteur plasmidique, créant ainsi un plasmide dit recombinant. Les vecteurs plasmidiques sont utilisés comme véhicules pour introduire l'ADN recombinant dans une cellule hôte et constituent un élément clé du clonage moléculaire.
“Les vecteurs non viraux font l'objet d'études approfondies pour leur utilisation potentielle en thérapie génique afin de traiter diverses maladies complexes. Les vecteurs non viraux protègent l'ADN plasmidique contre la dégradation physique, chimique et enzymatique et délivrent la molécule d'ADN au site cible. Par exemple, les liposomes cationiques, le chitosan et d'autres nanoparticules chargées positivement forment des complexes avec l'ADN plasmidique par le biais d'interactions électrostatiques. Cependant, les complexes liposomes cationiques/ADN plasmidique facilement formés sont relativement grands (c'est-à-dire 300-400 nm) et hétérogènes par nature, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les applications pharmaceutiques. Les complexes ADN plasmidique/liposomes, ADN plasmidique/aérosols et ADN plasmidique/peptides, grands et hétérogènes, peuvent être réduits en particules plus petites et homogènes par ultrasonication.” (Sarker et al., 2019)
Le système CRISPR-Cas9 est un exemple marquant de l'utilisation des vecteurs plasmidiques. Le système CRISPR-Cas9 est généralement fourni aux cellules sous la forme d'un grand plasmide unique ou de plusieurs petits plasmides qui codent pour une séquence cible, un guide CRISPR et Cas9.

Préparation par ultrasons de nanoparticules de PLGA chargées d'ADN par nanoprécipitation

Jo et al. (2020) ont utilisé du poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) afin de former un support nanoparticulaire pour l'administration d'un plasmide modèle CRISPR-Cas9 dans des macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse. Pour la nanoprécipitation des nanoparticules de PLGA, des PLGA avec deux groupes terminaux différents (groupes ester et amine) ont été utilisés avec l'objectif que les groupes terminaux amine chargés positivement augmentent l'efficacité d'encapsulation et la charge en raison des interactions de charge entre eux et le squelette chargé négativement de l'ADN. Dans un tube conique de centrifugation en polypropylène de 50 mL, 100 mg de Pluronic F127 ont été dissous dans 20 mL d'eau DI autoclavée par mélange vortex suivi de 30 min de sonication douce à l'aide d'un bain à ultrasons (voir CupHorn). Une barre d'agitation magnétique autoclavée a été ajoutée et la solution a été mélangée à 600 RPM pendant 30 minutes pendant que les autres solutions étaient préparées. Du matériel de laboratoire en plastique a été utilisé à la place du matériel en verre afin de minimiser l'adsorption non spécifique de l'ADN. Des solutions de PLGA dissous dans du DMF (44,48 mg/ml) et de pentacène TIPS dissous dans du THF (0,667 mg/ml) ont été faites séparément. La PLGA a été laissée tranquillement mouillée dans le DMF pendant 30 minutes avant d'être soniquée pendant 30 minutes (pour le protocole complet, voir Jo et al., 2020).

Protection de l'ADN plasmidique pendant la sonication

L'ADN, y compris les plasmides et les plasmides super enroulés, est très sensible à la dégradation. Toutes les méthodes de fragmentation disponibles sont connues pour certains inconvénients. La fragmentation de l'ADN par ultrasons est l'une des méthodes préférées car la sonication contrôlée, associée à des mesures de protection, permet de réduire les dommages causés aux brins d'ADN par le cisaillement et la chaleur.
Outre les réglages de faible amplitude, le mode de pulsation et le contrôle de la température pendant le cisaillement de l'ADN par ultrasons, l'utilisation de certains agents a montré un effet protecteur significatif contre la dégradation de l'ADN. Par exemple, divers polymères, peptides et lipides protègent l'ADN plasmidique pendant l'ultrasonication.

La stabilité de l'ADN plasmidique et des nanocomplexes ADN plasmidique/IL contre les contraintes de cisaillement ultrasoniques a été étudiée à l'aide d'un test d'électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN plasmidique et les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant différents temps. L'ADN plasmidique a été exposé à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30 et 40 minutes. En revanche, les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été exposés à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 minutes.
(étude et photo : ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) ont démontré que lorsque les nanostructures ADN plasmidique/liquide ionique (pDNA/IL) étaient soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min et complexées avec l'agent cationique d'administration de gènes disponible dans le commerce, la lipofectamine, le pourcentage de cellules positives fluorescentes était de 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, 65 % et 50 %, respectivement (voir le graphique ci-dessous). Le pourcentage de cellules positives fluorescentes a augmenté lorsque les nanostructures ont été soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 10 et 20 minutes, puis a diminué lentement.

Influence du liquide ionique [Bmim][PF6] sur la délivrance d'ADN plasmidique aux cellules COS7. Les nanocomplexes ADN plasmidique/IL (liquide ionique) ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique jusqu'à 120 minutes et complexés avec LA avant d'être délivrés aux cellules COS7. Les données montrent le nombre moyen (%) de cellules HeLa positives pour la GFP comptées dans 10 champs microscopiques différents. L'expérience a été réalisée plusieurs fois sur trois jours différents. (Étude et graphique : ©Sarker et al., 2019)

Préparation du lysat par ultrasons

Protocole de lyse cellulaire par ultrasons
Commencez par un échantillon enrichi de cellules qui a été préparé par une méthode de séparation cellulaire (par exemple, séparation cellulaire immunomagnétique, tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), centrifugation en gradient de densité, isolement cellulaire par immunodensité).
Les échantillons de cellules doivent présenter un volume de tampon de lyse adapté à l'objectif expérimental et à l'ultrasoniseur de type sonde.
Les tampons hypotoniques sont préférables car ils favorisent la lyse cellulaire par ultrasons. Il est important que les additifs et la concentration en sel soient utilisés de manière appropriée.
Sélectionnez votre appareil de lyse par ultrasons : Pour la sonication indirecte de flacons, le VialTweeter ou le CupHorn sont recommandés. Pour les plaques multi-puits, l'UIP400MTP est l'ultrasoniseur idéal. Pour la sonication classique par sonde, un homogénéisateur à ultrasons comme l'UP100H ou l'UP200Ht avec une micro-pointe est le plus approprié.
Protocole pour la sonication par sonde : Placer la sonde de l'ultrasoniseur dans le volume de l'échantillon dans un tube de microcentrifugation et procéder à la sonication pendant environ 10 secondes. Selon l'échantillon d'ADN, la sonication peut être répétée une ou deux fois de plus. L'énergie ultrasonique requise (Ws/mL) dépend de la viscosité de l'échantillon et du type d'ADN. Le refroidissement par bain de glace et le mode pulsation de l'ultrasoniseur permettent d'éviter la dégradation thermique de l'échantillon.
Après la lyse par ultrasons, l'échantillon est centrifugé pour séparer les débris de pellets (contenant les cellules non lysées, les noyaux et les organites non lysés).
Si l'échantillon n'est pas immédiatement traité, il peut être conservé à une température appropriée pour préserver sa viabilité.

Ultrasons pour la fragmentation de l'ADN

Hielscher Ultrasons propose différentes plateformes basées sur les ultrasons pour la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine. Ces différentes plates-formes comprennent des sondes à ultrasons (sonotrodes), des solutions de sonication indirecte pour la préparation simultanée d'échantillons de plusieurs tubes ou plaques à puits multiples (par exemple, plaques à 96 puits, plaques de microtitration), des sonoréacteurs et des cuphons à ultrasons. Toutes les plates-formes de cisaillement de l'ADN sont alimentées par des processeurs ultrasoniques haute performance, accordés en fréquence, qui sont contrôlables avec précision et donnent des résultats reproductibles.

Processeurs ultrasoniques pour tout nombre et toute taille d'échantillon

Avec les ultrasons multi-échantillons VialTweeter (pour jusqu'à 10 tubes à essai) et UIP400MTP (pour les microplaques/plaques multipuits) de Hielscher, il devient facilement possible de réduire le temps de traitement des échantillons grâce à une ultrasonication intense et précisément contrôlable, tout en obtenant la distribution de taille des fragments d'ADN et le rendement souhaités. La fragmentation ultrasonique de l'ADN rend les étapes de préparation des plasmides efficaces, fiables et évolutives. Les protocoles peuvent être échelonnés linéairement d'un à plusieurs échantillons en appliquant des paramètres ultrasonores constants.
Les ultrasons à sonde de un à cinq doigts sont idéaux pour la préparation de petits nombres d'échantillons. Les ultrasons de laboratoire de Hielscher sont disponibles avec différents niveaux de puissance afin que vous puissiez choisir le broyeur à ultrasons idéal pour votre application liée à l'ADN.