Préparation des plasmides par ultrasonication

L'ultrasonication est une technique fiable pour fragmenter l'ADN plasmidique. L'amplitude précisément contrôlable, le mode de pulsation et le contrôle de la température sont les caractéristiques les plus importantes d'un ultrasoniseur pour une fragmentation non dommageable des plasmides. En outre, l'utilisation de certains agents permet de se protéger contre la dégradation des plasmides. Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la fragmentation contrôlée des plasmides à partir de flacons uniques, la sonication simultanée de nombreux échantillons ainsi que des plaques multi-puits. Apprenez-en plus sur la fragmentation réussie des plasmides par ultrasons !

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La fragmentation de l'ADN par ultrasons est une technique fiable et efficace couramment utilisée pour le séquençage de nouvelle génération (NGS).

L'UIP400MTP permet de contrôler précisément l'ultrasonication de plaques multi-puits. L'une des applications de l'UIP400MTP est la fragmentation de l'ADN plasmidique afin d'obtenir des fragments d'une longueur spécifiquement ciblée.

Cisaillement des plasmides par ultrasonication

Lorsque des échantillons d'ADN sont soumis à des ondes ultrasonores, les vibrations générées par les ultrasons créent une cavitation acoustique dans le liquide qui cisaille ou brise les molécules d'ADN de poids moléculaire élevé par des forces mécaniques. La sonication est la méthode la plus utilisée pour les expériences de cisaillement d'ADN en vrac, y compris pour des applications telles que l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), pour lesquelles la petite taille des fragments est absolument cruciale pour obtenir une haute résolution. (cf. Tseng et al., 2012)
L'ADN plasmidique (ADNp) est une forme spécifique d'ADN, caractérisée par sa forme annulaire, que l'on trouve chez les bactéries et certains eucaryotes.
L'ADNp super enroulé est la forme souhaitée d'ADN plasmidique car il donne les meilleurs résultats dans les processus en aval tels que le séquençage et la transfection automatisés. L'ultrasonication permet de fragmenter l'ADNp, y compris l'ADNp super enroulé, avec succès.
Thompson et al. (2008) ont démontré que la sonication des plasmides, qui est connue pour fragmenter l'ADN super enroulé, est un moyen efficace d'améliorer les longueurs de lecture de la séquence phred20 au point qu'elles ne sont pas significativement différentes de celles du modèle de contrôle de Beckman Coulter ou des plasmides linéarisés par voie enzymatique.

Avantages de la fragmentation ultrasonique de l'ADN

  • Réglable avec précision
  • Résultats reproductibles
  • Ajustable aux longueurs des fragments d'ADN cibles
  • contrôle de la température
  • Extensible à toute taille d'échantillon
La vidéo montre le système de préparation d'échantillons par ultrasons UIP400MTP, qui permet la préparation fiable d'échantillons sur n'importe quelle plaque multi-puits standard en utilisant des ultrasons de haute intensité. Les applications typiques de l'UIP400MTP comprennent la lyse cellulaire, le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine ainsi que l'extraction de protéines.

Ultrasonateur UIP400MTP pour la sonication de plaques multi-puits

Utilisation de vecteurs plasmides

Les plasmides sont souvent utilisés comme outils pour cloner, transférer et manipuler des gènes. Lorsque les plasmides sont utilisés expérimentalement à ces fins, ils sont appelés vecteurs. Des fragments d'ADN ou des gènes peuvent être insérés dans un vecteur plasmidique, créant ainsi un plasmide dit recombinant. Les vecteurs plasmidiques sont utilisés comme véhicules pour introduire l'ADN recombinant dans une cellule hôte et constituent un élément clé du clonage moléculaire.
“Les vecteurs non viraux font l'objet d'études approfondies pour leur utilisation potentielle en thérapie génique afin de traiter diverses maladies complexes. Les vecteurs non viraux protègent l'ADN plasmidique contre la dégradation physique, chimique et enzymatique et délivrent la molécule d'ADN au site cible. Par exemple, les liposomes cationiques, le chitosan et d'autres nanoparticules chargées positivement forment des complexes avec l'ADN plasmidique par le biais d'interactions électrostatiques. Cependant, les complexes liposomes cationiques/ADN plasmidique facilement formés sont relativement grands (c'est-à-dire 300-400 nm) et hétérogènes par nature, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les applications pharmaceutiques. Les complexes ADN plasmidique/liposomes, ADN plasmidique/aérosols et ADN plasmidique/peptides, grands et hétérogènes, peuvent être réduits en particules plus petites et homogènes par ultrasonication.” (Sarker et al., 2019)
Le système CRISPR-Cas9 est un exemple marquant de l'utilisation des vecteurs plasmidiques. Le système CRISPR-Cas9 est généralement fourni aux cellules sous la forme d'un grand plasmide unique ou de plusieurs petits plasmides qui codent pour une séquence cible, un guide CRISPR et Cas9.

Préparation par ultrasons de nanoparticules de PLGA chargées d'ADN par nanoprécipitation

Jo et al. (2020) ont utilisé du poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) afin de former un support nanoparticulaire pour l'administration d'un plasmide modèle CRISPR-Cas9 dans des macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse. Pour la nanoprécipitation des nanoparticules de PLGA, des PLGA avec deux groupes terminaux différents (groupes ester et amine) ont été utilisés avec l'objectif que les groupes terminaux amine chargés positivement augmentent l'efficacité d'encapsulation et la charge en raison des interactions de charge entre eux et le squelette chargé négativement de l'ADN. Dans un tube conique de centrifugation en polypropylène de 50 mL, 100 mg de Pluronic F127 ont été dissous dans 20 mL d'eau DI autoclavée par mélange vortex suivi de 30 min de sonication douce à l'aide d'un bain à ultrasons (voir CupHorn). Une barre d'agitation magnétique autoclavée a été ajoutée et la solution a été mélangée à 600 RPM pendant 30 minutes pendant que les autres solutions étaient préparées. Du matériel de laboratoire en plastique a été utilisé à la place du matériel en verre afin de minimiser l'adsorption non spécifique de l'ADN. Des solutions de PLGA dissous dans du DMF (44,48 mg/ml) et de pentacène TIPS dissous dans du THF (0,667 mg/ml) ont été faites séparément. La PLGA a été laissée tranquillement mouillée dans le DMF pendant 30 minutes avant d'être soniquée pendant 30 minutes (pour le protocole complet, voir Jo et al., 2020).

Applications connexes :

  • Extraction de l'ADN
  • Encapsulation de l'ADN
  • Dispersion d'ADN enrobé de nanoparticules
  • Livraison d'ADN plasmidique dans les cellules
UP200St TD_CupHorn pour la sonication indirecte des échantillons

Le CupHorn UP200St pour la sonication indirecte des échantillons, par exemple pour l'extraction et la fragmentation de l'ADN.

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Protection de l'ADN plasmidique pendant la sonication

L'ADN, y compris les plasmides et les plasmides super enroulés, est très sensible à la dégradation. Toutes les méthodes de fragmentation disponibles sont connues pour certains inconvénients. La fragmentation de l'ADN par ultrasons est l'une des méthodes préférées car la sonication contrôlée, associée à des mesures de protection, permet de réduire les dommages causés aux brins d'ADN par le cisaillement et la chaleur.
Outre les réglages de faible amplitude, le mode de pulsation et le contrôle de la température pendant le cisaillement de l'ADN par ultrasons, l'utilisation de certains agents a montré un effet protecteur significatif contre la dégradation de l'ADN. Par exemple, divers polymères, peptides et lipides protègent l'ADN plasmidique pendant l'ultrasonication.

Les liquides ioniques peuvent protéger l'ADN plasmidique contre les dommages causés par la sonication.

La stabilité de l'ADN plasmidique et des nanocomplexes ADN plasmidique/IL contre les contraintes de cisaillement ultrasoniques a été étudiée à l'aide d'un test d'électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN plasmidique et les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant différents temps. L'ADN plasmidique a été exposé à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30 et 40 minutes. En revanche, les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été exposés à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 minutes.
(étude et photo : ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) ont démontré que lorsque les nanostructures ADN plasmidique/liquide ionique (pDNA/IL) étaient soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min et complexées avec l'agent cationique d'administration de gènes disponible dans le commerce, la lipofectamine, le pourcentage de cellules positives fluorescentes était de 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, 65 % et 50 %, respectivement (voir le graphique ci-dessous). Le pourcentage de cellules positives fluorescentes a augmenté lorsque les nanostructures ont été soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 10 et 20 minutes, puis a diminué lentement.

Fragmentation ultrasonique de l'ADN plasmidique

Influence du liquide ionique [Bmim][PF6] sur la délivrance d'ADN plasmidique aux cellules COS7. Les nanocomplexes ADN plasmidique/IL (liquide ionique) ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique jusqu'à 120 minutes et complexés avec LA avant d'être délivrés aux cellules COS7. Les données montrent le nombre moyen (%) de cellules HeLa positives pour la GFP comptées dans 10 champs microscopiques différents. L'expérience a été réalisée plusieurs fois sur trois jours différents. (Étude et graphique : ©Sarker et al., 2019)

L'ADN plasmidique peut être protégé en ajoutant un agent avant la fragmentation par ultrasons.

L'ADN plasmidique peut être protégé en ajoutant un agent avant la fragmentation par ultrasons : Dégradation induite par ultrasons de l'ADNp nu (A) et de l'ADNp formulé avec 1,5 mM de CaCl2 et 20 % (v/v) de t-butanol (B).
Les échantillons ont été soniqués avec une sonde de 20W pendant un maximum de 120s, comme indiqué en haut de chaque voie. Le couloir H correspond au marqueur Hyperladder I ™️. Les bandes des plasmides OC et SC sont indiquées.
(étude et photos : ©Wu et al., 2009)

Préparation du lysat par ultrasons

Protocole de lyse cellulaire par ultrasons
Ultrasonicator UP200Ht avec micropointe S26d2 pour la lyse ultrasonique des échantillons biologiquesCommencez par un échantillon enrichi de cellules qui a été préparé par une méthode de séparation cellulaire (par exemple, séparation cellulaire immunomagnétique, tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), centrifugation en gradient de densité, isolement cellulaire par immunodensité).
Les échantillons de cellules doivent présenter un volume de tampon de lyse adapté à l'objectif expérimental et à l'ultrasoniseur de type sonde.
Les tampons hypotoniques sont préférables car ils favorisent la lyse cellulaire par ultrasons. Il est important que les additifs et la concentration en sel soient utilisés de manière appropriée.
Sélectionnez votre appareil de lyse par ultrasons : Pour la sonication indirecte de flacons, le VialTweeter ou le CupHorn sont recommandés. Pour les plaques multi-puits, l'UIP400MTP est l'ultrasoniseur idéal. Pour la sonication classique par sonde, un homogénéisateur à ultrasons comme l'UP100H ou l'UP200Ht avec une micro-pointe est le plus approprié.
Protocole pour la sonication par sonde : Placer la sonde de l'ultrasoniseur dans le volume de l'échantillon dans un tube de microcentrifugation et procéder à la sonication pendant environ 10 secondes. Selon l'échantillon d'ADN, la sonication peut être répétée une ou deux fois de plus. L'énergie ultrasonique requise (Ws/mL) dépend de la viscosité de l'échantillon et du type d'ADN. Le refroidissement par bain de glace et le mode pulsation de l'ultrasoniseur permettent d'éviter la dégradation thermique de l'échantillon.
Après la lyse par ultrasons, l'échantillon est centrifugé pour séparer les débris de pellets (contenant les cellules non lysées, les noyaux et les organites non lysés).
Si l'échantillon n'est pas immédiatement traité, il peut être conservé à une température appropriée pour préserver sa viabilité.

Ultrasons pour la fragmentation de l'ADN

Hielscher Ultrasons propose différentes plateformes basées sur les ultrasons pour la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine. Ces différentes plates-formes comprennent des sondes à ultrasons (sonotrodes), des solutions de sonication indirecte pour la préparation simultanée d'échantillons de plusieurs tubes ou plaques à puits multiples (par exemple, plaques à 96 puits, plaques de microtitration), des sonoréacteurs et des cuphons à ultrasons. Toutes les plates-formes de cisaillement de l'ADN sont alimentées par des processeurs ultrasoniques haute performance, accordés en fréquence, qui sont contrôlables avec précision et donnent des résultats reproductibles.

Processeurs ultrasoniques pour tout nombre et toute taille d'échantillon

Avec les ultrasons multi-échantillons VialTweeter (pour jusqu'à 10 tubes à essai) et UIP400MTP (pour les microplaques/plaques multipuits) de Hielscher, il devient facilement possible de réduire le temps de traitement des échantillons grâce à une ultrasonication intense et précisément contrôlable, tout en obtenant la distribution de taille des fragments d'ADN et le rendement souhaités. La fragmentation ultrasonique de l'ADN rend les étapes de préparation des plasmides efficaces, fiables et évolutives. Les protocoles peuvent être échelonnés linéairement d'un à plusieurs échantillons en appliquant des paramètres ultrasonores constants.
Les ultrasons à sonde de un à cinq doigts sont idéaux pour la préparation de petits nombres d'échantillons. Les ultrasons de laboratoire de Hielscher sont disponibles avec différents niveaux de puissance afin que vous puissiez choisir le broyeur à ultrasons idéal pour votre application liée à l'ADN.

Le VialTweeter est un ultrasoniseur multi-échantillons qui permet une préparation fiable des échantillons dans des conditions de température précisément contrôlées.

L'unité de préparation multi-échantillons par ultrasons VialTweeter permet la sonication simultanée de 10 flacons maximum. Avec le dispositif de fixation VialPress, il est possible de presser jusqu'à 4 tubes supplémentaires vers l'avant pour une sonication intense.

le contrôle des processus précis

Les ultrasons Hielscher peuvent être contrôlés à distance par le biais d'un navigateur. Les paramètres de sonication peuvent être surveillés et ajustés précisément aux exigences du processus.Les paramètres de sonication contrôlables avec précision sont cruciaux car une sonification exhaustive peut détruire l'ADN, l'ARN et la chromatine, mais un cisaillement ultrasonique inadéquat entraîne des fragments d'ADN et de chromatine trop longs. Les ultrasons numériques de Hielscher peuvent être facilement réglés sur des paramètres de sonication précis. Les paramètres de sonication spécifiques peuvent également être enregistrés en tant que paramètres programmés pour une répétition rapide de la même procédure.
Toutes les sonications sont automatiquement protocolées et stockées sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée. Cela permet une documentation précise des essais réalisés et permet de réviser facilement les cycles de sonication.
Grâce à la télécommande par navigateur, tous les ultrasons numériques peuvent être commandés et surveillés via n'importe quel navigateur standard. L'installation d'un logiciel supplémentaire n'est pas nécessaire, car la connexion au réseau local est une installation plug-n-play très simple.

La plus grande convivialité lors de la préparation de l'ADN par ultrasons

Tous les ultrasons Hielscher sont conçus pour fournir des ultrasons de haute performance, tout en étant toujours très conviviaux et faciles à utiliser. Tous les réglages sont bien structurés dans un menu clair, auquel on accède facilement grâce à l'écran tactile coloré ou à la télécommande du navigateur. Le logiciel intelligent, avec ses paramètres programmables et son enregistrement automatique des données, garantit des réglages de sonication optimaux pour des résultats fiables et reproductibles. L'interface de menu claire et facile à utiliser fait des ultrasons Hielscher des appareils conviviaux et efficaces.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons de laboratoire pour la lyse cellulaire et la fragmentation de l'ADN :

lot Volume Débit Appareils recommandés
plaques multi-puits s/o UIP400MTP
flacons, petit bécher s/o cuphorn à ultrasons
jusqu'à 10 flacons s/o VialTweeter
1 à 500 ml 10 à 200 ml / min UP100H
10 à 2000mL 20 à 400 ml / min UP200Ht, UP400St

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Littérature / Références

Qu'il faut savoir

Que sont les plasmides ?
Un plasmide est une petite molécule d'ADN circulaire qui est physiquement séparée de l'ADN chromosomique et se réplique indépendamment. Les plasmides sont souvent associés à des gènes qui contribuent à la survie d'un organisme et lui confèrent des avantages spécifiques, par exemple une résistance aux antibiotiques. Les plasmides se présentent le plus souvent sous la forme de petites molécules d'ADN circulaires à double brin chez les bactéries ; cependant, les plasmides sont parfois présents chez les archées et les organismes eucaryotes. Les plasmides sont des outils importants en biologie moléculaire, en génétique, en biochimie et en sciences de la vie. Connus sous le nom de vecteurs en génie génétique, les plasmides sont utilisés pour répliquer ou exprimer certains gènes. La modification ciblée d'un vecteur est appelée conception du vecteur.

L'analyse GFP dans la recherche cellulaire
La protéine fluorescente verte (GFP) est un marqueur biologique polyvalent permettant de surveiller les processus physiologiques, de visualiser la localisation des protéines et de détecter l'expression transgénique in vivo. La GFP peut être excitée par la ligne laser de 488 nm et est détectée de manière optimale à 510 nm.


Des ultrasons de haute performance ! La gamme de produits Hielscher couvre l'ensemble du spectre, depuis les ultrasons compacts de laboratoire jusqu'aux systèmes ultrasoniques industriels complets, en passant par les unités de paillasse.

Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons de haute performance à partir d'une technologie de pointe. laboratoires à taille industrielle.