Préparation des plasmides par ultrasons

L'ultrasonication est une technique fiable pour fragmenter l'ADN plasmidique. Le contrôle précis de l'amplitude, du mode de pulsation et de la température sont les caractéristiques les plus importantes d'un ultrasonateur pour une fragmentation non dommageable du plasmide. En outre, l'utilisation de certains agents contribue à la protection contre la dégradation du plasmide. Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la fragmentation contrôlée des plasmides à partir de flacons individuels, la sonication simultanée de nombreux échantillons et de plaques multi-puits. En savoir plus sur la fragmentation des plasmides par ultrasons !

Cisaillement des plasmides par ultrasons

Lorsque des échantillons d'ADN sont soumis à des ondes ultrasoniques, les vibrations générées par les ultrasons créent une cavitation acoustique dans le liquide qui cisaille ou casse les molécules d'ADN de poids moléculaire élevé par le biais de forces mécaniques. La sonication est la méthode la plus utilisée pour les expériences de cisaillement de l'ADN en vrac, y compris pour des applications telles que l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), pour lesquelles de petites tailles de fragments sont absolument cruciales pour obtenir une haute résolution. (cf. Tseng et al., 2012)
L'ADN plasmidique (ADNp) est une forme spécifique d'ADN, caractérisée par sa forme en anneau, que l'on trouve dans les bactéries et certains eucaryotes.
L'ADNp super enroulé est la forme souhaitée de l'ADN plasmidique car il donne les meilleurs résultats dans les processus en aval tels que le séquençage et la transfection automatisés. Les ultrasons permettent de fragmenter avec succès l'ADNp, y compris l'ADNp super enroulé.
Thompson et al. (2008) ont démontré que la sonication plasmidique, qui est connue pour fragmenter l’ADN superenroulé, est un moyen efficace d’améliorer les longueurs de lecture de séquence phred20 au point qu’elles ne sont pas significativement différentes du modèle de contrôle de Beckman Coulter ou des plasmides linéarisés enzymatiquement.

Utilisation de vecteurs plasmidiques

Les plasmides sont souvent utilisés comme outils pour cloner, transférer et manipuler des gènes. Lorsque les plasmides sont utilisés expérimentalement à ces fins, ils sont appelés vecteurs. Des fragments d'ADN ou des gènes peuvent être insérés dans un vecteur plasmidique, créant ainsi ce que l'on appelle un plasmide recombinant. Les vecteurs plasmidiques sont utilisés comme véhicules pour introduire de l'ADN recombinant dans une cellule hôte et constituent un élément clé du clonage moléculaire.
“Les vecteurs non viraux font l'objet d'études approfondies en vue de leur utilisation potentielle dans la thérapie génique pour traiter diverses maladies complexes. Les vecteurs non viraux protègent l'ADN plasmidique contre la dégradation physique, chimique et enzymatique et acheminent la molécule d'ADN vers le site cible. Par exemple, les liposomes cationiques, le chitosane et d'autres nanoparticules chargées positivement forment des complexes avec l'ADN plasmidique par le biais d'interactions électrostatiques. Toutefois, les complexes liposomes cationiques/ADN plasmidique facilement formés sont relativement grands (300-400 nm) et hétérogènes par nature, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les applications pharmaceutiques. Les complexes ADN plasmidique/liposomes, ADN plasmidique/aérosols et ADN plasmidique/peptides, volumineux et hétérogènes, peuvent être réduits en particules plus petites et homogènes à l'aide d'ultrasons.” (Sarker et al., 2019)
Un exemple marquant de l'utilisation de vecteurs plasmidiques est le système CRISPR-Cas9. Le système CRISPR-Cas9 est généralement livré aux cellules sous la forme d'un seul grand plasmide ou de plusieurs petits plasmides qui codent une séquence cible, un guide CRISPR et Cas9.

Préparation ultrasonique de nanoparticules de PLGA chargées d'ADN par nanoprécipitation

Jo et al. (2020) ont utilisé du poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) afin de former un vecteur de nanoparticules pour l'administration d'un plasmide CRISPR-Cas9 modèle dans des macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse. Pour la nanoprécipitation des nanoparticules de PLGA, des PLGA avec deux groupes terminaux différents (groupes ester et amine) ont été utilisés, l'objectif étant que les groupes terminaux amine chargés positivement augmentent l'efficacité de l'encapsulation et la charge en raison des interactions de charge entre eux et l'épine dorsale chargée négativement de l'ADN. Dans un tube à centrifuger conique en polypropylène de 50 ml, 100 mg de Pluronic F127 ont été dissous dans 20 ml d'eau distillée autoclavée par mélange au vortex, suivi de 30 minutes de sonication douce à l'aide d'un bain à ultrasons (voir CupHorn). Une barre d'agitation magnétique autoclavée a été ajoutée et la solution a été mélangée à 600 tours/minute pendant 30 minutes pendant que les autres solutions étaient préparées. De la vaisselle en plastique a été utilisée à la place de la vaisselle en verre afin de minimiser l'adsorption non spécifique de l'ADN. Les solutions de PLGA dissous dans le DMF (44,48 mg/ml) et de TIPS pentacène dissous dans le THF (0,667 mg/ml) ont été préparées séparément. Le PLGA a été mouillé au calme dans le DMF pendant 30 minutes avant d'être soniqué pendant 30 minutes (pour le protocole complet, voir Jo et al., 2020).

Protection de l'ADN plasmidique pendant la sonication

L'ADN, y compris les plasmides et les plasmides super enroulés, est très sensible à la dégradation. Toutes les méthodes de fragmentation disponibles présentent certains inconvénients. La fragmentation ultrasonique de l'ADN est l'une des méthodes préférées, car la sonication contrôlée, associée à des mesures de protection, permet de réduire les dommages causés aux brins d'ADN par le cisaillement et la chaleur.
Outre les réglages de faible amplitude, le mode de pulsation et le contrôle de la température pendant le cisaillement ultrasonique de l'ADN, l'utilisation de certains agents a montré un effet protecteur significatif contre la dégradation de l'ADN. Par exemple, divers polymères, peptides et lipides protègent l'ADN plasmidique pendant l'ultrasonication.

La stabilité de l'ADN plasmidique et des nanocomplexes ADN plasmidique/IL contre la contrainte de cisaillement ultrasonique a été étudiée à l'aide d'un test d'électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN plasmidique et les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique à différents moments. L'ADN plasmidique a été exposé à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30 et 40 minutes. En revanche, les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été exposés à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 minutes.(étude et image : ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) ont démontré que lorsque les nanostructures ADN plasmidique? liquide ionique (ADNp/IL) étaient soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min et complexées avec l'agent cationique de délivrance de gènes disponible dans le commerce, la lipofectamine, le pourcentage de cellules positives fluorescentes était de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% et 50%, respectivement (voir le graphique ci-dessous). Le pourcentage de cellules positives fluorescentes a augmenté lorsque les nanostructures ont été soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 10 et 20 minutes, puis a diminué lentement.

Influence du liquide ionique [Bmim][PF6] sur la diffusion de l'ADN plasmidique dans les cellules COS7. Des nanocomplexes ADN plasmidique/IL (liquide ionique) ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 120 minutes et complexés avec LA avant d'être délivrés dans des cellules COS7. Les données montrent le nombre moyen (%) de cellules HeLa positives à la GFP, comptées dans 10 champs microscopiques différents. L'expérience a été réalisée plusieurs fois sur trois jours différents. (Étude et graphique : ©Sarker et al., 2019)

Préparation du lysat par ultrasons

Protocole de lyse cellulaire par ultrasons
Commencez par un échantillon enrichi de cellules qui a été préparé par une méthode de séparation cellulaire (par exemple, séparation cellulaire immunomagnétique, tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), centrifugation en gradient de densité, isolement cellulaire par immunodensité).
Les échantillons de cellules doivent présenter un volume de tampon de lyse adapté à l'objectif expérimental et à l'appareil à ultrasons de type sonde.
Les tampons hypotoniques sont préférables car ils favorisent la lyse cellulaire par ultrasons. Il est important que les additifs et la concentration en sel soient utilisés de manière appropriée.
Sélectionnez votre appareil de lyse ultrasonique : Pour la sonication indirecte des flacons, le VialTweeter ou le CupHorn sont recommandés. Pour les plaques multi-puits, l'UIP400MTP est l'appareil à ultrasons idéal. Pour la sonication classique par sonde, un homogénéisateur à ultrasons comme l'UP100H ou l'UP200Ht avec une micro-pointe est le mieux adapté.
Protocole pour la sonication de type sonde : Placer la sonde de l'ultrasonateur dans le volume d'échantillon d'un tube de microcentrifugeuse et soniquer pendant environ 10 secondes. En fonction de l'échantillon d'ADN, la sonication peut être répétée une ou deux fois. L'énergie ultrasonique requise (Ws/mL) dépend de la viscosité de l'échantillon et du type d'ADN. Le refroidissement par bain de glace et le mode pulsation de l'appareil à ultrasons permettent d'éviter la dégradation thermique de l'échantillon.
Après la lyse ultrasonique, l'échantillon est centrifugé pour séparer les débris du culot (contenant les cellules non lysées, les noyaux et les organites non lysés).
Si l'échantillon n'est pas immédiatement traité, il peut être conservé à une température appropriée pour préserver sa viabilité.

Ultrasons pour la fragmentation de l'ADN

Hielscher Ultrasonics propose différentes plateformes basées sur les ultrasons pour la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine. Ces différentes plateformes comprennent des sondes ultrasoniques (sonotrodes), des solutions de sonication indirecte pour la préparation simultanée d'échantillons dans plusieurs tubes ou plaques à puits multiples (par exemple, plaques à 96 puits, plaques de microtitration), des sonéacteurs et des cuphores ultrasoniques. Toutes les plates-formes de cisaillement de l'ADN sont équipées de processeurs ultrasoniques haute performance à fréquence ajustée, qui sont contrôlables avec précision et donnent des résultats reproductibles.

Processeurs à ultrasons pour tous les nombres et tailles d'échantillons

Avec les ultrasons multi-échantillons VialTweeter (pour jusqu’à 10 tubes à essai) et UIP400MTP (pour microplaques/plaques multipuits), il devient facilement possible de réduire le temps de traitement des échantillons grâce à des ultrasons intenses et contrôlables avec précision, tout en obtenant la distribution de la taille et du rendement souhaités des fragments d’ADN. La fragmentation ultrasonique de l’ADN rend les étapes de préparation des plasmides efficaces, fiables et évolutives. Les protocoles peuvent être mis à l’échelle linéairement d’un à plusieurs échantillons en appliquant des paramètres d’échographie constants.
Les ultrasonisateurs à sonde avec un à cinq doigts sont idéaux pour la préparation de petits nombres d’échantillons. Les ultrasons de laboratoire Hielscher sont disponibles avec différents niveaux de puissance afin que vous puissiez choisir le perturbateur à ultrasons idéal pour votre application liée à l’ADN.