Préparation des plasmides par ultrasons
L'ultrasonication est une technique fiable pour fragmenter l'ADN plasmidique. Le contrôle précis de l'amplitude, du mode de pulsation et de la température sont les caractéristiques les plus importantes d'un ultrasonateur pour une fragmentation non dommageable du plasmide. En outre, l'utilisation de certains agents contribue à la protection contre la dégradation du plasmide. Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la fragmentation contrôlée des plasmides à partir de flacons individuels, la sonication simultanée de nombreux échantillons et de plaques multi-puits. En savoir plus sur la fragmentation des plasmides par ultrasons !

L'UIP400MTP permet de contrôler avec précision l'ultrasonication des plaques multi-puits. L'une des applications de l'UIP400MTP est la fragmentation de l'ADN plasmidique afin d'obtenir des fragments d'une longueur spécifiquement ciblée.
Cisaillement des plasmides par ultrasons
Lorsque des échantillons d'ADN sont soumis à des ondes ultrasoniques, les vibrations générées par les ultrasons créent une cavitation acoustique dans le liquide qui cisaille ou casse les molécules d'ADN de poids moléculaire élevé par le biais de forces mécaniques. La sonication est la méthode la plus utilisée pour les expériences de cisaillement de l'ADN en vrac, y compris pour des applications telles que l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), pour lesquelles de petites tailles de fragments sont absolument cruciales pour obtenir une haute résolution. (cf. Tseng et al., 2012)
L'ADN plasmidique (ADNp) est une forme spécifique d'ADN, caractérisée par sa forme en anneau, que l'on trouve dans les bactéries et certains eucaryotes.
L'ADNp super enroulé est la forme souhaitée de l'ADN plasmidique car il donne les meilleurs résultats dans les processus en aval tels que le séquençage et la transfection automatisés. Les ultrasons permettent de fragmenter avec succès l'ADNp, y compris l'ADNp super enroulé.
Thompson et al. (2008) ont démontré que la sonication plasmidique, qui est connue pour fragmenter l’ADN superenroulé, est un moyen efficace d’améliorer les longueurs de lecture de séquence phred20 au point qu’elles ne sont pas significativement différentes du modèle de contrôle de Beckman Coulter ou des plasmides linéarisés enzymatiquement.
- contrôlable avec précision
- Résultats reproductibles
- Adaptable aux longueurs des fragments d'ADN ciblés
- contrôle de la température
- Extensible à n'importe quelle taille d'échantillon
Utilisation de vecteurs plasmidiques
Les plasmides sont souvent utilisés comme outils pour cloner, transférer et manipuler des gènes. Lorsque les plasmides sont utilisés expérimentalement à ces fins, ils sont appelés vecteurs. Des fragments d'ADN ou des gènes peuvent être insérés dans un vecteur plasmidique, créant ainsi ce que l'on appelle un plasmide recombinant. Les vecteurs plasmidiques sont utilisés comme véhicules pour introduire de l'ADN recombinant dans une cellule hôte et constituent un élément clé du clonage moléculaire.
“Les vecteurs non viraux font l'objet d'études approfondies en vue de leur utilisation potentielle dans la thérapie génique pour traiter diverses maladies complexes. Les vecteurs non viraux protègent l'ADN plasmidique contre la dégradation physique, chimique et enzymatique et acheminent la molécule d'ADN vers le site cible. Par exemple, les liposomes cationiques, le chitosane et d'autres nanoparticules chargées positivement forment des complexes avec l'ADN plasmidique par le biais d'interactions électrostatiques. Toutefois, les complexes liposomes cationiques/ADN plasmidique facilement formés sont relativement grands (300-400 nm) et hétérogènes par nature, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les applications pharmaceutiques. Les complexes ADN plasmidique/liposomes, ADN plasmidique/aérosols et ADN plasmidique/peptides, volumineux et hétérogènes, peuvent être réduits en particules plus petites et homogènes à l'aide d'ultrasons.” (Sarker et al., 2019)
Un exemple marquant de l'utilisation de vecteurs plasmidiques est le système CRISPR-Cas9. Le système CRISPR-Cas9 est généralement livré aux cellules sous la forme d'un seul grand plasmide ou de plusieurs petits plasmides qui codent une séquence cible, un guide CRISPR et Cas9.
Préparation ultrasonique de nanoparticules de PLGA chargées d'ADN par nanoprécipitation
Jo et al. (2020) ont utilisé du poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) afin de former un vecteur de nanoparticules pour l'administration d'un plasmide CRISPR-Cas9 modèle dans des macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse. Pour la nanoprécipitation des nanoparticules de PLGA, des PLGA avec deux groupes terminaux différents (groupes ester et amine) ont été utilisés, l'objectif étant que les groupes terminaux amine chargés positivement augmentent l'efficacité de l'encapsulation et la charge en raison des interactions de charge entre eux et l'épine dorsale chargée négativement de l'ADN. Dans un tube à centrifuger conique en polypropylène de 50 ml, 100 mg de Pluronic F127 ont été dissous dans 20 ml d'eau distillée autoclavée par mélange au vortex, suivi de 30 minutes de sonication douce à l'aide d'un bain à ultrasons (voir CupHorn). Une barre d'agitation magnétique autoclavée a été ajoutée et la solution a été mélangée à 600 tours/minute pendant 30 minutes pendant que les autres solutions étaient préparées. De la vaisselle en plastique a été utilisée à la place de la vaisselle en verre afin de minimiser l'adsorption non spécifique de l'ADN. Les solutions de PLGA dissous dans le DMF (44,48 mg/ml) et de TIPS pentacène dissous dans le THF (0,667 mg/ml) ont été préparées séparément. Le PLGA a été mouillé au calme dans le DMF pendant 30 minutes avant d'être soniqué pendant 30 minutes (pour le protocole complet, voir Jo et al., 2020).
- Extraction de l'ADN
- Encapsulation de l'ADN
- Dispersion de l'ADN enrobé de nanoparticules
- Introduction de l'ADN plasmidique dans les cellules

Le CupHorn UP200St pour la sonication indirecte d'échantillons, par exemple pour l'extraction et la fragmentation de l'ADN.
Protection de l'ADN plasmidique pendant la sonication
L'ADN, y compris les plasmides et les plasmides super enroulés, est très sensible à la dégradation. Toutes les méthodes de fragmentation disponibles présentent certains inconvénients. La fragmentation ultrasonique de l'ADN est l'une des méthodes préférées, car la sonication contrôlée, associée à des mesures de protection, permet de réduire les dommages causés aux brins d'ADN par le cisaillement et la chaleur.
Outre les réglages de faible amplitude, le mode de pulsation et le contrôle de la température pendant le cisaillement ultrasonique de l'ADN, l'utilisation de certains agents a montré un effet protecteur significatif contre la dégradation de l'ADN. Par exemple, divers polymères, peptides et lipides protègent l'ADN plasmidique pendant l'ultrasonication.

La stabilité de l'ADN plasmidique et des nanocomplexes ADN plasmidique/IL contre la contrainte de cisaillement ultrasonique a été étudiée à l'aide d'un test d'électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN plasmidique et les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique à différents moments. L'ADN plasmidique a été exposé à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30 et 40 minutes. En revanche, les nanocomplexes ADN plasmidique/IL ont été exposés à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 minutes.
(étude et image : ©Sarker et al., 2019)
Sarker et al. (2019) ont démontré que lorsque les nanostructures ADN plasmidique? liquide ionique (ADNp/IL) étaient soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min et complexées avec l'agent cationique de délivrance de gènes disponible dans le commerce, la lipofectamine, le pourcentage de cellules positives fluorescentes était de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% et 50%, respectivement (voir le graphique ci-dessous). Le pourcentage de cellules positives fluorescentes a augmenté lorsque les nanostructures ont été soumises à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 10 et 20 minutes, puis a diminué lentement.

Influence du liquide ionique [Bmim][PF6] sur la diffusion de l'ADN plasmidique dans les cellules COS7. Des nanocomplexes ADN plasmidique/IL (liquide ionique) ont été soumis à une contrainte de cisaillement ultrasonique pendant 120 minutes et complexés avec LA avant d'être délivrés dans des cellules COS7. Les données montrent le nombre moyen (%) de cellules HeLa positives à la GFP, comptées dans 10 champs microscopiques différents. L'expérience a été réalisée plusieurs fois sur trois jours différents. (Étude et graphique : ©Sarker et al., 2019)

L'ADN plasmidique peut être protégé en ajoutant un agent avant la fragmentation par ultrasons : Dégradation induite par la sonication de l'ADNp nu (A) et de l'ADNp formulé avec 1,5 mM de CaCl2 et 20 % (v/v) de t-butanol (B).
Les échantillons ont été soniqués avec une sonde de 20 W pendant 120 secondes, comme indiqué en haut de chaque voie. La voie H correspond au marqueur Hyperladder I ™️. Les bandes des plasmides OC et SC sont indiquées.
(étude et photos : ©Wu et al., 2009)
Préparation du lysat par ultrasons
Protocole de lyse cellulaire par ultrasons
Commencez par un échantillon enrichi de cellules qui a été préparé par une méthode de séparation cellulaire (par exemple, séparation cellulaire immunomagnétique, tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), centrifugation en gradient de densité, isolement cellulaire par immunodensité).
Les échantillons de cellules doivent présenter un volume de tampon de lyse adapté à l'objectif expérimental et à l'appareil à ultrasons de type sonde.
Les tampons hypotoniques sont préférables car ils favorisent la lyse cellulaire par ultrasons. Il est important que les additifs et la concentration en sel soient utilisés de manière appropriée.
Sélectionnez votre appareil de lyse ultrasonique : Pour la sonication indirecte des flacons, le VialTweeter ou le CupHorn sont recommandés. Pour les plaques multi-puits, l'UIP400MTP est l'appareil à ultrasons idéal. Pour la sonication classique par sonde, un homogénéisateur à ultrasons comme l'UP100H ou l'UP200Ht avec une micro-pointe est le mieux adapté.
Protocole pour la sonication de type sonde : Placer la sonde de l'ultrasonateur dans le volume d'échantillon d'un tube de microcentrifugeuse et soniquer pendant environ 10 secondes. En fonction de l'échantillon d'ADN, la sonication peut être répétée une ou deux fois. L'énergie ultrasonique requise (Ws/mL) dépend de la viscosité de l'échantillon et du type d'ADN. Le refroidissement par bain de glace et le mode pulsation de l'appareil à ultrasons permettent d'éviter la dégradation thermique de l'échantillon.
Après la lyse ultrasonique, l'échantillon est centrifugé pour séparer les débris du culot (contenant les cellules non lysées, les noyaux et les organites non lysés).
Si l'échantillon n'est pas immédiatement traité, il peut être conservé à une température appropriée pour préserver sa viabilité.
Ultrasons pour la fragmentation de l'ADN
Hielscher Ultrasonics propose différentes plateformes basées sur les ultrasons pour la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine. Ces différentes plateformes comprennent des sondes ultrasoniques (sonotrodes), des solutions de sonication indirecte pour la préparation simultanée d'échantillons dans plusieurs tubes ou plaques à puits multiples (par exemple, plaques à 96 puits, plaques de microtitration), des sonéacteurs et des cuphores ultrasoniques. Toutes les plates-formes de cisaillement de l'ADN sont équipées de processeurs ultrasoniques haute performance à fréquence ajustée, qui sont contrôlables avec précision et donnent des résultats reproductibles.
Processeurs à ultrasons pour tous les nombres et tailles d'échantillons
Avec les ultrasons multi-échantillons VialTweeter (pour jusqu’à 10 tubes à essai) et UIP400MTP (pour microplaques/plaques multipuits), il devient facilement possible de réduire le temps de traitement des échantillons grâce à des ultrasons intenses et contrôlables avec précision, tout en obtenant la distribution de la taille et du rendement souhaités des fragments d’ADN. La fragmentation ultrasonique de l’ADN rend les étapes de préparation des plasmides efficaces, fiables et évolutives. Les protocoles peuvent être mis à l’échelle linéairement d’un à plusieurs échantillons en appliquant des paramètres d’échographie constants.
Les ultrasonisateurs à sonde avec un à cinq doigts sont idéaux pour la préparation de petits nombres d’échantillons. Les ultrasons de laboratoire Hielscher sont disponibles avec différents niveaux de puissance afin que vous puissiez choisir le perturbateur à ultrasons idéal pour votre application liée à l’ADN.

L'unité ultrasonique de préparation d'échantillons multiples VialTweeter permet de sonifier simultanément jusqu'à 10 flacons. Avec le dispositif de serrage VialPress, jusqu'à 4 tubes supplémentaires peuvent être pressés à l'avant pour une sonication intense.
un contrôle précis des processus
Des paramètres de sonication contrôlables avec précision sont cruciaux car une sonification exhaustive peut détruire l’ADN, l’ARN et la chromatine, mais un cisaillement ultrasonore inadéquat entraîne des fragments d’ADN et de chromatine trop longs. Les ultrasons numériques de Hielscher peuvent être facilement réglés sur un paramètre de sonication précis. Des paramètres de sonication spécifiques peuvent également être enregistrés en tant que paramètres programmés pour une répétition rapide de la même procédure.
Toutes les sonications sont automatiquement protocolées et stockées sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée. Cela permet de documenter avec précision les essais réalisés et de réviser facilement les cycles de sonication.
Grâce à la commande à distance par navigateur, tous les ultrasons numériques peuvent être commandés et surveillés à partir de n'importe quel navigateur standard. L'installation d'un logiciel supplémentaire n'est pas nécessaire, car la connexion au réseau local est très simple et prête à l'emploi.
Convivialité maximale lors de la préparation de l'ADN par ultrasons
Tous les ultrasons Hielscher sont conçus pour fournir des ultrasons de haute performance, tout en restant très conviviaux et faciles à utiliser. Tous les réglages sont bien structurés dans un menu clair, facilement accessible via l'écran tactile coloré ou la télécommande du navigateur. Le logiciel intelligent, avec ses réglages programmables et l'enregistrement automatique des données, garantit des réglages de sonication optimaux pour des résultats fiables et reproductibles. L'interface de menu claire et facile à utiliser fait des ultrasons Hielscher des appareils conviviaux et efficaces.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons de laboratoire pour la lyse cellulaire et la fragmentation de l'ADN :
Volume du lot | Débit | Dispositifs recommandés |
---|---|---|
plaques multi-puits | s/o | UIP400MTP |
flacons, petit bécher | s/o | Cornet à ultrasons |
jusqu'à 10 flacons | s/o | VialTweeter |
1 à 500mL | 10 à 200mL/min | UP100H |
10 à 2000mL | 20 à 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
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Littérature? Références
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Qu'il faut savoir
Qu'est-ce qu'un plasmide ?
Un plasmide est une petite molécule d'ADN circulaire qui est physiquement séparée de l'ADN chromosomique et qui se réplique indépendamment. Les plasmides sont souvent associés à des gènes qui contribuent à la survie d'un organisme et lui confèrent des avantages spécifiques, par exemple la résistance aux antibiotiques. Les plasmides se présentent le plus souvent sous la forme de petites molécules d'ADN circulaires à double brin dans les bactéries ; cependant, les plasmides sont parfois présents dans les archées et les organismes eucaryotes. Les plasmides sont des outils importants en biologie moléculaire, en génétique, en biochimie et en sciences de la vie. Connus sous le nom de vecteurs en génie génétique, les plasmides sont utilisés pour répliquer ou exprimer certains gènes. La modification ciblée d'un vecteur est appelée conception du vecteur.
Analyse de la GFP dans la recherche cellulaire
La protéine fluorescente verte (GFP) est un marqueur biologique polyvalent qui permet de suivre les processus physiologiques, de visualiser la localisation des protéines et de détecter l'expression transgénique in vivo. La GFP peut être excitée par la ligne laser 488 nm et est détectée de manière optimale à 510 nm.

Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons très performants à partir de laboratoires à taille industrielle.