Flux de travail protéomique avec digestion de protéines à haut débit

La protéomique est un domaine essentiel pour comprendre les processus et les systèmes biologiques, la digestion des protéines constituant une étape critique de ses flux de travail. Traditionnellement, la digestion des protéines est effectuée en solution à l'aide d'enzymes protéolytiques telles que la trypsine, qui hydrolyse spécifiquement les liaisons peptidiques au niveau des résidus lysine et arginine. Ce processus génère des peptides bien adaptés à l'ionisation et à la fragmentation dans les applications de spectrométrie de masse (MS). Cependant, les méthodes de digestion conventionnelles nécessitent 12 à 24 heures pour être achevées, ce qui crée des goulets d'étranglement importants dans les flux de travail protéomiques.
Les ultrasons offrent une alternative puissante, réduisant considérablement les temps de digestion, qui passent de plusieurs heures à quelques minutes seulement. Associée à des sonicateurs multi-échantillons avancés tels que le Hielscher CupHorn, le VialTweeter et le sonicateur pour plaques à 96 puits UIP400MTP, l'ultrasonication permet d'accélérer la protéomique à haut débit. Ces technologies rationalisent les flux de travail, réduisent le temps de préparation des échantillons et augmentent l'efficacité sans compromettre la reproductibilité ou la qualité des données.

Le rôle de l'énergie ultrasonique dans la digestion des protéines

L'ultrasonication utilise des ondes ultrasonores focalisées pour créer une cavitation - des microbulles localisées qui s'effondrent pour générer des forces de cisaillement intenses. Ce phénomène améliore le transfert de masse, favorise le mélange des enzymes avec les substrats et déplie les structures protéiques, exposant ainsi les sites de clivage aux enzymes protéolytiques telles que la trypsine.
Le résultat ? Une réduction significative du temps de digestion sans compromettre l'efficacité ou la reproductibilité.

Digestion protéolytique renforcée par ultrasons : Méthodologie et résultats

Protocole de digestion accélérée

La digestion assistée par ultrasons combine les enzymes protéolytiques et l'énergie ultrasonique pour accélérer les flux de travail. Par exemple, avec le Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), le processus de digestion se déroule comme suit :

1. Réduction : Les échantillons de protéines (0,5 mg/mL, 20 µL) sont traités avec du DTT (2 µL, 110 mM) dans un tampon de bicarbonate d'ammonium (12,5 mM). La sonication est appliquée à une amplitude de 50 % pendant 5 minutes.
2. Alkylation : Après ajout d'IAA (2 µL, 400 mM), la sonication est répétée dans les mêmes conditions.
3. Digestion : Les échantillons sont dilués et incubés avec des nanoparticules de trypsine immobilisées. Un dernier cycle de sonication (5 minutes) complète la digestion. Les peptides sont séparés, séchés et stockés en vue d'une analyse par spectrométrie de masse.

Cette méthode ultrasonique réduit le temps de préparation total de 12 heures à moins de 30 minutes. Malgré l'accélération du processus, le rendement et la qualité des peptides restent conformes aux méthodes traditionnelles de la nuit.

Efficacité de la digestion ultrasonique des protéines

Études comparatives utilisant les protéomes d'E. coli :

• Identification de la protéine : Les échantillons digérés par ultrasons ont permis d'identifier 777 protéines en 5 minutes, contre 817 en 12 heures. Les identifications de protéines partagées ont dépassé 70 %.
• Reproductibilité : Les analyses répétées ont montré des valeurs de corrélation supérieures à 98 % pour chaque méthode, ce qui démontre la fiabilité.
• Sélectivité : Certaines protéines ont été préférentiellement digérées par chaque méthode, la digestion ultrasonique favorisant 65 protéines et la digestion de nuit 54 protéines. Ces différences nuancées soulignent le potentiel unique de l'ultrasonication pour des applications spécifiques.

Résultats de la quantification des protéines sans étiquette de sept protéines ajoutées dans un E. coli
échantillon. Les protéines suivantes ont été ajoutées à deux niveaux différents, comme indiqué dans la colonne
appelé "Theo Ratio". Le ratio de Théo est le rapport théorique entre les deux niveaux utilisés dans cette étude.
expérience. Sérum-albumine bovine (ALBU), β-lactoglobuline (LACB), α-caséine S1 (CASA1),
Caséine α-S2 (CASA2), cytochrome c (CYC), ovalbumine (OVAL) et anhydrase carbonique 2
(CAH2). Les rapports ont été calculés en utilisant les intensités des protéines LFQ obtenues à partir de MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Étude et graphique : © Martins et al., 2019)

Trypsine mobilisée par des nanoparticules

L'intégration de nanoparticules de trypsine immobilisées (par exemple, les T-FMNP) à l'ultrasonisation améliore encore les flux de travail en protéomique. Ces nanoparticules offrent une surface élevée pour les interactions enzyme-substrat, ce qui augmente l'efficacité. Appliquée à des protéomes complexes, tels que E. coli, la méthode combinée permet d'atteindre les objectifs suivants

• Vitesse : Digestion complète en 5 minutes.
• Précision : Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Évolutivité : L'adaptation à des plateformes multi-puits comme l'UIP400MTP permet un traitement à haut débit.

Cliquez ici pour obtenir le protocole détaillé avec des instructions étape par étape !
(cf. Martins et al., 2019)

Digestion protéolytique à grande vitesse et à haut débit avec les sonicateurs Hielscher

Les meilleurs modèles de sonicateurs pour la protéomique

Hielscher Ultrasonics propose différents modèles de sonicateurs pour la préparation simultanée de plusieurs échantillons, ce qui facilite les flux de travail à haut débit. Que vous travailliez avec des flacons, des tubes à essai, des plaques multi-puits (par exemple des plaques à 6, 24 ou 96 puits) ou des boîtes de Pétri, les sonicateurs de Hielscher Ultrasonics vous permettent de préparer simultanément plusieurs échantillons. – nous vous proposons les sonicateurs idéaux pour vos expériences.

Sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP

Pour un débit optimal, l'UIP400MTP permet de traiter des plaques à 96 puits par ultrasons. Compatible avec n'importe quelle microplaque standard, l'UIP400MTP ne nécessite pas de produits jetables propriétaires coûteux et vous donne la liberté de choisir la plaque multipuits la mieux adaptée à votre recherche. En fournissant une énergie uniforme sur toute la plaque, il permet une réduction, une alkylation et une digestion rapides de jusqu'à 200 protéomes complexes en seulement 1 heure. Ce niveau d'automatisation et d'efficacité est crucial pour la protéomique à haut débit et les applications cliniques. En savoir plus sur le sonicateur pour plaques multipuits !

VialTweeter

Le VialTweeter est conçu pour les laboratoires qui ont besoin de sonifier simultanément jusqu'à 10 flacons ou tubes à essai. Son approche non invasive élimine les risques de contamination croisée tout en garantissant une digestion reproductible des protéines. Cet appareil est idéal pour les chercheurs travaillant avec des volumes d'échantillons limités ou divers types d'échantillons.
En savoir plus sur le sonicateur multi-tubes VialTweeter !

Hielscher UP200St-CupHorn

Le sonicateur CupHorn est un appareil puissant conçu pour le traitement simultané de plusieurs échantillons dans des récipients hermétiques. Il assure une distribution uniforme de l'énergie ultrasonique et un contrôle précis de la température. La possibilité de traiter jusqu'à cinq échantillons simultanément, associée à sa compatibilité avec les flux de travail réduits, alkylés et digérés, fait du CupHorn un outil fiable pour la protéomique basée sur la MS.
En savoir plus sur le CupHorn SonoReactor !

Protocole étape par étape pour la digestion protéolytique assistée par ultrasons à l'aide de trypsine mobilisée par des nanoparticules

Ce protocole de Martins et al. (2019) est optimisé pour la digestion rapide des protéines en utilisant l'énergie ultrasonique et la trypsine immobilisée par des nanoparticules (T-FMNP). Les étapes décrites garantissent une réduction, une alkylation et une protéolyse efficaces adaptées aux applications de spectrométrie de masse (MS).
Étapes du protocole

1. Réduction des liaisons disulfures
   • Ajouter 2 µl de solution de DTT (110 mM) aux 20 µl d'échantillon de protéine (0,5 mg/ml) dans le tampon AmBic.
   • Placer le tube d'échantillon dans le sonificateur UP200St-CupHorn.
   • Soniquer l'échantillon pendant 2,5 minutes à 50 % d'amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Faire une brève pause pour permettre le refroidissement, puis soniquer pendant 2,5 minutes supplémentaires dans les mêmes conditions.
2. Alkylation des résidus de cystéine réduite
   • Ajouter 2 µl de solution d'IAA (400 mM) à l'échantillon de protéines réduites.
   • Soniquer pendant 2,5 minutes à 50 % d'amplitude pour faciliter l'alkylation.
   • Faire une pause pour le refroidissement, puis soniquer pendant 2,5 minutes supplémentaires.

   Note : Minimiser l'exposition de l'échantillon alkylé à la lumière pour éviter la dégradation de l'IAA.

3. Dilution de l'échantillon
   • Diluer l'échantillon de protéine alkylée à un volume final de 100 µl en utilisant un tampon AmBic 25 mM contenant 4 % d'acétonitrile (v/v).
   • Mélanger soigneusement en pipettant doucement.
4. Digestion protéolytique avec de la trypsine mobilisée par des nanoparticules
   • Ajouter 20 µl de solution de T-FMNP (3 mg/ml) à l'échantillon de protéine dilué.
   • Soniquer le mélange dans le sonificateur pendant 2,5 minutes à 50 % d'amplitude.
   • Faire une pause pour le refroidissement, puis soniquer pendant 2,5 minutes supplémentaires dans les mêmes conditions.
5. Séparation des nanoparticules de trypsine
   • Utiliser un aimant pour séparer les T-FMNP du surnageant contenant les peptides digérés.
   • Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
6. Préparation des peptides pour l'analyse par spectrométrie de masse
   • Sécher le surnageant contenant les peptides dans une centrifugeuse à vide.
   • Conserver les peptides séchés à -20°C jusqu'à l'analyse ultérieure par spectrométrie de masse.