Ultraäänen sovellukset apinarokkoviruksen käsittelyssä

Ultraäänikäsittely on tärkeä käsittelymenetelmä apinarokkoviruksen (MPXV) eristämisessä analyysinäytteistä, viruksen DNA:n fragmentoinnissa sekä apinarokkorokotteiden valmistuksessa. Diagnostiikkaa ja analyysiä (PCR, ELISA jne.) edeltävässä näytteiden valmistelussa ultraäänikäsittelyä käytetään solujen hajottamiseen, jotta apinarokkovirus vapautuu solujen sisältä, ja / tai DNA:n fragmentointiin. Rokotteiden valmistuksessa sovellukset ulottuvat viruspartikkelien / DNA:n valmistelusta kapselointiin lääkeaineen kantajiin ja inokulumien formulointiin.
Alla on yksityiskohtaista tietoa apinarokkovirusnäytteiden valmistelusta ultraäänellä sekä ultraääniavusteisesta MPXV-rokotteiden valmistuksesta.

Tältä sivulta löydät:

• Ultraäänihajotus apinarokkoviruksen eristämiseen
• Apinarokkoviruksen DNA:n fragmentointi ultraäänellä
• Ultraäänen sovellukset MPXV-rokotteiden valmistuksessa

Ultraäänihajotus ja DNA:n fragmentointi ennen polymeraasiketjureaktiota (PCR)

Apinarokkovirusinfektio todetaan nukleiinihappojen monistustestillä (NAAT), jossa reaaliaikaisen tai tavanomaisen polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla havaitaan viruksen DNA:n yksilöllisiä sekvenssejä. Näyte (esim. nenänielun pyyhkäisynäyte tai ihobiopsianäyte) sisältää virusta soluissa.
Analyysiä varten virus on vapautettava soluista ja viruksen DNA on fragmentoitava PCR:ää varten.

Ultraäänihajotus:

Solujen hajotus / lyysi ultraäänellä on luotettava ja tehokas menetelmä virusten eristämiseen solunäytteistä ja siten suositeltavampi tekniikka kuin kemialliset aineet, kuten lysotsyymi, proteinaasi K ja erilaiset detergentit, joita vaihtoehtoisesti käytetään solujen hajottamiseen ja DNA:n vapauttamiseen.
Tällaisten kemiallisten reagenssien käyttö edellyttää kuitenkin aikaa vievää, monivaiheista näytteiden valmistelua ennen PCR-analyysiä, jotta PCR-reaktion estyminen voidaan ehkäistä. Koska PCR:n estäjät vaikuttavat monistuksen tehokkuuteen, pienet vaihtelut poistamatta jääneiden estäjien määrässä voivat johtaa suuriin vaihteluihin PCR-tuotteen monistumisessa (Diaco, 1995).
Ultraäänikäsittelyn etu lyysissä on se, että solurakenteiden täydellinen hajotus ja DNA:n vapautuminen ilman lyysireagensseja ja aikaa vievää näytteiden valmistelua ovat toivottavia. (vrt. Fykse et al., 2003)

DNA:n fragmentointi ultraäänellä:

DNA:n fragmentointi ultraäänellä on yksinkertaista ja luotettavaa, sillä se tuottaa DNA-fragmentteja, joiden pituutta (emäsparit, bp) voidaan säätää. Ultraäänen avulla DNA voidaan tehokkaasti pilkkoa tavoitepituuteen. Ultraääniparametrien tarkka hallinta ja kehittyneet jäähdytysvaihtoehdot estävät DNA:n hajoamisen.
Lue lisää DNA:n fragmentoinnista ultraäänellä!

Ultraäänen sovellukset apinarokkovirusrokotteissa

Apinarokkovirusta vastaan käytettävät rokotteet ovat nykyisin eläviä viruksia sisältäviä rokotteita. Uudet kehitteillä olevat rokotteet saattavat käyttää muita alustoja, kuten DNA-pohjaisia… Sisältää nykyisin muunneltua Vaccinia Ankara -virusta, joka on heikennetty, lisääntymiskyvytön ortopoxvirus. Se sisältää myös Trisiä (tris-aminometaania) ja natriumkloridia. Rokote saattaa sisältää myös pieniä määriä DNA:ta ja proteiinia kanan alkion fibroblastisoluista, joita käytetään rokoteviruksen kasvattamiseen, sekä bentsonaasia ja antibioottiyhdisteitä, kuten gentamisiinia ja siprofloksasiinia.

Ultraäänihomogenointia käytetään eläviä heikennettyjä viruksia sisältävien rokotteiden, DNA-rokotteiden, monivalenttisten DNA-seosten, mRNA-rokotteiden, rekombinanttiproteiinirokotteiden, viruksenkaltaisiin partikkeleihin perustuvien rokotteiden jne. valmistuksessa.

Löydät lisää syvällistä tietoa ultraäänen sovelluksista rokotteiden valmistuksen parantamiseksi!

Menettely apinarokkoviruksen eristämiseen ultraäänellä

Stittelaarin tutkimusryhmä (2005) käytti ultraäänihajotusta apinarokkoviruksen vapauttamiseen kasvatusisännän soluviljelmästä sekä infektoituneista kädellisistä otettujen nielun pyyhkäisynäytteiden soluista.

Apinarokkorokotteen valmistus:

Apinarokkoviruksia kasvatettiin spesifisissä taudinaiheuttajista vapaissa kanan alkion fibroblastisoluissa. Kun virussolususpensiota on inkuboitu 1-2 päivää, se kerätään yhdellä jäädytyssulatuskierroksella ja väkevöidään sentrifugoimalla. Pelletti suspendoitiin uudelleen ja altistettiin useille ultraäänihomogenointikierroksille.

Apinarokkoviruksen eristäminen rokotetuista makakeista:

Näytteet jäädytettiin sulatettiin kolme kertaa ja sonikoitiin ultraääni CupHornissa. Kahta laimennosta (1:10 ja 1:100) kuljetuselatusaineessa, jota täydennettiin 1-prosenttisella sikiön naudan seerumilla, käytettiin Vero-solujen yksikerroksisten kasvien siirrostamiseen kuuden kuopan levyihin. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa inokulaatti poistettiin ja korvattiin elatusaineella, jota täydennettiin 1-prosenttisella naudan sikiöseerumilla. Yksikerroksisia kasveja viljeltiin 5 päivää 37 °C:ssa ja värjättiin kristallivioletilla liuoksella.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Ultraäänilaitteet virusanalyysiin ja rokotteiden valmistukseen

Hielscher Ultrasonicsin laaja tuotevalikoima tarjoaa ihanteellisen ultraäänilaitteen tutkimus- ja analyysilaboratorioihin sekä teolliseen rokotteiden valmistukseen.
Hielscher Ultrasonics on erikoistunut tehokkaiden ultraäänilaitteiden ja ultraäänibioreaktorien suunnitteluun, valmistukseen ja jakeluun tutkimus- ja analyysilaboratorioiden käyttöön sekä teolliseen rokotteiden tuotantoon (esim. rokotteet, vaikuttavat lääkeaineet).
Ultraäänikäsittelyä voidaan käyttää avoimissa astioissa, suljetuissa jatkuvasti sekoitettavissa reaktoreissa ja jatkuvatoimisissa läpivirtausreaktoreissa. Kaikki ultraäänijärjestelmien osat, jotka joutuvat kosketuksiin nestemäisen väliaineen kanssa, on valmistettu ruostumattomasta teräksestä, titaanista tai lasista. Autoklavoitavat osat ja hygienialiittimet varmistavat tuotannon lääketeollisuuden laatuvaatimusten mukaisissa olosuhteissa.
Automaattinen tietojen tallennus: Älykäs ohjelmisto tallentaa ultraäänikäsittelyprosessin parametrit automaattisesti integroituun SD-muistikorttiin. Kaikkien prosessiparametrien tarkka hallinta varmistaa toistettavuuden, tuotannon standardoinnin ja helpottaa lääkevalmisteiden turvallisuusstandardien täyttämistä.
Hielscher Ultrasonicsin ultraääniprosessorit ovat erittäin luotettavia, ja niitä voidaan ohjata tarkasti. Kaikki teolliset ultraäänilaitteet voidaan säätää tuottamaan koko amplitudialue pienistä erittäin suuriin amplitudeihin. Hielscherin ultraäänijärjestelmien kestävyys mahdollistaa 24/7-käytön raskaassa käytössä ja vaativissa ympäristöissä.

Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: