Ultraschall-gestützte Three-Phase Partitioning

• Die Dreiphasen-Verteilung (TPP) ist eine Technik zur Extraktion, Trennung und Reinigung von Bestandteilen, z. B. Lipiden, Enzymen, Polysacchariden und anderen Biomolekülen, aus biologischem Material.
• Die ultraschallunterstützte Dreiphasen-Trennung übertrifft die herkömmliche Dreiphasen-Trennung durch höhere Ausbeute, verbesserte Reinheit und außergewöhnliche Geschwindigkeit.
• Die dreiphasige Ultraschalltrennung ist für kleine und große Volumen geeignet und kann leicht auf die industrielle Produktion skaliert werden.

Ultraschall-Drei-Phasen-Teilung

Dreiphasige Partitionierung

Die Dreiphasen-Verteilung (TPP) ist ein einfaches und effizientes einstufiges Verfahren zur Trennung, Reinigung und Konzentration von Biomolekülen wie Enzymen, Lipiden, Polysacchariden usw. aus komplexen Gemischen.
TPP wird durch die sequentielle Zugabe einer ausreichenden Menge eines Salzes (in der Regel Ammoniumsulfat) und eines organischen Lösungsmittels (hauptsächlich t-butanol/tert-Butanol). Salze wie Ammoniumsulfat werden bei einer bestimmten Sättigung verwendet, um das Protein auszufällen. Ein organisches Lösungsmittel wie t-Butanol zugesetzt, um dreiphasige Schichten zu bilden und niedermolekulare Verbindungen wie Lipide, Phenole und einige Detergenzien zu entfernen. Da t-Butanol hat einen hohen Siedepunkt, ist aber weniger brennbar als Ethanol und Methanol, t-Butanol ist das bevorzugte Lösungsmittel für TPP.
Nach der Behandlung des Rohextrakts und dem Dekantieren trennt sich das Gemisch in drei verschiedene Phasen: das obere Lösungsmittel (t-Butanol)-Phase enthält unpolare Verbindungen, die von der unteren wässrigen Phase (die polare Verbindungen enthält) durch einen Grenzflächenprotein-Niederschlag getrennt werden. Die gewünschten Proteine werden selektiv in die eine Phase und andere verunreinigende Proteine in die andere Phase abgeschieden. Dies führt zu einer teilweisen Reinigung und Konzentration des Proteins. Der Extraktionsprozess ist eine Kombination aus kosmotroper Ausfällung, Aussalzung, isotonischem Co-Lösungsmittel und osmolytischer Ausfällung von Proteinen.

Ultraschall-gestützte Three-Phase Partitioning

Die Sonikation intensiviert den TPP-Prozess erheblich. Die ultraschallunterstützte Dreiphasenpartitionierung wird erfolgreich für die Trennung und Reinigung von Biomolekülen eingesetzt. Ein breites Spektrum von Biomolekülen konnte in kürzerer Zeit effizienter isoliert werden. So wurden beispielsweise Enzyme aus Pflanzen (z. B. Bromelain, Papain, Invertase, Polyphenoloxidase und Trypsininhibitoren), Tieren (z. B. Trypsin, α-Chymotrypsin, Chymosin, Pepsin und Luziferase) und Mikroben (z.z. B. Lipase, α-Amylase, α-Galaktosidase, Serratiopeptidase, Cyclodextrin-Glykosyltransferase und fibrinolytische Enzyme) wurden mittels Ultraschall-TPP gereinigt. Ein zusätzlicher Vorteil der Dreiphasen-Ultraschalltrennung ist die erhöhte Aktivität verschiedener Enzyme, die zu scheinbar höheren Ausbeuten (um ca. 100 %) führt, da sich das gewünschte Enzym oder Protein in der mittleren Schicht zwischen der organischen und der wässrigen Phase ausfällt.
Die Dreiphasen-Ultraschalltrennung kann effektiv bei Rohproben eingesetzt werden und lässt sich leicht aufstocken.

Beispiele für die dreiphasige Ultraschalltrennung (US-TPP)

Ultraschall-TPP für die Extraktion von Astaxanthin

Für die Extraktion von Astaxanthin (AX) ist die kombinierte Behandlung von TPP und Beschallung mit dem Hielscher Sonicator UP400S nicht nur eine einfache und leicht anwendbare, sondern auch eine sehr effiziente Technik zur Isolierung von AX aus der bakteriellen Biomasse von Paracoccus NBRC 101723. Die Betriebsvariablen der Beschallung können optimiert werden, um optimale Extraktionsergebnisse zu erzielen. Die Parameter der Ultraschallbehandlung wie Amplitude, Zeit, Temperatur und Extraktionsgefäß (Größe, Form) sowie die Partikelgröße der Biomasse beeinflussen die Freisetzung von AX aus der Biomasse durch Ultraschall erheblich. Die Ultraschallbehandlung von feuchter Biomasse führt zu besseren Ergebnissen als die Ultraschall-TPP von getrockneter Biomasse für eine schnelle und effiziente Extraktion von AX. Die Ultraschall-TPP führt zu einer 37 % höheren AX-Gewinnung als die herkömmliche Lösungsmittelextraktion. (vgl. Chougle et al. 2013)

Ultraschall-TPP für die Abtrennung von Andrographolid aus Andrographis paniculata

Andrographolid ist ein Labdanditerpenoid, das wegen seiner hohen entzündungshemmenden, antioxidativen, hepatoprotektiven, antikarzinogenen und antidiabetischen Wirkung geschätzt wird. Vergleichende Studien zeigen, dass Ultraschall-TPP nicht nur die Ausbeute an Andrographolid erhöht, sondern auch die antioxidative Aktivität im Vergleich zu herkömmlichem TPP verbessert.

Hochleistungssonicators für die dreiphasige Aufteilung

Hielscher Ultrasonics ist spezialisiert auf die Entwicklung und Herstellung von Hochleistungs-Ultraschallsystemen für die Extraktion sowie für viele andere Verfahren.
Unsere Produktpalette umfasst kleine, leistungsstarke Laborsonicatoren, robuste Tischhomogenisatoren und industrielle Hochleistungs-Ultraschallsysteme. Das vielfältige Zubehör ermöglicht die ideale Anpassung des Ultraschallsystems an Ihre spezifischen Prozessanforderungen. Alle Hielscher-Schallgeräte sind für den 24/7-Betrieb unter Volllast ausgelegt.
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Literatur

• Chougle, J.A: et al. (2013): Ultraschallunterstützte Dreiphasenpartitionierung (UATPP): Eine neuartige Technik zur Extraktion von Astaxanthin aus Paracoccus NBRC 101723. CSBE/SCGAB 2013 – Jahreskonferenz der Universität von Saskatchewan, Saskatoon, 7-10. Juli 2013.
• Ketnawa, S. et al (2017): Phase Partitioning for Enzyme Separation: An overview and recent applications. International Food Research Journal 24(1), 2017. 1-24.
• Varakumar, S. et al. (2017): Verbesserte Extraktion von Oleoresin aus Ingwer (Zingiber officinale) Rhizom-Pulver durch enzymunterstützte Dreiphasenpartitionierung. Food Chemistry 216, 2017. 27-36.
• Yan J.-K. et al. (2018): Ultraschall synergiert mit Drei-Phasen-Verteilung für die Extraktion und Trennung von Corbicula fluminea Polysacchariden und mögliche relevante Mechanismen. Ultrasonics Sonochemistry Vol. 40, Part A, 2018. 128-134.