Hielscher Ultralydsteknologi

Sonikering lysis: Celleforstyrrelse & Udvinding

Celledisintegration eller lysis er en fælles del af daglig prøvepræparation i biotek laboratorier. Målet med lysis er at forstyrre dele af cellevæggen eller den komplette celle for at frigøre biologiske molekyler. Det såkaldte lysat kan bestå i fx plasmid, receptorassays, proteiner, DNA, RNA osv. Følgende trin i lysis er fraktionering, organelisolering eller / og proteinekstraktion og oprensning. Det ekstraherede materiale (= lysat) skal adskilles og underkastes yderligere undersøgelser eller anvendelser, fx til proteomisk forskning. Ultralyd homogenisatorer er et fælles redskab til succesfuld cellelys. Da ultralydintensiteten kan udjævnes ved at justere procesparametrene, kan den optimale lydstyrkeintensitet fra meget blød til meget hård indstilles individuelt for hvert stof og medium for at opfylde det specifikke applikationskrav.

cellestruktur

Celler er beskyttet af en semipermeabel plasmamembran, som består i et phosphopeptid lipiddobbeltlag (også protein-lipid-dobbeltlag; dannet af hydrofobe lipider og hydrofile phosphorholdige molekyler med indlejrede proteinmolekyler) og skaber en barriere mellem cellen interiør (cytoplasma) og det ekstracellulære miljø. Planteceller og prokaryote celler er omgivet af en cellevæg. På grund af flere lag tyk cellevæg cellulose, planteceller er sværere at lysere end dyreceller. Cellens indre, såsom organeller, nucleus, mitochondrion, stabiliseres ved cytoskelettet.
Ved at lysere cellerne, er det formål at ekstrahere og adskillelse af organeller, proteiner, DNA, mRNA eller andre biomolekyler.

Sonikering er almindeligt anvendt til Prøvefremstilling af cellemateriale.

Figur 1:. Ultrasonic ekstraktion fra celler: den mikroskopiske tværsnit (TS) af apikal stilk mynte (Mentha piperita) viser mekanismen af ​​aktioner under ultralydsekstraktion fra celler (forstørrelse 2000x) [ressource: Vilkhu et al. 2011]

Metoder

Der er flere metoder til lysat celler, som kan inddeles i mekaniske og kemiske metoder, som omfatter anvendelse af detergenter eller opløsningsmidler, anvendelse af høje tryk, eller anvendelse af en perlemølle eller en fransk presse. Det mest problematiske ulempe ved disse metoder er den vanskelige kontrol og justering af procesparametre og derved virkning.
De vigtigste ulemper ved almindelige lysismetoder:

Forskellige lysisteknikker

Tabel: Konventionelle metoder til cellelyse har store ulemper

Tværtimod lydbehandling er en meget effektiv og pålidelig værktøj til celle disintegration, der giver mulighed for en komplet kontrol over lydbehandling parametre. Dette sikrer en høj selektivitet af materialer frigivelse og produktrenhed. [Balasundaram et al. 2009] Den er velegnet til alle celletyper og let anvendelig i stor og lille skala. Ultrasonicators er nemme at rengøre. En ultrasonisk homogenisator altid indeholder clean-in-place (CIP) og sterilisere-in-sted (SIP) funktion. Sonotroden består i en massiv titanhorn som kan tørres eller skylles i vand eller opløsningsmiddel (afhængigt af arbejdsmediet). Vedligeholdelsen af ​​ultrasonicators skyldes deres robusthed næsten ubetydelig.

Lysering

Lysis er en følsom proces. Under lysis beskyttelse af cellemembranen ødelægges imidlertid inaktivering, denaturering og nedbrydning af de ekstraherede proteiner ved en ufysiologisk miljø (afvigelse fra pH-værdi) må forhindres. Derfor generelt lysis udføres i en pufferopløsning. De fleste vanskeligheder skyldes ukontrolleret cellesprængning resulterer i en ikke-målrettede frigivelse af alle intracellulære materiale og / eller denaturering af målproduktet.

Ultralyds cellelysis kan anvendes til prøveforberedelse i laboratoriet og til fremstilling af store mængder. Klik for at forstørre!

Figur 1:. 200 watt kraftfuld ultralydshomogenisator Uf200 ः t med digital styring og automatisk registrering af data for pålidelig og reproducerbar cellelysis.

ultralyd lysis

Generelt vil lysisningen af ​​prøver i laboratoriet tage mellem 15 sekunder og 2 minutter. Da intensiteten af ​​sonikering er meget nem at justere ved amplitudeindstilling af en sonikeringstid såvel som ved at vælge det rigtige udstyr, er det muligt at forstyrre cellemembrene meget blidt eller meget pludseligt afhængigt af cellestrukturen og formålet med lysis ( fx DNA-ekstraktion kræver blødere lydbehandling, fuldstændig proteinekstraktion af bakterier kræver en mere intens ultralydsbehandling). Temperaturen under processen kan overvåges af en integreret temperatursensor og kan let styres ved afkøling (isbad eller flowceller med kølejakker) eller ved sonikering i pulserende tilstand. Under pulsmodus-sonikation tillader korte sonikationsbrudcykler med 1-15 sekunders varighed varmeafledning og afkøling i de længere periodiske perioder.
Alle ultralyd-drevne processer er helt reproducerbar og lineært skalerbar.

Ultralydshomogenisator VialTweeter til samtidig prøveforberedelse af op til 10 reagensglas. (Klik for større billede!)

Den ultrasoniske anordning VialTweeter muliggør samtidig prøveforberedelse på op til 10 hætteglas under samme procesbetingelser.

Ultrasonic Homogenisatorer

Forskellige typer af Ultralydsenheder give mulighed for at matche prøveforberedelse mål og for at sikre brugervenlighed og drift komfort. Probe-typen ultrasonicators er de mest almindelige enheder i laboratoriet. De er mest egnet til fremstilling af små og mellemstore prøver med volumener 0,1 ml op til 1000 ml. Forskellige power størrelser og sonotrodes tillader at tilpasse ultralydsapparat til prøvevolumenet og beholderen for mest effektive sonikerende resultater. Ultralydssonden anordning er det bedste valg, når enkelte prøver skal være forberedt.

Hvis der skal fremstilles flere prøver, fx 8 hætteglas med celleopløsning, er enheder som VialTweeter eller en ultralyd cuphorn den mest egnede homogenisator til lysis. Flere hætteglas sonikeres samtidig med samme intensitet. Dette sparer ikke kun tid, men sikrer også samme behandling af alle prøver, hvilket gør resultaterne mellem prøverne pålidelige og sammenlignelige. Endvidere undgås krydsforurening ved at nedsænke ultralydssonotroden (også kendt som ultralydssonde, horn, spids eller finger). Da hætteglas anvendes, undgås tidskrævende oprydning og prøvetab som følge af dekantering af skibe.
Ved større mængder, f.eks til kommerciel produktion af celleekstrakter, kontinuerlige ultrasoniske systemer med en flowcelle reaktor er mest egnede. Den kontinuerlige og jævn strøm af det forarbejdede materiale sikrer en jævn lydbehandling. Alle parametre for ultralyds-opløsning kan optimeres og tilpasses til kravene i ansøgningen og den specifikke cellematerialet.

Eksemplarisk procedure til ultralyd lysering af bakterieceller:

  • Forberedelse af cellesuspensionen: Cellepellets skal være fuldstændig suspenderet i en pufferopløsning ved homogenisering (vælg din pufferopløsning kompatibelt med følgende analyse, fx specifik kromatografi metode). Tilføje lysozymer og / eller andre additiver, hvis det er nødvendigt (de skal også være kompatibel med separation / oprensningsmetoder). Bland / homogenisere opløsningen forsigtigt under mild sonikering indtil fuldstændig suspension er opnået.
  • Ultrasonic lysis: Prøven anbringes i et isbad. Til cellenedbrydning, sonikeres suspensionen ved 60-90 sekunders (ved hjælp af din ultrasonicator puls mode).
  • (. Fx 10 minutter ved 10.000 x g; på 4degC): separation Centrifuger lysatet. Adskille supernatanten fra pelleten cellen omhyggeligt. Supernatanten er det totale cellelysat. Efter filtrering af supernatanten, opnår en klaret væske af det opløselige celleprotein.

De mest almindelige ansøgninger om ultrasonicators i biologi og bioteknologi er:

  • forberedelse Cell ekstrakt
  • Forstyrrelse af gær, bakterier, planteceller, blød & hård cellevæv, nukleinsyre materiale
  • Protein udvinding
  • Fremstilling og isolering af enzymer
  • Produktion af antigener
  • DNA-ekstraktion og / eller målrettet fragmentering
  • forberedelse Liposome
Høj effekt ultralyd homogenisatorer ligesom UIP1000hd anvendes til cellesprængning og ekstraktion i batch eller kontinuerlig gennemstrømningskammeret mode. (Klik for større billede!)

Ultralyds stationære systemer såsom UIP1000hd (1kW) kan behandle større volumener af biologisk materiale.

De mangfoldige anvendelser af ultralyd grene ud i sektorerne for bioteknologi, bioteknologi, mikrobiologi, molekylær biologi, biokemi, immunologi, bakteriologi, virologi, proteomics, genetik, fysiologi, cellebiologi, hæmatologi, og botanik.

Til evaluering og optimering af kundernes applikationer, Hielscher Ultralyd tilbyder et fuldt udstyret ultralyds driftslaboratorium. Kontakt os venligst for yderligere information!

Litteratur / Referencer

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, D. G. (2009): Fremskridt i strategier og indflydelse på biologisk proces design produkt frigivelse. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. s. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manasse R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery og ændring af fødevareingredienser. In: Feng / Barbosa-Canovas / Weiss (2011): Ultralyd Teknologier til Mad og Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp 345-368..

Kontakt os / bede om flere oplysninger

Tal med os om dine forarbejdning krav. Vi vil anbefale de bedst egnede setup og procesparametre til dit projekt.





Bemærk venligst, at vores Fortrolighedspolitik.