Sonikering til lysis: Celleforstyrrelse og ekstraktion

Celleopløsning eller lysis er en almindelig del af den daglige prøveforberedelse i bioteklaboratorier. Målet med lysis er at forstyrre dele af cellevæggen eller den komplette celle for at frigive biologiske molekyler. Ultralydhomogenisatorer anvendes i vid udstrækning til vellykket cellelyse. Den største fordel ved sofistikerede ultralydapparater er den præcise kontrol over procesparametre som intensitet og temperatur, hvilket giver mulighed for en blid, men alligevel meget effektiv celleforstyrrelse og ekstraktion.

Cellelyse ved hjælp af ultralyd

Ultralydcellelysis og ekstraktion er en metode, der bruges til at bryde åbne celler og ekstrahere indholdet ved hjælp af højfrekvente lydbølger, dvs. ultralyd. Sonikering er en lysisteknik, der i vid udstrækning anvendes som en etableret og pålidelig metode til celleforstyrrelse og ekstraktion af intracellulært materiale. Ultralydlysis er en pålidelig teknik til fremstilling af lysat cindeholdende fx plasmid, receptorassays, proteiner, DNA, RNA osv. Da ultralydintensiteten kan udjævnes ved at justere procesparametrene, kan den optimale sonikeringsintensitet fra meget blød til intens indstilles individuelt for hvert stof og medium for at opfylde specifikke anvendelseskrav. Følgende trin i lysen er fraktionering, organelisolering eller / og proteinekstraktion og oprensning. Det ekstraherede materiale (= lysat) skal adskilles og underkastes yderligere undersøgelser eller anvendelser, f.eks. til proteomisk forskning.

Sammenlignet med andre cellelysis og ekstraktionsmetoder har ultralydcellelyse flere fordele:

1. Fart: Ultralydcellelysis og ekstraktion er en hurtig metode, der kan bryde åbne celler i løbet af få sekunder. Dette er meget hurtigere end andre metoder såsom homogenisering, freez-optøning eller perlefræsning.
2. Effektivitet: Ultralydcellelysis og ekstraktion kan bruges til at behandle små, store eller flere prøver på én gang, hvilket gør det mere effektivt end andre metoder, der kræver individuel behandling af små prøver.
3. Kemikaliefri: Ultralydcellelysis og ekstraktion er en ikke-invasiv metode, der ikke kræver brug af hårde kemikalier eller enzymer. Dette gør den ideel til applikationer, hvor integriteten af celleindholdet skal opretholdes. Uønsket forurening af prøver kan undgås.
4. Højt udbytte: Ultralydcellelysis og ekstraktion kan ekstrahere et højt udbytte af cellulært indhold, herunder DNA, RNA og proteiner. Dette skyldes, at de højfrekvente lydbølger bryder cellevæggene op og frigiver indholdet i den omgivende opløsning.
5. Temperaturregulering: Sofistikerede ultralydapparater giver mulighed for præcis temperaturstyring af prøven. Hielscher digital ultralyd er udstyret med en pluggbar temperatursensor og temperaturovervågningssoftware.
6. Reproducerbare: Protokoller til ultralydcellelysis kan let gengives og endda matches med forskellige større eller mindre prøvevolumener ved en simpel lineær opskalering.
7. Alsidig: Ultralydcellelyse og ekstraktion kan bruges til at ekstrahere en bred vifte af celletyper, herunder bakterier, gær, svampe, plante- og pattedyrceller. Det kan også bruges til at ekstrahere forskellige typer molekyler, herunder proteiner, DNA, RNA og lipider.
8. Samtidig forberedelse af adskillige prøver: Hielscher Ultrasonics tilbyder flere løsninger til komfortabelt at behandle adskillige prøver under nøjagtig de samme procesbetingelser. Dette gør prøveforberedelsestrin med lysis og ekstraktion meget effektiv og tidsbesparende.
9. Let at bruge: Ultralydcellelysis og ekstraktionsudstyr er let at bruge og kræver minimal træning. Udstyret er også økonomisk, da det er en enkelt investering uden krav om genkøb af bortskaffelser. Dette gør det attraktivt for en bred vifte af forskere og laboratorier.

Samlet set er ultralydcellelysis og ekstraktion en hurtig, effektiv, præcist kontrollerbar og alsidig metode til ekstraktion af cellulært indhold. Dens fordele i forhold til alternative metoder gør det til et attraktivt valg til en bred vifte af forsknings- og industrielle applikationer.

Arbejdsprincip for ultralydscellelysis

Ultralydcellelyse og ekstraktion bruger højfrekvente lydbølger til at forstyrre celler og udtrække deres indhold. Lydbølgerne skaber trykændringer i den omgivende væske, hvilket får små bobler til at danne og kollapse i en proces kendt som kavitation. Disse bobler genererer lokaliserede, meget intense mekaniske kræfter, der kan bryde åbne celler og frigive deres indhold i den omgivende opløsning.

Cellelyse ved hjælp af en ultralydator involverer almindeligvis følgende trin:

• Prøven anbringes i et rør eller en beholder med en væskebuffer.
• En ultralydssonde indsættes i prøven, og højfrekvente lydbølger med ca. 20-30 kHz påføres.
• Ultralydbølgerne forårsager svingning og kavitation i den omgivende væske og genererer lokaliserede kræfter, der bryder åbne celler og frigiver deres indhold.
• Prøven centrifugeres eller filtreres for at fjerne eventuelt cellulært affald, og det ekstraherede indhold indsamles til downstream-analyse.

Kraftige ultralydbølger forstyrrer cellematrixen af biologiske strukturer og frigiver de bioaktive forbindelser. Masseoverførslen mellem plantematerialet og opløsningsmidlet (f.eks. buffer) intensiveres. (grafik: ©Vilkhu et al., 2006)

Ulemper ved almindelige lysismetoder

Under dit arbejde i laboratorier har du måske allerede oplevet besværet med cellelyse ved hjælp af traditionelle mekaniske eller kemiske lysisprotokoller.

• Mekanisk lysis: Mekaniske lysismetoder, såsom slibning med mørtel og pistil eller homogenisering ved hjælp af en fransk presse, perlefræser eller rotor-statorsystem, mangler ofte præcice-kontrol- og justeringsmuligheder. Det betyder, at brugen af fræsning og formaling hurtigt kan generere varme- og forskydningskræfter, der kan beskadige prøven og denaturere proteiner. De kan også være tidskrævende og kræve store mængder udgangsmateriale.
• Kemisk lyse: Kemiske lysismetoder, såsom vaskemiddelbaseret lyse, kan beskadige prøven ved at forstyrre lipiddobbeltlaget og denaturere proteiner. De kan også kræve flere trin og kan efterlade resterende forurenende stoffer, der forstyrrer downstream-applikationer. At finde den optimale dosis af vaskemiddel er en yderligere udfordring.
• Fryse-optøningscyklusser: Fryse-optøningscyklusser kan få cellemembraner til at briste, men gentagne cyklusser kan også forårsage proteindenaturering og nedbrydning. Denne metode kan også kræve flere cyklusser, hvilket kan være tidskrævende og ofte resulterer i lavere udbytter.
• Enzymatisk lyse: Enzymatiske lysemetoder kan være specifikke for bestemte celletyper og kræver flere trin, hvilket gør dem tidskrævende. De genererer også affald og kræver omhyggelig optimering for at undgå nedbrydning af prøven. Enzymatiske lysissæt er ofte dyre. Hvis din nuværende enzymatiske lyseprocedure giver utilstrækkelige resultater, kan sonikering som synergistisk metode anvendes til at intensivere celleforstyrrelser.

I modsætning til konventionelle mekaniske og kemiske cellelyseringsmetoder er sonikering et meget effektivt og pålideligt værktøj til celleopløsning, der giver mulighed for en fuldstændig kontrol over sonikeringsparametrene. Dette sikrer en høj selektivitet på materialefrigivelse og produktrenhed. [jf. Balasundaram et al., 2009]
Den er velegnet til alle celletyper og let anvendelig i lille og stor skala – altid under kontrollerede forhold. Ultralydapparater er nemme at rengøre. En ultralyd homogenisator har altid clean-in-place (CIP) og sterilize-in-place (SIP) funktion. Sonotrode består af et massivt titaniumhorn, som kan tørres eller skylles i vand eller opløsningsmiddel (afhængigt af arbejdsmediet). Vedligeholdelsen af ultralydapparater skyldes deres robusthed næsten forsømmelig.

Ultralyd lysis og celleforstyrrelser

Generelt vil lysisningen af ​​prøver i laboratoriet tage mellem 15 sekunder og 2 minutter. Da intensiteten af ​​sonikering er meget nem at justere ved amplitudeindstilling af en sonikeringstid såvel som ved at vælge det rigtige udstyr, er det muligt at forstyrre cellemembrene meget blidt eller meget pludseligt afhængigt af cellestrukturen og formålet med lysis ( fx DNA-ekstraktion kræver blødere lydbehandling, fuldstændig proteinekstraktion af bakterier kræver en mere intens ultralydsbehandling). Temperaturen under processen kan overvåges af en integreret temperatursensor og kan let styres ved afkøling (isbad eller flowceller med kølejakker) eller ved sonikering i pulserende tilstand. Under pulsmodus-sonikation tillader korte sonikationsbrudcykler med 1-15 sekunders varighed varmeafledning og afkøling i de længere periodiske perioder.
Alle ultralyd-drevne processer er helt reproducerbar og lineært skalerbar.

Ultralyd homogenisatorer til cellelyse og ekstraktion

Forskellige typer ultralydsenheder giver mulighed for at matche prøveforberedelsesmålet og for at sikre brugervenlighed og driftskomfort. Sonde-type ultralydapparater er de mest almindelige enheder i laboratoriet. De er mest velegnede til fremstilling af små og mellemstore prøver med volumener på 0,1 ml op til 1000 ml. Forskellige effektstørrelser og sonotroder gør det muligt at tilpasse ultralydatoren til prøvevolumenet og beholderen for de mest effektive sonikeringsresultater. Ultralydsondeenheden er det bedste valg, når enkeltprøver skal forberedes.

Hvis flere prøver skal forberedes, fx 8-10 hætteglas celleopløsning, er en intens indirekte sonikering med ultralydssystemer som VialTweeter eller et ultralyd cuphorn den mest egnede homogeniseringsmetode til en effektiv lysis. Flere hætteglas sonikeres på samme tid med samme intensitet. Dette sparer ikke kun tid, men sikrer også den samme behandling af alle prøver, hvilket gør resultaterne blandt prøverne pålidelige og sammenlignelige. Desuden undgås krydskontaminering ved nedsænkning af ultralydsonotroden (også kendt som ultralydssonde, horn, spids eller finger). Da der anvendes hætteglas individuelt til prøvestørrelse, udelades tidskrævende oprydning og prøvetab på grund af dekantering af kar. Til ensartet sonikering af multiwell eller mikrotiterplader tilbyder Hielscher UIP400MTP.
Ved større mængder, f.eks til kommerciel produktion af celleekstrakter, kontinuerlige ultrasoniske systemer med en flowcelle reaktor er mest egnede. Den kontinuerlige og jævn strøm af det forarbejdede materiale sikrer en jævn lydbehandling. Alle parametre for ultralyds-opløsning kan optimeres og tilpasses til kravene i ansøgningen og den specifikke cellematerialet.
 
 
Eksemplarisk procedure til ultralyd lysering af bakterieceller:

• Forberedelse af cellesuspensionen: Cellepellets skal være fuldstændig suspenderet i en pufferopløsning ved homogenisering (vælg din pufferopløsning kompatibelt med følgende analyse, fx specifik kromatografi metode). Tilføje lysozymer og / eller andre additiver, hvis det er nødvendigt (de skal også være kompatibel med separation / oprensningsmetoder). Bland / homogenisere opløsningen forsigtigt under mild sonikering indtil fuldstændig suspension er opnået.
• Ultrasonic lysis: Prøven anbringes i et isbad. Til cellenedbrydning, sonikeres suspensionen ved 60-90 sekunders (ved hjælp af din ultrasonicator puls mode).
• (. Fx 10 minutter ved 10.000 x g; på 4degC): separation Centrifuger lysatet. Adskille supernatanten fra pelleten cellen omhyggeligt. Supernatanten er det totale cellelysat. Efter filtrering af supernatanten, opnår en klaret væske af det opløselige celleprotein.

 
 
De mest almindelige ansøgninger om ultrasonicators i biologi og bioteknologi er:

• forberedelse Cell ekstrakt
• Forstyrrelse af gær, bakterier, planteceller, blødt eller hårdcellevæv, nukleinmateriale
• Protein udvinding
• Fremstilling og isolering af enzymer
• Produktion af antigener
• DNA-ekstraktion og / eller målrettet fragmentering
• forberedelse Liposome