Desagregação celular por ultrassons de amostras bacterianas

As amostras bacterianas raramente chegam sob a forma de verdadeiras suspensões de células individuais. As culturas crescem em cadeias e flocos, os isolados ambientais formam agregados ligados por substâncias poliméricas extracelulares e os sedimentos centrifugados resistem frequentemente à ressuspensão, apesar de uma agitação exaustiva no vortex. As contagens de células viáveis, a densidade ótica, a citometria de fluxo e a análise do microbioma partem todas do princípio de que uma partícula equivale a uma célula. A desagregação celular por ultrassons resolve esse conflito: breves e controladas rajadas de sonicação separam os agregados em células individuais sem as lisar.

Por que razão a agregação celular compromete os seus resultados

A agregação é uma característica biológica, não um erro de preparação. O Staphylococcus, o Streptococcus, o Lactobacillus, o Actinomyces e muitas espécies ambientais crescem em cadeias, aglomerados ou fragmentos de biofilme, e o ADN extracelular e os polissacarídeos unem as células entre si em sedimentos e eluatos de esfregaços. As consequências analíticas são sistemáticas:

• O número de colónias é subestimado, porque cada aglomerado dá origem a uma colónia, independentemente do número de células que contenha.
• A densidade ótica e os contadores de partículas registam agregados em vez de células, o que distorce as curvas de crescimento.
• A citometria de fluxo e a triagem celular contabilizam incorretamente os eventos aglomerados e excluem-nos da análise.
• As extrações de ADN e proteínas representam apenas as células presentes na superfície do agregado, o que distorce os dados relativos ao microbioma e às ómicas.

Os métodos convencionais são lentos, incompletos ou provocam alterações químicas. A pipetagem vigorosa e a agitação em vortex deixam para trás microagregados. A dispersão enzimática ou à base de quelantes altera a superfície celular que se pretende analisar. A desagregação mecânica por cavitação controlada atua em segundos e não requer aditivos.

Como a sonicação desagrega as células sem as lisar

A desagregação celular por ultrassons aproveita uma diferença na resistência mecânica. Os agregados bacterianos são mantidos unidos por ligações intercelulares relativamente fracas e por uma matriz extracelular, enquanto o envelope celular intacto resiste a um cisalhamento substancialmente mais elevado. À medida que o ultrassom calibrado penetra na suspensão, a cavitação acústica gera microcorrentes, impulsos de pressão e forças de cisalhamento que atuam, em primeiro lugar, nas interfaces dos agregados. Os aglomerados, as cadeias e os fragmentos de biofilme são separados por cisalhamento (desaglomeração) antes de se atingir o nível de energia no qual as membranas se rompem (lise).

Desagregação por ultrassons de aglomerados de células bacterianas

Desagregação ou lise – A importância dos parâmetros de sonicação

A consequência prática é que a desagregação e a lise são o mesmo instrumento operado com parâmetros diferentes. Com amplitude moderada, ciclos de impulsos curtos e temperatura controlada, obtém-se uma suspensão de células individuais viáveis. Ao aumentar a amplitude, o tempo de exposição ou a temperatura da amostra, o processo evolui para a ruptura completa das células, visando alvos intracelulares. Os geradores da Hielscher permitem definir com precisão a amplitude, a potência, o pulso e a entrada de energia, bem como guardar o método, de modo a que a etapa de desagregação seja reprodutível entre amostras, operadores e ciclos de análise.

Sonicação eficiente sem contacto

A sonicação em banho não consegue igualar este controlo. Os banhos e tanques de limpeza por ultrassons fornecem apenas uma energia ultrassónica reduzida, o que resulta numa preparação incompleta, e a cavitação ocorre de forma desigual, pelo que cada tubo é tratado de acordo com a sua posição no banho. O VialTweeter transmite forças ultrassónicas intensas e focadas diretamente através da parede do recipiente para até 10 amostras seladas ao mesmo tempo. Os tratamentos que requerem uma exposição prolongada e variável num banho são concluídos num padrão de impulsos padronizado.
Os sonicadores sem contacto da Hielscher aplicam ultrassons intensos e focados através das paredes de frascos fechados. O VialTweeter processa até 10 frascos simultaneamente com a mesma intensidade, sem sonda na amostra, sem contaminação cruzada e sem libertação de aerossóis. Quando a capacidade de processamento assim o exige, os sonicadores para microplacas UIP400MTP e UIP550MTP estendem a mesma transferência controlada de energia às placas de múltiplos poços.

Vantagens da desagregação ultrassónica sem contacto

• Contaminação cruzada nula: Uma vez que os frascos permanecem permanentemente fechados e nenhuma sonda é imersa na amostra, evita-se completamente a contaminação cruzada e a perda de amostra. Não há nada para esterilizar entre amostras, e uma análise não pode afetar a seguinte.
• Proteção contra aerossóis: A sonicação com sonda aberta gera aerossóis infecciosos e contamina as superfícies dos instrumentos. A sonicação em frascos selados mantém a amostra dentro do próprio tubo, o que é importante no manuseamento de bactérias patogénicas, como o Mycobacterium tuberculosis e outros agentes de nível de segurança biológica 2 (BSL-2) ou 3 (BSL-3).
• Sem perda de gorjeta: As sondas de titânio podem libertar uma pequena quantidade de micropartículas para a amostra durante o funcionamento. Essas partículas alteram a densidade ótica e a contagem de partículas a jusante. A sonicação indireta através da parede do recipiente elimina totalmente esta fonte de sólidos.
• Rendimento uniforme: O VialTweeter fornece a mesma intensidade de ultrassons a cada um dos até 10 frascos, pelo que os resultados da sonicação são uniformes e reprodutíveis. Os efeitos de posicionamento que afetam os banhos de ultrassons e a sondagem de amostras individuais desaparecem, e as suas linhas de base mantêm-se comparáveis entre as réplicas.
• Integridade da amostra: Os tubos permanecem fechados durante todo o processo, pelo que a amostra não pode ser contaminada, deteriorada ou volatilizada. É possível trabalhar com pequenos volumes sem diluição, incluindo sedimentos clínicos valiosos que não admitem uma etapa adicional de transferência.
• Controlo de processos: A amplitude é ajustável entre 20 % e 100 %, o modo de pulso entre 0 % e 100 %, e os sistemas suportam a monitorização da temperatura, para que as estirpes e proteínas termosensíveis se mantenham abaixo dos limiares prejudiciais.

Aplicações típicas

• Análise do microbioma e do conteúdo intestinal: dispersar as bactérias Lactobacillus e Bifidobacterium e as amostras fecais antes da sementeira ou do sequenciamento, para que as contagens não sejam subestimadas devido à formação de aglomerados.
• Microbiologia alimentar e da água: desagregação de flocos em esfregaços, lavagens e caldos de enriquecimento para uma determinação precisa do número de colónias e da viabilidade.
• Investigação sobre biofilmes: recuperação de células a partir de suportes e superfícies sob a forma de suspensões de células únicas, sem tratamento enzimático que possa remover as proteínas da superfície.
• Diagnóstico clínico: ressuspensão de expectoração, pus e eluatos de esfregaços em condições de contenção.
• Cultura celular: separação de agregados de células de mamíferos, insetos e CHO antes da contagem e da passagem.
• Preparação de todo o fluxo de trabalho: o mesmo instrumento que desagrega a baixa amplitude realiza a ruptura completa das células em configurações mais elevadas, pelo que a lise, a extração de proteínas e a fragmentação do ADN decorrem sem transferências entre tubos.

Literatura / Referências