Desagregação celular ultrassónica de amostras bacterianas

As amostras bacterianas raramente chegam como verdadeiras suspensões de células individuais. As culturas crescem em cadeias e flocos, os isolados ambientais formam agregados unidos por substâncias poliméricas extracelulares e os sedimentos obtidos por centrifugação resistem frequentemente à ressuspensão, apesar de uma agitação vigorosa em vórtex. As contagens de células viáveis, a densidade ótica, a citometria de fluxo e a caracterização do microbioma pressupõem todas que uma partícula equivale a uma célula. A desagregação celular ultrassónica resolve esse conflito: impulsos de sonicação curtos e controlados separam os agregados em células individuais sem provocar a sua lise.

Porque é que a agregação celular compromete os seus resultados

A agregação é uma característica biológica, não um erro de preparação. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces e muitas espécies ambientais crescem em cadeias, aglomerados ou fragmentos de biofilme, e o DNA extracelular e os polissacáridos mantêm as células unidas nos sedimentos e nos eluatos de zaragatoas. As consequências analíticas são sistemáticas:

• As contagens de colónias são subestimadas, porque um aglomerado produz uma colónia, independentemente do número de células que contém.
• A densidade ótica e os contadores de partículas registam agregados em vez de células, enviesando as curvas de crescimento.
• A citometria de fluxo e a separação celular contam incorretamente os eventos correspondentes a aglomerados e excluem-nos da análise.
• As extrações de DNA e proteínas representam apenas as células à superfície dos agregados, enviesando os dados do microbioma e das análises ómicas.

As soluções convencionais são lentas, incompletas ou provocam alterações químicas. A pipetagem vigorosa e a agitação em vórtex deixam microagregados por dispersar. A dispersão enzimática ou com agentes quelantes modifica a superfície celular que poderá pretender analisar. A desagregação mecânica por cavitação controlada atua em segundos e não requer aditivos.

Como a sonicação desagrega as células sem provocar a sua lise

A desagregação celular ultrassónica tira partido de uma diferença de resistência mecânica. Os agregados bacterianos são mantidos unidos por ligações intercelulares relativamente fracas e por uma matriz extracelular, enquanto um invólucro celular intacto suporta um cisalhamento substancialmente mais elevado. Quando os ultrassons calibrados entram na suspensão, a cavitação acústica gera microcorrentes, impulsos de pressão e forças de cisalhamento que atuam primeiro nas interfaces dos agregados. Os aglomerados, as cadeias e os fragmentos de biofilme são separados por cisalhamento (desaglomeração) antes de se atingir o nível de energia ao qual as membranas sofrem rutura (lise).

Desagregação ultrassónica de aglomerados de células bacterianas

Desagregação ou lise – a importância dos parâmetros de sonicação

A consequência prática é que a desagregação e a lise são realizadas com o mesmo instrumento, operado com parâmetros diferentes. Com uma amplitude moderada, ciclos pulsados curtos e temperatura controlada, obtém-se uma suspensão viável de células individuais. O aumento da amplitude, do tempo de exposição ou da temperatura da amostra direciona o processo para a rutura celular completa, visando alvos intracelulares. Os geradores Hielscher permitem definir com precisão a amplitude, a potência, os impulsos e a energia fornecida e guardar o método, tornando a etapa de desagregação reprodutível entre amostras, operadores e séries de processamento.

Sonicação eficiente sem contacto

A sonicação em banho não consegue igualar este controlo. Os banhos e tanques de limpeza ultrassónica fornecem apenas uma baixa energia ultrassónica, o que resulta numa preparação incompleta, e a cavitação ocorre de forma desigual, pelo que cada tubo é tratado de acordo com a sua posição no banho. O VialTweeter transmite forças ultrassónicas intensas e focadas diretamente através da parede do recipiente para até 10 amostras seladas em simultâneo. Os tratamentos que requerem uma exposição longa e variável num banho são concluídos com um padrão de impulsos normalizado.
Os sonicadores sem contacto Hielscher aplicam ultrassons intensos e focados através das paredes de frascos fechados. O VialTweeter processa até 10 frascos em simultâneo com intensidade idêntica, sem sonda na amostra, sem contaminação cruzada e sem libertação de aerossóis. Quando a capacidade de processamento o exige, os sonicadores de microplacas UIP400MTP e UIP550MTP estendem a mesma transferência controlada de energia às placas multipoços.

Vantagens da desagregação ultrassónica sem contacto

• Ausência total de contaminação cruzada: Como os frascos permanecem sempre fechados e nenhuma sonda é imersa na amostra, a contaminação cruzada e a perda de amostra são completamente evitadas. Não há nada para esterilizar entre amostras e uma série de processamento não pode afetar a seguinte.
• Proteção contra aerossóis: A sonicação com sonda em recipientes abertos gera aerossóis infeciosos e contamina as superfícies dos instrumentos. A sonicação em frascos selados mantém a amostra dentro do seu próprio tubo, o que é relevante ao manusear bactérias patogénicas como Mycobacterium tuberculosis e outros agentes BSL-2 ou BSL-3.
• Sem erosão da ponta: As sondas de titânio podem libertar uma pequena quantidade de micropartículas para a amostra durante o funcionamento. Essas partículas alteram a densidade ótica e as contagens de partículas nas etapas subsequentes. A sonicação indireta através da parede do recipiente elimina por completo esta fonte de sólidos.
• Processamento uniforme de amostras: O VialTweeter fornece a mesma intensidade de ultrassons a cada um dos até 10 frascos, pelo que os resultados da sonicação são uniformes e reprodutíveis. Os efeitos da posição que afetam os banhos e o tratamento de amostras individuais com sonda desaparecem, e os seus valores de referência mantêm-se comparáveis entre réplicas.
• Integridade da amostra: os tubos permanecem fechados durante todo o processamento, pelo que a amostra não pode ser contaminada, deteriorada ou volatilizada. É possível trabalhar com pequenos volumes sem diluição, incluindo sedimentos clínicos preciosos que não permitem uma etapa adicional de transferência.
• Controlo do processo: A amplitude é ajustável de 20 a 100%, o modo de impulsos de 0 a 100%, e os sistemas permitem monitorizar a temperatura, de modo que as estirpes e as proteínas termossensíveis permaneçam abaixo dos limiares que provocam danos.

Aplicações típicas

• Análise do microbioma e do conteúdo intestinal: dispersão de Lactobacillus, Bifidobacterium e amostras fecais antes do plaqueamento ou da sequenciação, para que os aglomerados não reduzam as contagens.
• Microbiologia alimentar e da água: desagregação de flocos em zaragatoas, líquidos de enxaguamento e caldos de enriquecimento para uma determinação exata de colónias e da viabilidade.
• Investigação de biofilmes: recuperação de células de suportes e superfícies sob a forma de suspensões de células individuais, sem tratamento enzimático que removeria as proteínas de superfície.
• Diagnóstico clínico: ressuspensão de expetoração, pus e eluatos de zaragatoas em condições de contenção.
• Cultura celular: separação de agregados de células de mamíferos, de insetos e CHO antes da contagem e da passagem.
• Preparação ao longo de todo o fluxo de trabalho: o mesmo instrumento que desagrega a baixa amplitude realiza a rutura celular completa com definições mais elevadas, pelo que a lise, a extração de proteínas e a fragmentação de DNA se seguem sem transferências entre tubos.

Bibliografia / Referências

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.