Protocolo de utilização de sonicadores Hielscher para múltiplas amostras na análise de biofilmes e na análise proteómica

A utilização de sonicadores para múltiplas amostras, como o sonicador multitubos VialTweeter e o sonicador de microplacas UIP400MTP, simplifica os fluxos de trabalho laboratoriais em aplicações com elevada capacidade de processamento. Ambos os dispositivos permitem um processamento ultrassónico preciso e uniforme de múltiplas amostras, minimizando a variabilidade e melhorando a reprodutibilidade. Isto é particularmente vantajoso em experiências que exigem lise consistente das amostras, desprendimento de biofilmes, extração de proteínas ou digestão proteolítica, nas quais os métodos manuais ou de processamento de uma única amostra são menos eficientes e propensos a inconsistências.

Simplifique os fluxos de trabalho com sonicadores para múltiplas amostras

O UIP400MTP, por exemplo, permite o tratamento ultrassónico simultâneo dos poços de microplacas, assegurando o desprendimento uniforme de biofilmes ou de material celular. Por sua vez, o VialTweeter proporciona lise e homogeneização precisas de múltiplas amostras em tubos, sem contaminação cruzada. Estes sonicadores reduzem significativamente os tempos de processamento, melhoram a reprodutibilidade experimental e mantêm uma elevada integridade das amostras, tornando-se ferramentas indispensáveis na investigação em microbiologia, proteómica e biologia molecular.
Apresenta-se abaixo um protocolo detalhado que exemplifica a utilização dos modelos de sonicadores Hielscher para múltiplas amostras, o sonicador multitubos VialTweeter e o sonicador de microplacas UIP400MTP, num estudo que envolve a formação de biofilmes de E. coli e a subsequente análise proteómica.

Protocolo: formação e desprendimento de biofilmes e análise proteómica com sonicadores Hielscher para múltiplas amostras

1. Preparação da cultura bacteriana

• Cultive bactérias E. coli (estirpe W3110) a 30°C, uma temperatura favorável à formação de biofilmes de E. coli, em meio de caldo de triptona (TB) contendo:
  – 10 g/L de triptona
  – 5 g/L de NaCl
• Suplemente com antibióticos conforme necessário para assegurar a retenção dos plasmídeos.
• Para estudos de microscopia e de atividade de promotores, utilize a estirpe W3110 de E. coli com um repórter genómico de GFP melhorada (eGFP) sob o controlo do promotor rplL.
• Utilize plasmídeos repórteres de GFP para vários promotores (por exemplo, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) para medir as atividades dos promotores.

2. Cultivo e desprendimento de biofilmes

• Inocule 1,5 mL de cultura bacteriana diluída por poço numa placa de 12 poços (placas CellStar de 12 poços, Greiner Bio-One).
• Incube para permitir a formação de biofilmes.
• Remova cuidadosamente a cultura planctónica (não aderente).

– Lave cada poço com 500 µL de PBS.
– Desprenda as células aderentes por sonicação da placa de 12 poços no sonicador de microplacas UIP400MTP. O UIP400MTP assegura um desprendimento uniforme ao fornecer energia ultrassónica consistente a todos os poços.
– Parâmetros de sonicação: amplitude de 60%, modo cíclico: 60 sec LIGADO / 30 sec DESLIGADO.

3. Recolha e lise das células

• Centrifugue as células desprendidas do biofilme a 4 500 g durante 5 minutos.
• Lave as células sedimentadas com PBS.
• Ressuspenda as células em 100 µL de lauroil sarcosinato de sódio (SLS) a 2% e incube a 95°C durante 15 minutos.
• Efetue a sonicação com o sonicador multitubos VialTweeter para assegurar a lise celular completa.
  – Parâmetros de sonicação: amplitude de 100%, 50 s LIGADO / 10 s DESLIGADO durante um tempo total de funcionamento de 10 min; mantenha as amostras em gelo.

4. Redução e alquilação

• Adicione tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a 5 mM para reduzir as ligações dissulfureto e incube a 95°C durante 15 minutos.
• Alquile as proteínas com iodoacetamida a 10 mM durante 30 minutos a 25°C.

5. Quantificação e digestão de proteínas

• Centrifugue os lisados para remover os detritos.
• Quantifique o teor total de proteínas utilizando o Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Digerira 50 µg de proteína total com 1 µg de tripsina numa solução contendo SLS a 2% e bicarbonato de amónio a 100 mM.
• Incube a reação de digestão durante a noite a 30°C.

6. Purificação de péptidos

• Precipite o SLS adicionando ácido trifluoroacético (TFA) a 1,5% e, em seguida, centrifugue.
• Purifique os péptidos utilizando microcolunas de centrifugação C18.
• Seque os péptidos purificados e ressuspenda-os em TFA a 0,1%.

7. Cromatografia líquida–espectrometria de massa (LC-MS/MS)

• Analise os péptidos num espectrómetro de massa Q-Exactive Plus acoplado a um sistema Ultimate 3000 RSLC nano.
• Separe os péptidos utilizando uma coluna de HPLC de fase reversa (75 µm × 42 cm) empacotada com resina C18 (2,4 µm).
• Aplique um gradiente de 2% a 35% de solvente B (acetonitrilo com ácido fórmico a 0,15%) ao longo de 140 minutos.
• Adquira dados utilizando varrimentos de MS de alta resolução, seguidos de varrimentos de MS/MS em tandem dos 10 iões mais intensos.

8. Análise de dados

• Processe os dados brutos de LC-MS utilizando o software Progenesis.
• Exporte ficheiros .mgf e analise-os com o MASCOT.
• Efetue a quantificação de péptidos utilizando o SafeQuant para o controlo de qualidade e o ajuste para falsas descobertas.
• Realize todas as experiências em duplicado ou triplicado para assegurar a reprodutibilidade.

Sonicadores para múltiplas amostras para preparação de amostras com elevada capacidade de processamento

Os modelos de sonicadores para múltiplas amostras VialTweeter e UIP400MTP melhoram significativamente a precisão e a eficiência dos fluxos de trabalho experimentais, especialmente na investigação de biofilmes e em proteómica. A sua capacidade de processar múltiplas amostras de forma uniforme assegura uma elevada capacidade de processamento sem comprometer a qualidade dos dados. Estes benefícios, combinados com os fluxos de trabalho simplificados descritos acima, tornam os sonicadores Hielscher para múltiplas amostras ferramentas essenciais para a investigação biológica moderna.

Conceção, fabrico e consultoria – qualidade fabricada na Alemanha

Os sonicadores Hielscher são bem conhecidos pelos seus padrões de qualidade e de conceção do mais elevado nível. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração harmoniosa dos nossos sonicadores em instalações industriais. Os sonicadores Hielscher lidam facilmente com condições adversas e ambientes exigentes.

A Hielscher Ultrasonics é uma empresa com certificação ISO e dá especial importância a sonicadores de elevado desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os sonicadores Hielscher estão em conformidade com os requisitos CE e cumprem os requisitos de UL, CSA e RoHs.