Protocolo que utiliza os Sonicadores Multi-Amostra Hielscher na análise de biofilme e proteómica

A utilização de sonicadores para várias amostras, como o VialTweeter Multi-Tube Sonicator e o UIP400MTP Microplate Sonicator, simplifica os fluxos de trabalho de laboratório para aplicações de elevado rendimento. Ambos os dispositivos permitem um processamento ultrassónico preciso e uniforme em várias amostras, minimizando a variabilidade e melhorando a reprodutibilidade. Isto é particularmente vantajoso em experiências que requerem lise consistente de amostras, descolamento de biofilme, extração de proteínas ou digestão proteolítica, onde os métodos manuais ou de amostra única são menos eficientes e propensos a inconsistências.

Simplifique os fluxos de trabalho com os Sonicadores Multi-Sample

O UIP400MTP, por exemplo, permite o tratamento ultrassónico simultâneo de poços de microplacas, assegurando o desprendimento uniforme de biofilmes ou material celular. Entretanto, o VialTweeter oferece uma lise e homogeneização precisas de amostras de tubos múltiplos sem contaminação cruzada. Estes sonicadores reduzem significativamente os tempos de processamento, melhoram a reprodutibilidade experimental e mantêm uma elevada integridade das amostras, tornando-os ferramentas indispensáveis na investigação em microbiologia, proteómica e biologia molecular.
Segue-se um protocolo detalhado que exemplifica a utilização dos modelos de sonicadores multiamostras Hielscher, o VialTweeter Multi-Tube Sonicator e o Microplate Sonicator UIP400MTP, num estudo que envolveu a formação de biofilme de E. coli e a subsequente análise proteómica.

Protocolo: Formação de biofilme, descolamento e análise proteómica utilizando Sonicadores Multi-Amostras Hielscher

1. Preparação da cultura bacteriana

• Cultivar bactérias E. coli (estirpe W3110) a 30°C, uma temperatura favorável à formação de biofilme de E. coli, em meio de caldo de triptona (TB) contendo:
  – 10 g/L de triptona
  – 5 g/L NaCl
• Suplementar com antibióticos, conforme necessário, para garantir a retenção do plasmídeo.
• Para estudos de microscopia e da atividade do promotor, utilizar a estirpe W3110 E. coli com um repórter genómico GFP melhorado (eGFP) sob o controlo do promotor rplL.
• Utilizar plasmídeos repórteres GFP para vários promotores (por exemplo, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) para medir as actividades dos promotores.

2. Cultivo e descolamento de biofilme

• Semear 1,5 ml de cultura bacteriana diluída por poço numa placa de 12 poços (placas CellStar de 12 poços, Greiner Bio-One).
• Incubar para permitir a formação de biofilme.
• Retirar cuidadosamente a cultura planctónica (não aderente).

– Lavar cada poço com 500 µL de PBS.
– Separe as células fixadas sonicando a placa de 12 poços no sonicador de microplacas UIP400MTP. O UIP400MTP assegura um descolamento uniforme, fornecendo energia ultra-sónica consistente em todos os poços.
– Definições de sonicação: 60% de amplitude, modo de ciclo: 60 seg. ON / 30 seg. OFF.

3. Colheita e lise de células

• Centrifugar as células de biofilme destacadas a 4.500 g durante 5 minutos.
• Lavar as células em pelotas com PBS.
• Ressuspender as células em 100 µL de lauroil sarcosinato de sódio (SLS) a 2% e incubar a 95°C durante 15 minutos.
• Sonicar utilizando o VialTweeter Multi-Tube Sonicator para garantir a lise completa das células.
  – Definições de sonicação: Amplitude de 100%, 50 s ON / 10 s OFF para um tempo total de execução de 10 min; manter as amostras em gelo.

4. Redução e alquilação

• Adicionar 5 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reduzir as ligações dissulfureto e incubar a 95°C durante 15 minutos.
• Alquilar as proteínas com iodoacetamida 10 mM durante 30 minutos a 25°C.

5. Quantificação e digestão de proteínas

• Centrifugar os lisados para eliminar os resíduos.
• Quantificar o teor total de proteínas utilizando o kit de ensaio de proteínas BCA de Pierce.
• Digerir 50 µg de proteínas totais com 1 µg de tripsina numa solução contendo 2% de SLS e 100 mM de bicarbonato de amónio.
• Incubar a reação de digestão durante a noite a 30°C.

6. Purificação de péptidos

• Precipitar a SLS adicionando 1,5% de ácido trifluoroacético (TFA) e centrifugar.
• Purificar os péptidos utilizando colunas de microspin C18.
• Secar os péptidos purificados e ressuspender em TFA a 0,1%.

7. Cromatografia líquida-espetrometria de massa (LC-MS/MS)

• Analisar os péptidos num espetrómetro de massa Q-Exactive Plus acoplado a um sistema nano Ultimate 3000 RSLC.
• Separar os péptidos utilizando uma coluna de HPLC de fase inversa (75 µm × 42 cm) com resina C18 (2,4 µm).
• Aplicar um gradiente de 2% a 35% de solvente B (acetonitrilo com 0,15% de ácido fórmico) durante 140 minutos.
• Adquirir dados utilizando varrimentos MS de alta resolução seguidos de varrimentos MS/MS em tandem dos 10 iões mais intensos.

8. Análise de dados

• Processar dados LC-MS brutos utilizando o software Progenesis.
• Exporte ficheiros .mgf e analise-os com o MASCOT.
• Efetuar a quantificação de péptidos utilizando SafeQuant para controlo de qualidade e ajuste de falsas descobertas.
• Realizar todas as experiências em duplicado ou triplicado para garantir a reprodutibilidade.

Sonicadores multiamostras para preparação de amostras de alto rendimento

Os modelos de sonicador multiamostras VialTweeter e UIP400MTP aumentam significativamente a precisão e a eficiência dos fluxos de trabalho experimentais, especialmente na investigação de biofilmes e proteómica. A sua capacidade de processar múltiplas amostras uniformemente garante uma capacidade de alto rendimento sem comprometer a qualidade dos dados. Estas vantagens, combinadas com os fluxos de trabalho simplificados acima descritos, tornam os sonicadores multiamostras da Hielscher ferramentas essenciais para a investigação biológica moderna.

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