Extração da matriz extracelular com o Sonicator de 96 poços UIP400MTP

Os métodos tradicionais de extração da Matriz Extracelular (ME) envolvem frequentemente várias etapas para romper a matriz do biofilme. No entanto, estas técnicas podem ser demoradas e inconsistentes, levando a uma variabilidade nos resultados. Com o sonicador de placas de 96 poços UIP400MTP, o processo de extração EM é significativamente facilitado, proporcionando uma rutura de biofilme altamente eficiente, precisa e uniforme em formatos de elevado rendimento. O UIP400MTP utiliza ultra-sons focalizados para gerar cavitação controlada, quebrando eficazmente a matriz do biofilme, preservando a viabilidade e a integridade das células incorporadas no biofilme. A utilização do UIP400MTP melhora a reprodutibilidade e a precisão dos ensaios a jusante, tais como análises metabolómicas e proteómicas, testes de viabilidade e estudos de suscetibilidade antimicrobiana. Ao simplificar a extração de EM, o UIP400MTP permite que os investigadores obtenham resultados consistentes e de alta qualidade, oferecendo uma visão mais aprofundada da dinâmica do biofilme e das interações com agentes externos.

extração da matriz extracelular

A matriz extracelular (ME) é um componente crítico dos biofilmes formados por microrganismos como a Candida albicans. Composta por polissacáridos, proteínas, lípidos e ADN extracelular, a ME proporciona integridade estrutural, medeia a adesão a superfícies e contribui significativamente para a resistência antimicrobiana. A extração e análise do EM é essencial para compreender a biologia do biofilme, elucidar os mecanismos de resistência aos medicamentos e identificar novos alvos terapêuticos.

Protocolo para extração de matriz extracelular (EM) de biofilmes de Candida albicans utilizando o UIP400MTP

Este protocolo centra-se na extração da matriz extracelular (EM) de biofilmes estáticos de Candida albicans. Integrando o sonicador UIP400MTP para substituir os passos tradicionais de raspagem ou à base de enzimas para melhorar a eficiência e a reprodutibilidade.

Materiais necessários

Instruções passo a passo para a extração EM

1. Formação de biofilme estático
   Para biofilmes estáticos, inocular C. albicans nos poços de uma placa de 96 poços utilizando o meio RPMI-1640. Cada poço deve conter um volume consistente de inóculo (por exemplo, 200 µL por poço).
   Incubar a placa a 37°C em condições estáticas durante 24 horas para permitir a formação de biofilme nas superfícies dos poços.
2. Preparação do biofilme para extração
   Após a incubação, aspirar cuidadosamente e deitar fora o meio gasto de cada poço sem perturbar o biofilme.
   Lavar cada poço cuidadosamente com PBS estéril (por exemplo, 200 µL) para remover células soltas e detritos planctónicos. Repetir este passo duas vezes.
   Adicionar PBS fresco ou o tampão de extração (por exemplo, 200 µL) a cada poço para preparar a sonicação.
3. Sonicação com UIP400MTP
   Colocar a placa de 96 poços contendo PBS ou tampão de extração no tabuleiro do sonicador UIP400MTP. Para colocar corretamente a placa com vários poços, siga as instruções do manual.
   Sonicar durante 5-6 minutos a uma velocidade suave (60% de amplitude, modo pulsado), assegurando uma rutura uniforme da estrutura do biofilme e a libertação dos componentes EM.
   Utilize o controlo de temperatura do sonicador UIP400MTP (sensor de temperatura e definições) para evitar um aquecimento excessivo ou danos nas amostras.
4. Tratamento com resina de permuta catiónica (RCE)
   Transferir o líquido sonicado de cada poço para uma nova placa de 96 poços.
   Adicionar um volume duplo de suspensão de RCE (preparada em PBS ou tampão) a cada poço (por exemplo, 400 µL de volume total por poço).
   Selar a placa e incubá-la num agitador de placas ou num rotador a 400 rpm durante 3 horas para permitir a ligação e o isolamento dos componentes EM.
5. Separação e filtragem
   Centrifugar a placa a 2.000 × g durante 10 minutos para separar a resina e as células do sobrenadante.
   Transferir cuidadosamente o sobrenadante contendo EM de cada poço para uma nova placa de 96 poços.
   Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 µm utilizando um sistema de coletor de vácuo com base em placas ou equivalente para obter um extrato EM limpo.
6. Análise de EM
   Utilizar técnicas como UPLC-Q-TOF-MS para a caraterização de metabolitos não direcionados ou utilizar ensaios específicos (por exemplo, BCA para proteínas, triglicéridos e kits de quantificação de hidratos de carbono) para caraterizar os componentes EM.

Extração de matriz extracelular de alto rendimento

A elevada eficiência da extração da matriz extracelular (EM) com o sonicador UIP400MTP revolucionou a preparação de amostras para ensaios que requerem uma análise precisa das propriedades do biofilme. O UIP400MTP utiliza ondas ultra-sónicas para romper com precisão e uniformidade a matriz do biofilme, permitindo a libertação eficaz dos componentes da EM, preservando a viabilidade e a integridade das células. Esta abordagem aumenta significativamente a fiabilidade de ensaios como os testes de viabilidade do biofilme, estudos proteómicos e metabolómicos e avaliações da suscetibilidade antimicrobiana.

Para ensaios de recuperação de biofilme, como a contagem de unidades formadoras de colónias (CFU), a extração EM com o UIP400MTP assegura o acesso desobstruído dos reagentes às células incorporadas no biofilme. Do mesmo modo, as análises proteómicas e metabolómicas, como a UPLC-Q-TOF-MS, beneficiam do isolamento de alto rendimento de proteínas, lípidos e metabolitos. O UIP400MTP também suporta testes de suscetibilidade antimicrobiana precisos, permitindo a determinação exacta dos valores MIC e MBEC do biofilme. Além disso, a extração eficiente facilitada pelo UIP400MTP ajuda em ensaios de atividade enzimática, quantificação de componentes e estudos estruturais, oferecendo conhecimentos valiosos sobre o papel das matrizes extracelulares na arquitetura do biofilme, adesão e mecanismos de resistência.

Este método de extração reprodutível e de elevado rendimento optimiza a preparação de EM, garantindo resultados superiores numa série de ensaios relacionados com biofilme.