Extração da matriz extracelular com o sonicador para placas de 96 poços UIP400MTP

Os métodos tradicionais de extração da matriz extracelular (EM) envolvem frequentemente várias etapas para desestruturar a matriz do biofilme. No entanto, estas técnicas podem ser demoradas e inconsistentes, levando à variabilidade dos resultados. Com o sonicador para placas de 96 poços UIP400MTP, o processo de extração da EM é significativamente facilitado, proporcionando uma desestruturação altamente eficiente, precisa e uniforme do biofilme em formatos de elevada capacidade de processamento. O UIP400MTP utiliza ultrassons focalizados para gerar cavitação controlada, desestruturando eficazmente a matriz do biofilme e preservando simultaneamente a viabilidade e a integridade das células incorporadas no biofilme. A utilização do UIP400MTP melhora a reprodutibilidade e a exatidão dos ensaios subsequentes, como análises metabolómicas e proteómicas, testes de viabilidade e estudos de suscetibilidade aos antimicrobianos. Ao simplificar a extração da EM, o UIP400MTP permite aos investigadores obter resultados consistentes e de elevada qualidade, proporcionando uma compreensão mais aprofundada da dinâmica dos biofilmes e das suas interações com agentes externos.

Extração da matriz extracelular

A matriz extracelular (EM) é um componente fundamental dos biofilmes formados por microrganismos como Candida albicans. Composta por polissacáridos, proteínas, lípidos e DNA extracelular, a EM proporciona integridade estrutural, medeia a adesão às superfícies e contribui significativamente para a resistência aos antimicrobianos. A extração e a análise da EM são essenciais para compreender a biologia dos biofilmes, elucidar os mecanismos de resistência aos fármacos e identificar novos alvos terapêuticos.

Protocolo de extração da matriz extracelular (EM) de biofilmes de Candida albicans com o UIP400MTP

Este protocolo centra-se na extração da matriz extracelular (EM) de biofilmes estáticos de Candida albicans. Integra o sonicador UIP400MTP para substituir as etapas tradicionais de raspagem ou as etapas baseadas em enzimas, melhorando a eficiência e a reprodutibilidade.

Materiais necessários

Instruções passo a passo para a extração da EM

1. Formação do biofilme estático
   Para biofilmes estáticos, inocule C. albicans nos poços de uma placa de 96 poços utilizando meio RPMI-1640. Cada poço deve conter um volume uniforme de inóculo (por exemplo, 200 µL por poço).
   Incube a placa a 37°C em condições estáticas durante 24 horas para permitir a formação de biofilme nas superfícies dos poços.
2. Preparação do biofilme para extração
   Após a incubação, aspire suavemente e descarte o meio usado de cada poço sem perturbar o biofilme.
   Lave cuidadosamente cada poço com PBS estéril (por exemplo, 200 µL) para remover células fracamente aderentes e detritos planctónicos. Repita esta etapa duas vezes.
   Adicione PBS fresco ou o tampão de extração (por exemplo, 200 µL) a cada poço para preparar a sonicação.
3. Sonicação com o UIP400MTP
   Coloque a placa de 96 poços que contém PBS ou tampão de extração no tabuleiro do sonicador UIP400MTP. Para colocar corretamente a placa de múltiplos poços, siga as instruções do manual.
   Efetue a sonicação durante 5–6 minutos com uma configuração suave (60% de amplitude, modo pulsado), assegurando a desestruturação uniforme do biofilme e a libertação dos componentes da EM.
   Utilize o controlo de temperatura do sonicador UIP400MTP (sensor de temperatura e definições) para evitar o aquecimento excessivo ou danos nas amostras.
4. Tratamento com resina de troca catiónica (CER)
   Transfira o líquido sonicado de cada poço para uma nova placa de 96 poços.
   Adicione a cada poço um volume de suspensão de CER equivalente ao dobro do volume de líquido (preparada em PBS ou tampão) (por exemplo, 400 µL de volume total por poço).
   Sele a placa e incube-a num agitador de placas ou num dispositivo de rotação a 400 rpm durante 3 horas para permitir a ligação e o isolamento dos componentes da EM.
5. Separação e filtração
   Centrifugue a placa a 2 000 × g durante 10 minutos para separar a resina e as células do sobrenadante.
   Transfira cuidadosamente o sobrenadante que contém a EM de cada poço para uma nova placa de 96 poços.
   Filtre o sobrenadante através de um filtro de 0,22 µm utilizando um sistema de filtração a vácuo para placas ou equivalente para obter um extrato limpo de EM.
6. Análise da EM
   Utilize técnicas como UPLC-Q-TOF-MS para a determinação não direcionada do perfil de metabolitos ou recorra a ensaios específicos (por exemplo, BCA para proteínas e kits de quantificação de triglicéridos e hidratos de carbono) para caracterizar os componentes da EM.

Extração da matriz extracelular com elevada capacidade de processamento

A elevada eficiência da extração da matriz extracelular (EM) com o sonicador UIP400MTP revolucionou a preparação de amostras para ensaios que exigem uma análise exata das propriedades dos biofilmes. O UIP400MTP utiliza ondas ultrassónicas para desestruturar de forma precisa e uniforme a matriz do biofilme, permitindo a libertação eficaz dos componentes da EM e preservando simultaneamente a viabilidade e a integridade das células. Esta abordagem melhora significativamente a fiabilidade de ensaios como testes de viabilidade de biofilmes, estudos proteómicos e metabolómicos e avaliações da suscetibilidade aos antimicrobianos.

Nos ensaios de recuperação de biofilmes, como a contagem de unidades formadoras de colónias (CFU), a extração da EM com o UIP400MTP assegura o acesso desimpedido dos reagentes às células incorporadas no biofilme. Da mesma forma, as análises proteómicas e metabolómicas, como UPLC-Q-TOF-MS, beneficiam do isolamento de proteínas, lípidos e metabolitos com elevado rendimento. O UIP400MTP também permite realizar testes precisos de suscetibilidade aos antimicrobianos, possibilitando a determinação exata dos valores de MIC e MBEC dos biofilmes. Além disso, a extração eficiente facilitada pelo UIP400MTP auxilia os ensaios de atividade enzimática, a quantificação de componentes e os estudos estruturais, proporcionando informações valiosas sobre o papel das matrizes extracelulares na arquitetura dos biofilmes, na adesão e nos mecanismos de resistência.

Este método de extração reprodutível e com elevada capacidade de processamento otimiza a preparação da EM, assegurando resultados superiores numa variedade de ensaios relacionados com biofilmes.