Protocolo ASTM E2799-22 para avaliação antimicrobiana

O UIP400MTP da Hielscher é um sonicador de placas multipoços potente e eficiente, concebido para simplificar o passo de sonicação no protocolo ASTM E2799-22. Ao fornecer energia ultra-sónica uniforme em toda a placa de microtitulação, o UIP400MTP assegura um descolamento consistente e fiável dos biofilmes das tampas das placas sem danificar as células ou comprometer a integridade da amostra. A sua capacidade de alto rendimento e a facilidade de utilização reduzem significativamente o tempo de processamento, ao mesmo tempo que aumentam a reprodutibilidade, tornando-o uma solução ideal para laboratórios que realizam ensaios de viabilidade de biofilme e testes de eficácia antimicrobiana.

ASTM E2799

O ASTM E2799 é um método de teste normalizado concebido para avaliar a eficácia dos agentes antimicrobianos contra biofilmes, centrando-se especificamente na Pseudomonas aeruginosa. Os biofilmes são comunidades microbianas complexas que aderem às superfícies e apresentam uma resistência acrescida aos tratamentos antimicrobianos, o que os torna um desafio significativo nos contextos da saúde, industrial e ambiental. Este método utiliza o ensaio de Concentração Mínima de Erradicação de Biofilme (MBEC) para fornecer um quadro fiável e reprodutível para testar desinfectantes em condições realistas de biofilme.

Como é que a sonicação contribui para a norma ASTM E2799?

A sonicação desempenha um papel fundamental no protocolo ASTM E2799, facilitando o desprendimento de biofilmes das superfícies de teste, garantindo uma avaliação exacta da viabilidade microbiana após o tratamento. Ao utilizar energia ultra-sónica controlada, o protocolo consegue uma rutura eficiente e consistente do biofilme sem danificar as células, permitindo resultados precisos e reprodutíveis. Isto faz da ASTM E2799 uma ferramenta essencial para o avanço da investigação do biofilme e para o desenvolvimento de estratégias antimicrobianas eficazes.

Como efetuar o ensaio MBEC de acordo com a norma ASTM E2799-22

O protocolo ASTM E2799-22 descreve os passos para avaliar a eficácia dos agentes antimicrobianos contra biofilmes. Quando se utiliza o sonicador de placas de microtitulação UIP400MTP da Hielscher, o protocolo pode ser adaptado para incorporar este método avançado de sonicação para o desprendimento de biofilme. Segue-se uma descrição dos passos adaptados à utilização do sonicador de microplacas UIP400MTP:

1. Preparação de biofilmes
   Preparar uma placa de microtitulação estéril de 96 poços com tampas amovíveis.
   Inocular os poços com uma suspensão bacteriana padronizada num meio de crescimento adequado.
   Colocar a tampa da placa na placa, assegurando que as cavilhas estão completamente imersas na suspensão bacteriana.
   Incubar a placa em condições controladas (por exemplo, temperatura e tempo) para permitir a formação de biofilme nas cavilhas.
2. Tratamento com agentes antimicrobianos
   Após a formação do biofilme, substituir o meio por um meio fresco contendo os agentes antimicrobianos testados em diferentes concentrações.
   Voltar a colocar a tampa da cavilha e incubar nas condições especificadas no projeto de ensaio.
3. Preparação para o descolamento do biofilme
   Após o tratamento, enxaguar a tampa da cavilha, mergulhando-a numa solução de enxaguamento estéril para remover os agentes antimicrobianos residuais e as células planctónicas soltas.
4. Descolamento de biofilme utilizando o Sonicador UIP400MTP
   Preparar uma nova placa de microtitulação de 96 poços com um meio de recuperação (por exemplo, caldo neutralizante).
   Separar os biofilmes colocando a tampa da cavilha nos poços da placa de meio de recuperação.
   Insira a placa no sonicador UIP400MTP, certificando-se de que a tampa e a placa estão corretamente alinhadas.
   Definir o sonicador para uma amplitude de 70%-80% e sonicar durante 3-4 minutos no modo de ciclo, para garantir um descolamento consistente do biofilme sem lise celular.
5. Avaliação da viabilidade do biofilme
   Após a sonicação, processar o meio de recuperação que contém as células de biofilme destacadas utilizando técnicas microbiológicas ou analíticas normais, tais como:
   • Contagem de unidades formadoras de colónias (CFU): Efetuar diluições em série e colocar em placas de ágar para contagem de células viáveis.
   • Medições da densidade ótica (DO): Utilizar a análise espectrofotométrica para avaliar a densidade celular.
   • Ensaios de viabilidade baseados em fluorescência: Quantificar células vivas e mortas utilizando corantes fluorescentes.
6. Análise de dados
   Comparar os dados de viabilidade dos biofilmes tratados e não tratados para determinar a eficácia dos agentes antimicrobianos.
   Calcular a concentração mínima de erradicação do biofilme (MBEC) com base na concentração necessária para eliminar as células viáveis do biofilme.
7. Controlo de qualidade
   Assegurar condições de sonicação consistentes, calibrando regularmente o UIP400MTP e verificando se o processo de descolamento do biofilme não resulta numa lise ou destruição significativa das células.
   Incluir controlos apropriados, tais como biofilmes não tratados e espaços em branco apenas para o meio, para validar os resultados.

As células de biofilme formadas nos pinos foram desalojadas por sonicação (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Alemanha, UIP250MTP) durante 5 minutos em placas de 96 poços contendo meio de cultura fresco para recuperação das células.
(Imagem e estudo: ©de Oliveira et al., 2016)

Ao integrar o UIP400MTP no fluxo de trabalho ASTM E2799-22, o processo de descolamento de biofilme é optimizado para consistência, eficiência e aplicações de elevado rendimento.