Protocolo ASTM E2799-22 para avaliação antimicrobiana

O Hielscher UIP400MTP é um sonicador de placas multipoços potente e eficiente, concebido para simplificar a etapa de sonicação do protocolo ASTM E2799-22. Ao distribuir energia ultrassónica uniforme por toda a placa de microtitulação, o UIP400MTP assegura o desprendimento consistente e fiável dos biofilmes das tampas com pinos, sem danificar as células nem comprometer a integridade das amostras. A sua elevada capacidade de processamento e facilidade de utilização reduzem significativamente o tempo de processamento e aumentam a reprodutibilidade, tornando-o uma solução ideal para laboratórios que realizam ensaios de viabilidade de biofilmes e testes de eficácia antimicrobiana.

ASTM E2799

A ASTM E2799 é um método de ensaio normalizado concebido para avaliar a eficácia de agentes antimicrobianos contra biofilmes, com especial incidência em Pseudomonas aeruginosa. Os biofilmes são comunidades microbianas complexas que aderem a superfícies e apresentam uma resistência acrescida aos tratamentos antimicrobianos, constituindo um desafio significativo em contextos de cuidados de saúde, industriais e ambientais. Este método utiliza o ensaio de concentração mínima de erradicação de biofilmes (MBEC) para proporcionar uma metodologia fiável e reprodutível para testar desinfetantes em condições realistas de biofilme.

Como contribui a sonicação para a ASTM E2799?

A sonicação desempenha um papel fundamental no protocolo ASTM E2799 ao facilitar o desprendimento dos biofilmes das superfícies de ensaio, assegurando uma avaliação precisa da viabilidade microbiana após o tratamento. Ao utilizar energia ultrassónica controlada, o protocolo permite uma desestruturação eficiente e consistente dos biofilmes sem danificar as células, possibilitando resultados precisos e reprodutíveis. Isto faz da ASTM E2799 uma ferramenta essencial para o avanço da investigação sobre biofilmes e o desenvolvimento de estratégias antimicrobianas eficazes.

Como realizar o ensaio MBEC de acordo com a ASTM E2799-22

O protocolo ASTM E2799-22 descreve as etapas para avaliar a eficácia de agentes antimicrobianos contra biofilmes. Ao utilizar o sonicador de placas de microtitulação Hielscher UIP400MTP, o protocolo pode ser adaptado para incorporar este método avançado de sonicação para o desprendimento de biofilmes. Segue-se uma descrição das etapas adaptadas à utilização do sonicador de microplacas UIP400MTP:

1. Preparação dos biofilmes
   Prepare uma placa de microtitulação estéril de 96 poços com tampas amovíveis com pinos.
   Inocule os poços com uma suspensão bacteriana normalizada num meio de crescimento adequado.
   Coloque a tampa com pinos sobre a placa, garantindo que os pinos ficam totalmente imersos na suspensão bacteriana.
   Incube a placa em condições controladas (por exemplo, temperatura e tempo) para permitir a formação de biofilmes nos pinos.
2. Tratamento com agentes antimicrobianos
   Após a formação dos biofilmes, substitua o meio por meio fresco contendo os agentes antimicrobianos a testar em diferentes concentrações.
   Volte a colocar a tampa com pinos e incube nas condições especificadas no plano do ensaio.
3. Preparação para o desprendimento dos biofilmes
   Após o tratamento, lave a tampa com pinos, mergulhando-a numa solução de lavagem estéril para remover os agentes antimicrobianos residuais e as células planctónicas fracamente aderentes.
4. Desprendimento dos biofilmes utilizando o sonicador UIP400MTP
   Prepare uma nova placa de microtitulação de 96 poços contendo um meio de recuperação (por exemplo, caldo neutralizante).
   Desprenda os biofilmes colocando a tampa com pinos nos poços da placa com meio de recuperação.
   Insira a placa no sonicador UIP400MTP, garantindo que a tampa e a placa estão devidamente alinhadas.
   Regule o sonicador para uma amplitude de 70%–80% e aplique sonicação durante 3–4 minutos em modo cíclico, para assegurar um desprendimento consistente dos biofilmes sem lise celular.
5. Avaliação da viabilidade dos biofilmes
   Após a sonicação, processe o meio de recuperação que contém as células dos biofilmes desprendidos utilizando técnicas microbiológicas ou analíticas convencionais, tais como:
   • Contagens de unidades formadoras de colónias (CFU): Efetue diluições seriadas e semeie em ágar para enumerar as células viáveis.
   • Medições de densidade ótica (OD): Utilize análise espectrofotométrica para avaliar a densidade celular.
   • Ensaios de viabilidade baseados em fluorescência: Quantifique as células vivas e mortas utilizando corantes fluorescentes.
6. Análise dos dados
   Compare os dados de viabilidade dos biofilmes tratados e não tratados para determinar a eficácia dos agentes antimicrobianos.
   Calcule a concentração mínima de erradicação de biofilmes (MBEC) com base na concentração necessária para eliminar as células viáveis dos biofilmes.
7. Controlo de qualidade
   Assegure condições de sonicação consistentes, calibrando regularmente o UIP400MTP e verificando que o processo de desprendimento dos biofilmes não provoca lise ou destruição celular significativa.
   Inclua controlos adequados, tais como biofilmes não tratados e brancos contendo apenas meio, para validar os resultados.

As células dos biofilmes formados nos pinos foram desprendidas por sonicação (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Alemanha, UIP250MTP) durante 5 min em placas de 96 poços contendo meio de cultura fresco para a recuperação das células.
(Imagem e estudo: ©de Oliveira et al., 2016)

Ao integrar o UIP400MTP no fluxo de trabalho da ASTM E2799-22, o processo de desprendimento dos biofilmes é otimizado em termos de consistência, eficiência e aplicações de elevado rendimento.