Protocolo de cultivo e desprendimento de biofilmes de Staphylococcus

Os métodos normalizados são essenciais para obter resultados de investigação fiáveis. Aqui encontra um protocolo de cultivo e desprendimento de biofilmes estafilocócicos. Este protocolo centra-se na preparação simplificada de amostras com elevada capacidade de processamento, utilizando o sonicador para placas multipoços UIP400MTP para um desprendimento eficiente de biofilmes, com elevada capacidade de processamento, em placas de 96 poços. O protocolo também contém etapas fundamentais para o cultivo, a lavagem e a visualização de biofilmes, com enfoque na minimização da variabilidade e na garantia da reprodutibilidade.

Investigação sobre biofilmes de Staphylococcus e antibióticos

Os biofilmes de Staphylococcus desempenham um papel crucial nas infeções persistentes devido à sua resistência aos antibióticos e às respostas imunitárias. A formação de biofilmes proporciona um ambiente protetor às bactérias, tornando as infeções difíceis de tratar. A investigação sobre biofilmes centra-se frequentemente na compreensão da sua formação, comportamento e suscetibilidade aos antimicrobianos, com ênfase em métodos com elevada capacidade de processamento para simplificar os fluxos de trabalho experimentais.
O sonicador para placas multipoços UIP400MTP oferece uma vantagem significativa na investigação sobre biofilmes ao permitir o desprendimento rápido e eficiente de biofilmes de placas de 96 poços. Este dispositivo fornece energia ultrassónica uniforme a todos os poços, garantindo resultados consistentes e minimizando a variabilidade.

Protocolo para o cultivo e desprendimento de biofilmes de Staphylococcus

Abaixo, apresentamos instruções passo a passo para o processo de cultivo e desprendimento de um biofilme de Staphylococcus. Como exemplo de uma etapa analítica, mostramos como quantificar espectrofotometricamente a biomassa cultivada através da coloração com violeta de cristal.

Cultivo de biofilmes de Staphylococcus

Materiais necessários:

• Placas de microtitulação estéreis de poliestireno, de 96 poços com fundo plano, tratadas para cultura de tecidos e com tampa
• Caldo de soja tríptico (TSB) com 0,25% de glucose
• Cabine de segurança biológica

Etapas:

1. Prepare um ambiente de trabalho estéril numa cabine de segurança biológica para minimizar a contaminação.
2. Adicione TSB contendo 0,25% de glucose aos poços da placa de microtitulação. O TSB sem glucose geralmente não favorece a formação de biofilmes e só deve ser utilizado como controlo, se necessário.
3. Inocule os poços com estirpes bacterianas preparadas conforme descrito abaixo:
4. Prepare suspensões bacterianas, assegurando a ausência de agregados celulares preexistentes através da homogeneização das suspensões por sonicação ou da desagregação dos agregados com uma agulha de calibre 23 e uma breve agitação em vórtex.
5. Sele a placa com a respetiva tampa e incube em condições ótimas para a formação de biofilmes (por exemplo, 37°C durante 24 horas).
6. Realize a experiência em triplicado para cada estirpe bacteriana (três poços por estirpe) para garantir a fiabilidade.
7. Reserve seis poços por placa para controlos negativos. Podem ser testadas até 30 estirpes por placa de 96 poços.

Visualização e lavagem dos biofilmes

1. Após a incubação, descarte cuidadosamente o meio para evitar perturbar o biofilme.
2. Lave cada poço quatro vezes com solução salina fisiológica para remover as bactérias planctónicas.
3. Inspecione o fundo dos poços para detetar manchas brancas indicativas da presença de biofilme.

Desprendimento de biofilmes com o sonicador para placas multipoços UIP400MTP

Configuração e parâmetros do dispositivo:

• Sonicador para placas multipoços UIP400MTP
• Definições de funcionamento: amplitude de 60%, modo cíclico com 60 segundos LIGADO / 30 segundos DESLIGADO

Etapas:

1. Coloque a placa de microtitulação lavada na plataforma do UIP400MTP.
2. Submeta as amostras a sonicação com as definições recomendadas (amplitude de 60%, 60 segundos LIGADO, 30 segundos DESLIGADO). Ajuste as definições à estirpe bacteriana.
3. Inicie o processo de sonicação para desprender o biofilme. As ondas ultrassónicas desestruturam a matriz do biofilme, libertando as bactérias aderentes.
4. O UIP400MTP garante uma exposição uniforme em todos os poços para obter resultados consistentes de desprendimento.

Etapa analítica: quantificação da biomassa de biofilmes de Staphylococcus desprendidos utilizando violeta de cristal (CV)

Materiais necessários:

• Solução de violeta de cristal (CV) a 0,1%
• Etanol a 95% ou ácido acético a 30% (para solubilização)
• Leitor de microplacas capaz de efetuar leituras a 570 nm
• Placas de microtitulação estéreis para coloração

Etapas:

1. Preparação da placa de coloração: transfira 100 µL da suspensão de biofilme desprendido de cada poço da placa submetida a sonicação para os poços correspondentes de uma placa de microtitulação de 96 poços limpa e estéril. Isto garante um ambiente limpo e uniforme para a coloração.
2. Coloração do biofilme desprendido: adicione 150 µL de solução de violeta de cristal a 0,1% a cada poço que contenha a suspensão de biofilme desprendido. Pipete suavemente para garantir uma mistura uniforme da suspensão de biofilme e do violeta de cristal.
3. Incubação: deixe a placa incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que o violeta de cristal core eficazmente a biomassa.
4. Lavagem: após a incubação, descarte cuidadosamente a solução de violeta de cristal dos poços sem perturbar a biomassa. Lave cada poço três vezes com solução salina fisiológica estéril para remover o corante não ligado.
5. Secagem: deixe a placa secar ao ar à temperatura ambiente ou numa câmara de fluxo de ar estéril. Evite o aquecimento, pois este pode alterar os resultados.
6. Solubilização: adicione 200 µL de etanol a 95% (ou ácido acético a 30%, dependendo das práticas habituais do laboratório) a cada poço para solubilizar o violeta de cristal ligado. Misture suavemente por pipetagem ou agitando a placa durante 10 minutos à temperatura ambiente.
7. Medição: meça a densidade ótica (OD) da solução de violeta de cristal solubilizado a 570 nm utilizando um leitor de microplacas.
8. Análise de dados: subtraia o valor médio de OD570 dos controlos negativos (poços com TSB, mas sem inóculo bacteriano) aos valores dos poços experimentais para corrigir a coloração de fundo. Registe e analise os dados.

Nota: realize a experiência em triplicado para cada condição para garantir a reprodutibilidade. Assegure o manuseamento adequado do violeta de cristal e do etanol, respeitando os protocolos de segurança e eliminação de resíduos.
 

As principais vantagens do UIP400MTP em síntese:

• Elevada capacidade de processamento: Concebido especificamente para placas multipoços, permitindo processar várias amostras simultaneamente.
• Distribuição ultrassónica uniforme: Garante uma intensidade ultrassónica igual em todos os poços, proporcionando resultados consistentes em todas as amostras.
• Utilize qualquer placa padrão: O UIP400MTP permite processar quaisquer placas multipoços padrão, caixas de Petri e suportes para tubos. Não são necessárias placas exclusivas dispendiosas!
• Interface fácil de utilizar: Fácil de configurar e controlar, tornando-o uma excelente ferramenta para aumentar a produtividade do laboratório. As definições programáveis e a automatização facilitam a normalização dos processos!