Protocolo de cultivo e descolamento de biofilme de Staphylococcus

Os métodos normalizados são essenciais para resultados de investigação fiáveis. Aqui pode encontrar um protocolo de cultivo e descolamento para biofilmes estafilocócicos. Este protocolo centra-se na preparação simplificada de amostras de alto rendimento utilizando o sonicador de placas multipoços UIP400MTP para um descolamento de biofilme eficiente e de alto rendimento em placas de 96 poços. O protocolo também contém os principais passos para o cultivo, lavagem e visualização de biofilmes, com o objetivo de minimizar a variabilidade e garantir a reprodutibilidade.

Biofilme de estafilococos e investigação de antibióticos

Os biofilmes de Staphylococcus desempenham um papel fundamental nas infecções persistentes devido à sua resistência aos antibióticos e às respostas imunitárias. A formação de biofilmes proporciona um ambiente protetor para as bactérias, tornando as infecções difíceis de tratar. A investigação sobre biofilmes centra-se frequentemente na compreensão da sua formação, comportamento e suscetibilidade a antimicrobianos, com ênfase em métodos de elevado rendimento para simplificar os fluxos de trabalho experimentais.
O sonicador de placas multipoços UIP400MTP oferece uma vantagem significativa na investigação de biofilmes, permitindo o desprendimento rápido e eficiente de biofilmes de placas de 96 poços. Este dispositivo fornece energia ultra-sónica uniforme a todos os poços, garantindo resultados consistentes e minimizando a variabilidade.

Protocolo para cultivo e descolamento de biofilme de Staphylococcus

Abaixo, guiamo-lo com uma instrução passo a passo através do processo de cultivo e separação de um biofilme de estafilococos. Como passo analítico exemplar, mostramos-lhe como quantificar espectrofotometricamente a biomassa cultivada através da coloração com violeta de cristal.

Cultivo de biofilme de Staphylococcus

Materiais necessários:

• Placas de microtitulação estéreis de 96 poços de poliestireno para cultura de tecidos, tratadas com tampas, de fundo plano
• Caldo de soja tríptico (TSB) com 0,25% de glucose
• Armário de segurança biológica

Passos:

1. Preparar um ambiente de trabalho estéril numa cabina de segurança biológica para minimizar a contaminação.
2. Adicionar TSB com 0,25% de glucose aos poços da placa de microtítulo. O TSB sem glucose não suporta geralmente a formação de biofilme e só deve ser utilizado como controlo, se necessário.
3. Inocular os poços com estirpes bacterianas preparadas conforme descrito abaixo:
4. Preparar suspensões bacterianas, assegurando que não existem aglomerados de células pré-existentes, homogeneizando as suspensões com recurso a ultra-sons ou quebrando os aglomerados com uma agulha de calibre 23 e agitando brevemente em vórtice.
5. Selar a placa com a respectiva tampa e incubar em condições óptimas para a formação de biofilme (por exemplo, 37°C durante 24 horas).
6. Realizar a experiência em triplicado para cada estirpe bacteriana (três poços por estirpe) para garantir a fiabilidade.
7. Atribuir seis poços por placa para controlos negativos. Podem ser testadas até 30 estirpes por placa de 96 poços.

Visualização e lavagem de biofilmes

1. Após a incubação, deitar fora o meio com cuidado para não perturbar o biofilme.
2. Lavar cada poço quatro vezes com soro fisiológico para remover as bactérias planctónicas.
3. Inspecionar o fundo dos poços para detetar manchas brancas indicativas da presença de biofilme.

Descolamento de biofilme utilizando o Sonicador de Placas Multipoços UIP400MTP

Configuração e parâmetros do dispositivo:

• Sonicador de placas com vários poços UIP400MTP
• Definições de funcionamento: 60% de amplitude, modo de ciclo com 60 segundos ON / 30 segundos OFF

Passos:

1. Colocar a placa de microtitulação lavada na plataforma UIP400MTP.
2. Sonicar as amostras nas definições recomendadas (60% de amplitude, 60 segundos ON, 30 segundos OFF). Ajustar as definições à estirpe bacteriana.
3. Iniciar o processo de sonicação para separar o biofilme. As ondas ultra-sónicas rompem a matriz do biofilme, libertando as bactérias aderentes.
4. O UIP400MTP garante uma exposição uniforme em todos os poços para resultados consistentes de descolamento.

Etapa analítica: Quantificação da biomassa de biofilme de Staphylococcus destacado utilizando violeta de cristal (CV)

Materiais necessários:

• 0Solução de violeta cristal (CV) a .1%
• Etanol a 95% ou ácido acético a 30% (para solubilização)
• Leitor de microplacas com capacidade de leitura a 570 nm
• Placas de microtitulação esterilizadas para coloração

Passos:

1. Preparação da placa de coloração: Transferir 100 µL da suspensão de biofilme destacado de cada poço da placa sonicada para os poços correspondentes de uma placa de microtitulação de 96 poços limpa e estéril. Isto assegura um ambiente claro e uniforme para a coloração.
2. Coloração do biofilme destacado: Adicionar 150 µL de solução de violeta de cristal a 0,1% a cada poço que contenha a suspensão de biofilme destacado. Pipetar suavemente para assegurar uma mistura homogénea da suspensão de biofilme e violeta de cristal.
3. Incubação: Deixar a placa incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos para que o violeta cristal possa corar a biomassa de forma eficaz.
4. Lavagem: Após a incubação, eliminar cuidadosamente a solução de violeta cristal dos poços sem perturbar a biomassa. Lavar cada poço três vezes com solução salina fisiológica estéril para remover a coloração não ligada.
5. Secagem: Deixar a placa secar ao ar livre à temperatura ambiente ou sob um exaustor de fluxo de ar estéril. Evitar o aquecimento, uma vez que pode alterar os resultados.
6. Solubilização: Adicionar 200 µL de etanol a 95% (ou ácido acético a 30%, dependendo das práticas laboratoriais padrão) a cada poço para solubilizar a violeta cristal ligada. Misturar suavemente, pipetando ou agitando a placa durante 10 minutos à temperatura ambiente.
7. Medição: Medir a densidade ótica (DO) da solução de violeta cristal solubilizada a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas.
8. Análise de dados: Subtrair o valor médio de OD570 dos controlos negativos (poços com TSB mas sem inóculo bacteriano) dos poços experimentais para ter em conta a coloração de fundo. Registar e analisar os dados.

Nota: Efetuar a experiência em triplicado para cada condição para garantir a reprodutibilidade. Assegurar o manuseamento correto do violeta de cristal e do etanol, respeitando os protocolos de segurança e eliminação.
 

As principais vantagens da UIP400MTP num relance:

• Processamento de alto rendimento: Concebido especificamente para placas com vários poços, permitindo-lhe processar várias amostras em simultâneo.
• Distribuição ultra-sónica uniforme: Assegura uma intensidade ultra-sónica igual em todos os poços, proporcionando resultados consistentes em todas as amostras.
• Utilizar qualquer placa normalizada: O UIP400MTP pode manusear quaisquer placas de poços múltiplos, placas de Petri e suportes para tubos. Não são necessárias placas proprietárias caras!
• Interface de fácil utilização: Fácil de configurar e controlar, o que o torna uma excelente ferramenta para aumentar a produtividade do laboratório. As definições programáveis e a automatização facilitam a normalização dos processos!