Protocolo de ensaio MBEC utilizando o Sonicator UIP400MTP para placas de 96 poços

O ensaio MBEC é utilizado para determinar a concentração de agentes antimicrobianos necessária para eliminar biofilmes formados em tampas de pinos. Para avaliar a viabilidade do biofilme, os biofilmes devem primeiro ser destacados das tampas de pinos de uma placa de 96 poços. A sonicação é o método mais fiável e eficaz para este descolamento. O sonicador de placas multipoços UIP400MTP foi especificamente concebido para processar placas de ensaio com a máxima eficiência e comodidade, simplificando e acelerando os ensaios MBEC de elevado rendimento.

Sonicação para descolamento de biofilme

A sonicação é um passo crucial nos ensaios de Concentração Mínima de Erradicação de Biofilme (MBEC), permitindo a deslocação eficaz das células de biofilme da sua fixação à superfície. Os biofilmes são comunidades inerentemente estruturadas de microrganismos envoltos numa matriz extracelular, o que os torna significativamente mais resistentes aos agentes antimicrobianos em comparação com as células planctónicas. Durante os ensaios MBEC, a sonicação utiliza ondas ultra-sónicas para gerar cavitação controlada, rompendo a matriz do biofilme e libertando as células incorporadas numa suspensão. Este passo assegura que as células do biofilme estão uniformemente dispersas no meio de recuperação, facilitando avaliações precisas da viabilidade através de métodos de plaqueamento, diluição ou espetrofotometria. Sem uma separação adequada do biofilme, os componentes residuais da matriz podem proteger as células, levando a uma subestimação da eficácia antimicrobiana. Por conseguinte, a sonicação é indispensável para obter valores MBEC fiáveis e reprodutíveis, reflectindo o verdadeiro potencial de erradicação dos agentes testados. O sonicador de placas de poços múltiplos UIP400MTP permite a preparação fácil de amostras de alto rendimento em placas de ensaio.

Protocolo do Ensaio de Concentração Mínima de Erradicação de Biofilme (MBEC)

Passo 1: Formação de biofilme

1. Preparar a suspensão bacteriana:
   Cultivar bactérias em meios adequados até à fase de crescimento logarítmico.
   Diluir a cultura bacteriana até uma densidade ótica definida (por exemplo, OD600 ~0,1).
2. Inocular a placa de 96 poços:
   Adicionar a suspensão bacteriana (por exemplo, 150-200 µL) a cada poço de uma placa de microtitulação padrão de 96 poços.
3. Fixar a tampa da cavilha:
   Colocar a tampa da cavilha na placa inoculada para permitir a formação de biofilme nas superfícies da cavilha.
4. Incubar a placa:
   Incubar a preparação a uma temperatura adequada (por exemplo, 37°C) durante 24-48 horas sem agitação para promover o crescimento do biofilme.

Etapa 2: Tratamento com agentes antimicrobianos

• Preparar soluções antimicrobianas:
  Preparar uma gama de concentrações antimicrobianas em meios frescos.
  Expor os biofilmes a agentes antimicrobianos:
  Retirar a tampa de cavilha da cultura bacteriana e lavá-la com solução salina estéril ou PBS para remover as células planctónicas.
  Colocar a tampa de encaixe numa nova placa de 96 poços que contenha as soluções antimicrobianas.
• Incubar a placa:
  Incubar durante um período definido (por exemplo, 24 horas) para permitir a exposição antimicrobiana.

Passo 3: Sonicação com o Sonicador de Placas de 96 Poços UIP400MTP

O passo de sonicação é fundamental para separar os biofilmes das tampas das cavilhas para avaliar a viabilidade. Siga estes passos para o sonicador UIP400MTP:

1. Preparar a configuração:
   Encher uma placa nova de 96 poços com meio de recuperação (por exemplo, caldo neutralizante ou meio de crescimento novo) em cada poço.
2. Transferir a tampa da cavilha:
   Retirar a tampa da placa de tratamento antimicrobiano.
   Enxaguar a tampa da cavilha em solução salina estéril ou PBS para remover os agentes antimicrobianos residuais.
3. Posicionar a placa e o sonicador:
   Colocar a tampa da cavilha na placa do meio de recuperação.
   Coloque a placa do meio de recuperação na plataforma do sonicador UIP400MTP, certificando-se de que a placa está centrada e estável.
4. Ajustar os parâmetros de sonicação:
   Definir os parâmetros de sonicação no UIP400MTP (as definições podem ser ajustadas ao biofilme):
   Amplitude: 70-100%.
   Tempo de sonicação: 1-3 minutos (ajustar com base na robustez do biofilme) em modo de ciclo.
5. Sonicate:
   Iniciar o processo de sonicação. A vibração ultra-sónica irá desalojar os biofilmes das superfícies dos pinos para o meio de recuperação.
6. Monitorizar o processo:
   Utilize o sensor de temperatura conectável para monitorizar a temperatura da amostra nos poços. O UIP400MTP pode ser ligado a um refrigerador de laboratório para arrefecimento.
7. Tratamento pós-sonicação:
   Transferir imediatamente o meio de recuperação (agora com biofilmes destacados) para uma placa esterilizada nova para análise a jusante.

(A) Placa contendo TSB com 2% de glucose utilizada para a formação de biofilme, recuperação de células e
determinação da CIM e do MBCB; (B) Tampa com pinos para a formação de biofilmes estafilocócicos. determinação da CIM e do MBCB; (B) Tampa com pinos para a formação de biofilmes estafilocócicos.
As células de biofilme formadas nos pinos foram desalojadas por sonicação (Hielscher Ultrasound Technology) durante 5 minutos em placas de 96 poços contendo meio de cultura fresco para recuperação das células.
(Imagem e estudo: ©de Oliveira et al., 2016)

Etapa 4: Avaliação da viabilidade

Placa e cultura de biofilmes destacados:

1. Efetuar diluições em série do meio de recuperação e colocar em placas de ágar para enumerar as unidades formadoras de colónias (CFU).
   Em alternativa, utilizar um ensaio de viabilidade colorimétrico ou baseado na fluorescência.
2. Resultados recorde:
   Determinar a MBEC como a concentração mais baixa de antimicrobiano que erradicou a viabilidade detetável do biofilme.

Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha

Os ultrassons Hielscher são conhecidos pelos seus elevados padrões de qualidade e design. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração harmoniosa dos nossos ultrassons nas instalações industriais. Os sonicadores Hielscher lidam facilmente com condições difíceis e ambientes exigentes.

A Hielscher Ultrasonics é uma empresa certificada pela ISO e dá especial ênfase aos ultrassons de alto desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os ultrassons da Hielscher estão em conformidade com a CE e cumprem os requisitos da UL, CSA e RoHs.

Leia aqui como o UIP400MTP é utilizado para o desprendimento de biofilme como um passo de preparação de amostras durante o protocolo ASTM E2799 para testar a eficácia do desinfetante contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa utilizando o ensaio MBEC.