Protocolo do ensaio MBEC com o sonicador para placas de 96 poços UIP400MTP

O ensaio MBEC é utilizado para determinar a concentração de agentes antimicrobianos necessária para eliminar biofilmes formados em tampas com pinos. Para avaliar a viabilidade dos biofilmes, estes devem primeiro ser destacados das tampas com pinos de uma placa de 96 poços. A sonicação é o método mais fiável e eficiente para este destacamento. O sonicador para placas multipoços UIP400MTP foi especificamente concebido para processar placas de ensaio com a máxima eficiência e comodidade, simplificando e acelerando os ensaios MBEC de elevada capacidade de processamento.

Sonicação para o destacamento de biofilmes

A sonicação é uma etapa crucial nos ensaios de concentração mínima de erradicação de biofilmes (MBEC), permitindo o desprendimento eficaz das células do biofilme da superfície à qual estão aderidas. Os biofilmes são comunidades de microrganismos intrinsecamente estruturadas e envolvidas numa matriz extracelular, o que os torna significativamente mais resistentes aos agentes antimicrobianos do que as células planctónicas. Durante os ensaios MBEC, a sonicação utiliza ondas ultrassónicas para gerar cavitação controlada, desestruturando a matriz do biofilme e libertando as células nela incorporadas para uma suspensão. Esta etapa assegura que as células do biofilme ficam uniformemente dispersas no meio de recuperação, facilitando avaliações precisas da viabilidade através de sementeira em placas, diluição ou métodos espectrofotométricos. Sem um destacamento adequado do biofilme, os componentes residuais da matriz poderiam proteger as células, levando à subestimação da eficácia antimicrobiana. Por conseguinte, a sonicação é indispensável para obter valores de MBEC fiáveis e reprodutíveis, que refletem o verdadeiro potencial de erradicação dos agentes testados. O sonicador para placas multipoços UIP400MTP permite preparar facilmente amostras em placas de ensaio com elevada capacidade de processamento.

Protocolo do ensaio de concentração mínima de erradicação de biofilmes (MBEC)

Etapa 1: Formação do biofilme

1. Prepare a suspensão bacteriana:
   Cultive as bactérias em meios adequados até à fase de crescimento logarítmico.
   Dilua a cultura bacteriana até uma densidade ótica definida (por exemplo, OD600 ~0,1).
2. Inocule a placa de 96 poços:
   Adicione a suspensão bacteriana (por exemplo, 150–200 µL) a cada poço de uma placa de microtitulação padrão de 96 poços.
3. Coloque a tampa com pinos:
   Coloque a tampa com pinos sobre a placa inoculada para permitir a formação de biofilmes nas superfícies dos pinos.
4. Incube a placa:
   Incube o conjunto a uma temperatura adequada (por exemplo, 37°C) durante 24–48 horas, sem agitação, para promover o crescimento do biofilme.

Etapa 2: Tratamento com agentes antimicrobianos

• Prepare as soluções antimicrobianas:
  Prepare uma série de concentrações de antimicrobianos em meios frescos.
  Exponha os biofilmes aos agentes antimicrobianos:
  Retire a tampa com pinos da cultura bacteriana e lave-a com solução salina estéril ou PBS para remover as células planctónicas.
  Coloque a tampa com pinos numa nova placa de 96 poços que contenha as soluções antimicrobianas.
• Incube a placa:
  Incube durante um período definido (por exemplo, 24 horas) para permitir a exposição aos antimicrobianos.

Etapa 3: Sonicação com o sonicador para placas de 96 poços UIP400MTP

A etapa de sonicação é crucial para destacar os biofilmes das tampas com pinos e avaliar a sua viabilidade. Siga estas etapas para o sonicador UIP400MTP:

1. Prepare o conjunto:
   Encha cada poço de uma nova placa de 96 poços com meio de recuperação (por exemplo, caldo neutralizante ou meio de crescimento fresco).
2. Transfira a tampa com pinos:
   Retire a tampa com pinos da placa de tratamento antimicrobiano.
   Lave a tampa com pinos com solução salina estéril ou PBS para remover os agentes antimicrobianos residuais.
3. Posicione a placa e o sonicador:
   Coloque a tampa com pinos na placa com meio de recuperação.
   Coloque a placa com meio de recuperação na plataforma do sonicador UIP400MTP, assegurando que fica centrada e estável.
4. Ajuste os parâmetros de sonicação:
   Defina os parâmetros de sonicação no UIP400MTP (as definições podem ser ajustadas ao biofilme):
   Amplitude: 70–100%.
   Tempo de sonicação: 1–3 minutos (ajuste em função da robustez do biofilme) em modo de ciclos.
5. Proceda à sonicação:
   Inicie o processo de sonicação. A vibração ultrassónica desprenderá os biofilmes das superfícies dos pinos para o meio de recuperação.
6. Monitorize o processo:
   Utilize o sensor de temperatura conectável para monitorizar a temperatura das amostras nos poços. O UIP400MTP pode ser ligado a um refrigerador de laboratório para arrefecimento.
7. Manuseamento após a sonicação:
   Transfira imediatamente o meio de recuperação (que contém agora os biofilmes destacados) para uma nova placa estéril para análise subsequente.

(A) Placa contendo TSB com 2% de glucose, utilizada para a formação de biofilmes, recuperação celular e
determinação de MIC e MBCB; (B) Tampa com pinos para a formação de biofilmes estafilocócicos. determinação de MIC e MBCB; (B) Tampa com pinos para a formação de biofilmes estafilocócicos.
As células dos biofilmes formados nos pinos foram desprendidas por sonicação (Hielscher Ultrasound Technology) durante 5 min em placas de 96 poços contendo meio de cultura fresco para recuperação das células.
(Imagem e estudo: ©de Oliveira et al., 2016)

Etapa 4: Avaliação da viabilidade

Semeie em placas e cultive os biofilmes destacados:

1. Efetue diluições seriadas do meio de recuperação e semeie em ágar para contar as unidades formadoras de colónias (CFU).
   Em alternativa, utilize um ensaio de viabilidade colorimétrico ou baseado em fluorescência.
2. Registe os resultados:
   Determine a MBEC como a concentração mais baixa de antimicrobiano que eliminou a viabilidade detetável do biofilme.

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Leia aqui como o UIP400MTP é utilizado para o destacamento de biofilmes como etapa de preparação de amostras no protocolo ASTM E2799 para testar a eficácia de desinfetantes contra biofilmes de Pseudomonas aeruginosa utilizando o ensaio MBEC.