Protocolo do ensaio de concentração mínima inibitória (MIC)

O ensaio de concentração mínima inibitória (MIC) baseado em biofilmes é um método essencial para avaliar a eficácia dos agentes antimicrobianos contra microrganismos associados a biofilmes, que apresentam uma resistência acrescida devido à sua matriz extracelular protetora. Uma etapa crucial deste ensaio é o desprendimento das estruturas do biofilme para libertar as células incorporadas e permitir uma avaliação precisa da viabilidade. O sonicador para placas multipoços UIP400MTP facilita este processo ao utilizar ultrassons focados para gerar cavitação controlada, desprendendo eficazmente as células do biofilme e dispersando-as numa suspensão uniforme. Esta rutura precisa e reprodutível do biofilme aumenta a fiabilidade e a capacidade de processamento dos ensaios MIC, tornando o UIP400MTP uma ferramenta essencial para o avanço da investigação sobre biofilmes.

Por que devo utilizar a sonicação durante os ensaios MIC?

• Dados precisos e reprodutíveis: Obtenha suspensões celulares uniformes que eliminam a proteção proporcionada pela matriz, garantindo que as suas contagens de colónias e leituras de densidade ótica refletem efetivamente a eficácia antimicrobiana.
• Eficiência com elevada capacidade de processamento: Processe simultaneamente uma placa inteira de 96 poços em apenas 1–3 minutos, substituindo a raspagem manual lenta e inconsistente por um fluxo de trabalho otimizado.
• Viabilidade celular preservada: Desprenda suavemente as células incorporadas sem os danos físicos causados pela raspagem, mantendo taxas de sobrevivência mais elevadas para cálculos fiáveis de MIC/MBEC.
• Risco nulo de contaminação cruzada: Beneficie de uma configuração sem contacto com sonotrodo em forma de copo que trata todos os poços uniformemente, sem que as sondas toquem nas amostras ou nos poços individuais.
• Conformidade com as normas: Alinhe a sua metodologia com protocolos validados do setor, como o ASTM E2799-22, conferindo aos seus dados maior credibilidade para fins regulamentares ou de publicação.
• Rastreio fiável de fármacos e tratamentos: Confie nos seus resultados de suscetibilidade para tomar decisões mais informadas sobre a eficácia antimicrobiana, a caracterização dos perfis de resistência ou o desenvolvimento terapêutico.

Sonicação para o desprendimento de biofilmes

O ensaio MIC baseado em biofilmes mede habitualmente a viabilidade bacteriana ou a inibição do crescimento através de métodos como a sementeira em placa, a contagem de colónias ou as medições de densidade ótica. A sonicação é uma etapa crítica nos ensaios MIC baseados em biofilmes quando se avalia a suscetibilidade antimicrobiana de microrganismos associados a biofilmes. A sua principal função é desprender e dispersar as células incorporadas na matriz do biofilme numa suspensão uniforme para uma análise precisa.
Os biofilmes são significativamente mais resistentes aos agentes antimicrobianos do que as células planctónicas, pelo que um desprendimento adequado é fundamental para uma análise precisa. Durante este processo, as ondas ultrassónicas geram cavitação controlada, desintegrando a matriz do biofilme e libertando as células incorporadas numa suspensão uniforme no meio de recuperação. Esta etapa permite avaliar com precisão a viabilidade das células dispersas a partir do biofilme através de métodos como a sementeira em placa, a diluição e a contagem de colónias. A rutura adequada do biofilme por sonicação impede que os componentes residuais da matriz protejam as células, o que, de outro modo, poderia levar a uma subestimação da atividade antimicrobiana. O sonicador para placas multipoços UIP400MTP é particularmente adequado para esta finalidade, oferecendo condições de sonicação precisas e reprodutíveis para garantir uma preparação fiável de placas de ensaio com elevada capacidade de processamento.

Por que é necessária a sonicação nos ensaios de concentração mínima inibitória baseados em biofilmes

Para as medições de viabilidade e a contagem de células, é necessário um desprendimento e uma dispersão completos e fiáveis das células individuais. O UIP400MTP promove um desprendimento uniforme do biofilme e uma dispersão celular sem danos, permitindo obter resultados de ensaio robustos.

• Complexidade dos biofilmes: Os biofilmes são comunidades microbianas estruturadas envolvidas numa matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS), que protege os microrganismos e os torna mais resistentes aos agentes antimicrobianos.
• Dispersão uniforme: Para medir com precisão a viabilidade das células incorporadas no biofilme ou a sua suscetibilidade aos antimicrobianos, o biofilme deve primeiro ser desprendido e desintegrado numa suspensão homogénea.

Protocolo do ensaio de concentração mínima inibitória baseado em biofilmes

O ensaio de concentração mínima inibitória (MIC) determina a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano necessária para inibir o crescimento visível de microrganismos. Este protocolo foi concebido para microrganismos associados a biofilmes, utilizando o sonicador para placas multipoços UIP400MTP para a rutura do biofilme.

Etapa 1: Preparação do inóculo bacteriano

1. Prepare a suspensão bacteriana:
   Cultive as bactérias em meios adequados até à fase logarítmica intermédia.
   Dilua a cultura para obter uma densidade celular padronizada (por exemplo, padrão 0,5 de McFarland ou OD600 ~0,1).
2. Prepare as soluções antimicrobianas:
   Dilua o agente antimicrobiano num meio adequado para criar uma gama de concentrações (por exemplo, diluições seriadas de fator dois).
3. Distribua pela placa de 96 poços:
   Adicione as soluções antimicrobianas aos poços de uma placa padrão de 96 poços, com um volume final por poço de ~150–200 µL.
   Inclua controlos de crescimento (sem antimicrobiano) e controlos de esterilidade (sem inóculo bacteriano).

Etapa 2: Formação de biofilme na tampa com pinos

• Coloque a tampa com pinos:
  Coloque a tampa especializada com pinos sobre os poços inoculados, garantindo que os pinos ficam totalmente submersos na suspensão bacteriana.
• Incube a placa:
  Incube à temperatura adequada (por exemplo, 37°C) durante um período especificado (por exemplo, 24 horas), em condições estáticas, para permitir a formação de biofilme nos pinos.

Etapa 3: Exposição a antimicrobianos

• Enxague os pinos:
  Retire a tampa com pinos da suspensão bacteriana e enxague suavemente em solução salina estéril ou PBS para remover as células planctónicas pouco aderentes.
• Exponha aos antimicrobianos:
  Transfira a tampa com pinos para uma nova placa de 96 poços contendo as diluições antimicrobianas preparadas anteriormente.
  Incube durante um período definido (por exemplo, 24 horas), em condições estáticas, para permitir que o agente antimicrobiano atue sobre os biofilmes.

Etapa 4: Sonicação com o sonicador para microplacas UIP400MTP

A etapa de sonicação é fundamental para desprender os biofilmes das tampas com pinos e avaliar a viabilidade. Siga estas etapas para o sonicador UIP400MTP:

1. Prepare a montagem:
   Encha cada poço de uma nova placa de 96 poços com meio de recuperação (por exemplo, caldo neutralizante ou meio de crescimento estéril).
2. Transfira a tampa com pinos:
   Retire a tampa com pinos da placa de tratamento antimicrobiano.
   Enxague a tampa com pinos em solução salina estéril ou PBS para remover os agentes antimicrobianos residuais.
3. Posicione a placa no sonicador:
   Coloque a tampa com pinos na placa com meio de recuperação.
   Coloque a placa com meio de recuperação no sonicador UIP400MTP, garantindo que fica centrada e estável, conforme descrito no manual.
4. Ajuste os parâmetros de sonicação:
   Defina os parâmetros de sonicação no UIP400MTP (as definições podem ser ajustadas ao biofilme):
   Amplitude: 70–100%.
   Tempo de sonicação: 1–3 minutos (ajuste em função da estrutura do biofilme) em modo cíclico.
5. Proceda à sonicação:
   Inicie o processo de sonicação. As ondas ultrassónicas irão desintegrar a matriz do biofilme e desprender as células para o meio de recuperação.
6. Monitorize o processo:
   Utilize o sensor de temperatura conectável para monitorizar a temperatura das amostras nos poços. O UIP400MTP pode ser ligado a um refrigerador de laboratório para arrefecimento.
7. Manuseamento após a sonicação:
   Transfira imediatamente o meio de recuperação contendo os biofilmes desprendidos para uma nova placa estéril para análise subsequente.

(A) Placa contendo TSB com 2% de glucose utilizada para a formação de biofilme, a recuperação celular e a determinação da MIC e da MBEC; (B) Tampa com pinos para a formação de biofilmes estafilocócicos.
As células do biofilme formado nos pinos foram desprendidas por sonicação (Hielscher Ultrasound Technology) durante 5 min em placas de 96 poços contendo meio de cultura fresco para a recuperação das células.
(Imagem e estudo: ©de Oliveira et al., 2016)

Etapa 4: Avaliação da viabilidade

Semeie em placa e cultive os biofilmes desprendidos:

1. Efetue diluições seriadas do meio de recuperação e semeie em ágar para contar as unidades formadoras de colónias (CFU).
2. Avalie a MIC:
   Determine a MIC como a concentração antimicrobiana mais baixa que inibe completamente o crescimento microbiano visível no meio de recuperação.

MIC – Concentração mínima inibitória: Exemplo de uma placa de microtitulação e interpretação dos resultados de microdiluição.
(Estudo e imagem: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Quem beneficia da sonicação durante os ensaios MIC?

• Fabricantes de dispositivos médicos: Para testar a eficácia dos revestimentos de superfície e validar protocolos de limpeza de dispositivos propensos à formação de biofilmes.
• Microbiologistas clínicos: Para diagnosticar com precisão infeções associadas a implantes (como a PJI), recuperando bactérias de componentes de dispositivos médicos.
• Responsáveis pelo desenvolvimento farmacêutico: Para avaliar a eficácia de novos agentes antimicrobianos contra agentes patogénicos resistentes incorporados em biofilmes.
• Investigadores académicos: Para realizar estudos reprodutíveis com elevada capacidade de processamento sobre a biologia dos biofilmes e os mecanismos de resistência antimicrobiana.
• Equipas de controlo de qualidade industrial: Para avaliar a bioincrustação e a eficácia dos desinfetantes em ambientes industriais (por exemplo, utilizando as normas ASTM E2799-22).

Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha

Os sonicadores Hielscher são reconhecidos pelos seus padrões de qualidade e conceção do mais alto nível. A robustez e a facilidade de utilização permitem a integração simples dos nossos sonicadores em instalações industriais. Os sonicadores Hielscher lidam facilmente com condições adversas e ambientes exigentes.

A Hielscher Ultrasonics é uma empresa com certificação ISO e dá especial ênfase aos sonicadores de elevado desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os sonicadores Hielscher estão em conformidade com a CE e cumprem os requisitos de UL, CSA e RoHs.

Leia aqui como o UIP400MTP é utilizado para o desprendimento de biofilmes no protocolo ASTM E2799 – Teste da eficácia de desinfetantes contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa utilizando o ensaio MBEC.