Protocolo de ensaio de concentração inibitória mínima (CIM)

O ensaio de Concentração Inibitória Mínima (CIM) com base em biofilme é um método essencial para avaliar a eficácia dos agentes antimicrobianos contra microrganismos associados a biofilme, que apresentam uma resistência acrescida devido à sua matriz extracelular protetora. Um passo crucial neste ensaio é a rutura das estruturas do biofilme para libertar as células incorporadas para uma avaliação exacta da viabilidade. O sonicador de placas com vários poços UIP400MTP facilita este processo, empregando ultra-sons focalizados para gerar cavitação controlada, separando eficazmente as células do biofilme e dispersando-as numa suspensão uniforme. Esta rutura precisa e reprodutível do biofilme aumenta a fiabilidade e o rendimento dos ensaios de CIM, tornando o UIP400MTP uma ferramenta essencial para o avanço da investigação do biofilme.

Sonicação para descolamento de biofilme

O Ensaio de CIM com base em biofilme mede normalmente a viabilidade bacteriana ou a inibição do crescimento utilizando métodos como o plaqueamento, a contagem de colónias ou medições de densidade ótica. A sonicação é um passo crítico nos ensaios de CIM baseados em biofilme quando se avalia a suscetibilidade antimicrobiana de microrganismos associados a biofilme. A sua função principal é destacar e dispersar as células incorporadas na matriz do biofilme numa suspensão uniforme para uma análise precisa.
Os biofilmes são significativamente mais resistentes aos agentes antimicrobianos do que as células planctónicas, o que torna a separação adequada fundamental para uma análise precisa. Durante este processo, as ondas ultra-sónicas geram uma cavitação controlada, rompendo a matriz do biofilme e libertando as células incorporadas numa suspensão uniforme no meio de recuperação. Este passo permite avaliações precisas da viabilidade das células dispersas no biofilme através de métodos como o plaqueamento, a diluição e a contagem de colónias. A rutura adequada do biofilme através da sonicação impede que os componentes residuais da matriz protejam as células, o que, de outra forma, poderia levar a uma subestimação da atividade antimicrobiana. O sonicador de placas multipoços UIP400MTP é particularmente adequado para este fim, oferecendo condições de sonicação precisas e reprodutíveis para garantir uma preparação fiável e de elevado rendimento das placas de ensaio.

Porque é que a sonicação é necessária em ensaios de concentração inibitória mínima baseados em biofilme

Para medições de viabilidade e contagem de células, é necessário um descolamento e dispersão completos e fiáveis de células individuais. O UIP400MTP promove um descolamento uniforme e não prejudicial do biofilme e a dispersão das células para resultados robustos do ensaio.

• Complexidade do biofilme: Os biofilmes são comunidades microbianas estruturadas envoltas numa matriz de substância polimérica extracelular (EPS), que protege os microrganismos e os torna mais resistentes aos agentes antimicrobianos.
• Dispersão uniforme: Para medir com precisão a viabilidade das células incorporadas no biofilme ou a sua suscetibilidade aos antimicrobianos, o biofilme deve primeiro ser desalojado e dividido numa suspensão homogénea.

Protocolo de ensaio de concentração inibitória mínima com base em biofilme

O ensaio de Concentração Inibitória Mínima (CIM) determina a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano necessária para inibir o crescimento visível de microrganismos. Este protocolo foi concebido para microrganismos associados a biofilmes, utilizando o sonicador de placas multipoços UIP400MTP para a rutura de biofilmes.

Passo 1: Preparação do inóculo bacteriano

1. Preparar a suspensão bacteriana:
   Cultivar as bactérias em meios adequados até à fase logarítmica média.
   Diluir a cultura para obter uma densidade celular normalizada (por exemplo, 0,5 McFarland standard ou OD600 ~0,1).
2. Preparar soluções antimicrobianas:
   Diluir o agente antimicrobiano num meio adequado para criar uma gama de concentrações (por exemplo, diluições em série de duas vezes).
3. Distribuir na placa de 96 poços:
   Adicionar as soluções antimicrobianas aos poços de uma placa padrão de 96 poços, com um volume final de ~150-200 µL.
   Incluir controlos de crescimento (sem antimicrobianos) e controlos de esterilidade (sem inóculo bacteriano).

Etapa 2: Formação de biofilme na tampa do Peg

• Fixar a tampa da cavilha:
  Colocar a tampa de cavilha especializada nos poços inoculados, assegurando que as cavilhas estão completamente submersas na suspensão bacteriana.
• Incubar a placa:
  Incubar à temperatura adequada (por exemplo, 37°C) durante um período especificado (por exemplo, 24 horas) em condições estáticas para permitir a formação de biofilme nas cavilhas.

Etapa 3: Exposição antimicrobiana

• Passar as cavilhas por água:
  Retirar a tampa da suspensão bacteriana e lavar suavemente em solução salina estéril ou PBS para remover as células planctónicas soltas.
• Exposição a agentes antimicrobianos:
  Transferir a tampa de cavilha para uma nova placa de 96 alvéolos que contenha as diluições antimicrobianas preparadas anteriormente.
  Incubar durante um período definido (por exemplo, 24 horas) em condições estáticas para permitir que o agente antimicrobiano actue sobre os biofilmes.

Passo 4: Sonicação com o Sonicador de Microplacas UIP400MTP

O passo de sonicação é fundamental para separar os biofilmes das tampas das cavilhas para avaliar a viabilidade. Siga estes passos para o sonicador UIP400MTP:

1. Preparar a configuração:
   Encher uma placa nova de 96 poços com meio de recuperação (por exemplo, caldo neutralizante ou meio de crescimento estéril) em cada poço.
2. Transferir a tampa da cavilha:
   Retirar a tampa da placa de tratamento antimicrobiano.
   Enxaguar a tampa da cavilha em solução salina estéril ou PBS para remover os agentes antimicrobianos residuais.
3. Colocar a placa no sonicador:
   Colocar a tampa da cavilha na placa do meio de recuperação.
   Colocar a placa de meio de recuperação no sonicador UIP400MTP, assegurando que a placa fica centrada e estável, tal como descrito no manual.
4. Ajustar os parâmetros de sonicação:
   Definir os parâmetros de sonicação no UIP400MTP (as definições podem ser ajustadas ao biofilme):
   Amplitude: 70-100%.
   Tempo de sonicação: 1-3 minutos (ajustar com base na estrutura do biofilme) em modo de ciclo.
5. Sonicate:
   Iniciar o processo de sonicação. As ondas ultra-sónicas irão romper a matriz do biofilme e deslocar as células para o meio de recuperação.
6. Monitorizar o processo:
   Utilize o sensor de temperatura conectável para monitorizar a temperatura da amostra nos poços. O UIP400MTP pode ser ligado a um refrigerador de laboratório para arrefecimento.
7. Tratamento pós-sonicação:
   Transferir imediatamente o meio de recuperação que contém os biofilmes destacados para uma placa esterilizada nova para análise subsequente.

(A) Placa contendo TSB com 2% de glucose utilizada para a formação de biofilmes, recuperação de células e determinação da CIM e da MBEC; (B) Tampa com pinos para a formação de biofilmes estafilocócicos.
As células de biofilme formadas nos pinos foram desalojadas por sonicação (Hielscher Ultrasound Technology) durante 5 minutos em placas de 96 poços contendo meio de cultura fresco para recuperação das células.
(Imagem e estudo: ©de Oliveira et al., 2016)

Etapa 4: Avaliação da viabilidade

Placa e cultura de biofilmes destacados:

1. Efetuar diluições em série do meio de recuperação e colocar em placas de ágar para enumerar as unidades formadoras de colónias (CFU).
2. Avaliar o MIC:
   Determinar a CIM como a concentração antimicrobiana mais baixa que inibe completamente o crescimento microbiano visível no meio de recuperação.

CIM Concentração inibitória mínima: Exemplo de placa de microtitulação e interpretação dos resultados da microdiluição.
(Estudo e imagem: ©Jaskiewicz et al. 2019)

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Leia aqui como o UIP400MTP é utilizado para o descolamento de biofilme no protocolo ASTM E2799 – Teste da eficácia do desinfetante contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa utilizando o ensaio MBEC.