Desparafinização e extração de proteínas de FFPE
Facilite a extração de proteínas de cortes de tecido fixado em formalina e incluído em parafina (FFPE) utilizando uma combinação otimizada de desparafinização, solubilização e sonicação com um sonicador ultrassónico multitubos VialTweeter. Este protocolo permite a análise proteómica subsequente baseada em espectrometria de massa e é compatível com fluxos de trabalho de purificação por SP3 e digestão enzimática.
Este procedimento operacional padrão (SOP) destina-se ao pessoal de laboratório envolvido na análise proteómica de amostras de tecido FFPE utilizando sonicação de elevado desempenho. Está otimizado para até dez amostras FFPE processadas em paralelo com o sonicador multitubos VialTweeter.
Sonicador VialTweeter para a sonicação simultânea de 10 amostras, por exemplo, para lise e extração de proteínas de amostras FFPE
Protocolo: extração de proteínas de amostras FFPE com o VialTweeter
Materiais e reagentes
Reagentes
- Xileno (grau para histologia)
- Etanol (absoluto 96%)
- Tampão de lise:
- Inibidor de proteases (opcional; por exemplo, cOmplete™ mini sem EDTA)
Cloridrato de guanidina 6 M
Tris-HCl 50 mM, pH 8,5
TCEP 10 mM (tris(2-carboxietil)fosfina)
CAA 40 mM (2-cloroacetamida)
Equipamento
- Sonicador ultrassónico multitubos VialTweeter
- Tubos de microcentrífuga de baixa adsorção de 1,5 mL ou 2,0 mL
- Bloco de aquecimento ou incubadora (regulações de 95°C e 80°C)
- Microcentrífuga
- Termomisturador (opcional, mas recomendado)
Quantidade de amostra
- 1–2 cortes de tecido FFPE com 10 µm de espessura por amostra (ou seja, por frasco)
- Um total de ~100 µg de tecido por amostra (ou seja, por frasco)
OU
Nota: utilize lâminas novas para a microtomia, para minimizar a contaminação por resíduos de parafina.
Procedimento
- Desparafinização
- Transfira os cortes FFPE para tubos de microcentrífuga de baixa adsorção.
- Adicione 1 mL de xileno e agite brevemente em vórtex.
- Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugue a 14 000 × g durante 2 minutos; descarte o sobrenadante.
- Repita a lavagem com xileno mais uma vez (passos 2–4).
- Lave o sedimento com 1 mL de etanol a 96%, agite em vórtex e, em seguida, centrifugue a 14 000 × g durante 2 minutos. Descarte o sobrenadante.
- Repita a lavagem com etanol mais uma vez (num total de 2 lavagens com etanol).
- Deixe o sedimento secar ao ar durante 10 minutos à temperatura ambiente, com as tampas abertas, para evaporar o etanol residual.
- Extração de proteínas e sonicação
- Adicione 200 µL de tampão de lise a cada sedimento seco.
Nota: embora o sonicador comporte até 1 mL, 200 µL é o volume ideal para o processamento subsequente. - Misture por agitação em vórtex ou pipetagem suave.
- Adicione 200 µL de tampão de lise a cada sedimento seco.
- Primeira incubação térmica
- Incube os tubos a 95 °C durante 30 min, com agitação a 400 rpm, utilizando um termomisturador ou bloco de aquecimento.
- Deixe as amostras arrefecer à temperatura ambiente durante 5 min.
- Primeira sonicação com o VialTweeter
- Coloque os tubos no VialTweeter.
- Configure o VialTweeter UP200St com os valores abaixo e efetue a sonicação.
- Segunda incubação térmica
Retire os tubos e incube novamente a 95 °C durante 15 min, a 400 rpm. - Segunda sonicação
Repita a sonicação no VialTweeter com as mesmas definições (indicadas acima) durante mais 10 ciclos (15 min no total). - Clarificação do lisado
- Centrifugue as amostras a 13 000 × g durante 10 min a 23°C (temperatura ambiente).
- Recolha cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo Eppendorf Safe-lock de 2,0 mL. Evite perturbar o sedimento.
- Processamento subsequente
O lisado está agora pronto para a purificação por SP3 e a digestão enzimática.
• Defina a amplitude (A) para 100%
• Defina o modo de pulsação (C) para 100%
• Temporizador de períodos: ligado
• Tempo ligado: 60s
• Tempo desligado: 30s
• Valor limite: 15 min (corresponde a 10 ciclos)
(Nota de cálculo: (60 s ligado + 30 s desligado) × 10 ciclos = 900 s = 15 min)
Hielscher VialTweeter com 10 tubos Eppendorf
Notas e boas práticas
- O risco de sobreaquecimento durante a sonicação é reduzido através de ciclos programados de ligação/desligação.
- Evite a agitação em vórtex após a sonicação para prevenir a agregação de proteínas.
Eliminação de resíduos e segurança
A tabela abaixo dá uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos sonicadores ultrassónicos de dimensões laboratoriais:
| Dispositivos recomendados | Volume por lote | Caudal |
|---|---|---|
| Sonicador para placas de 96 poços UIP400MTP | placas multipoços / de microtitulação | n.a. |
| CupHorn ultrassónico | CupHorn para frascos ou copo de precipitação | n.a. |
| GDmini2 | microrreator ultrassónico de fluxo | n.a. |
| VialTweeter | 0,5 a 1,5mL | n.a. |
| UP100H | 1 a 500mL | 10 a 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St | 10 a 1000mL | 20 a 200mL/min |
| UP400St | 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min |
| Agitador de peneiros ultrassónico | n.a. | n.a. |
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassónicos de elevado desempenho para aplicações de mistura, dispersão, emulsificação e extração à escala laboratorial, piloto e industrial.
Bibliografia / Referências
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Perguntas frequentes
Porque são as amostras de tecido fixadas como FFPE?
A preservação por fixação em formalina e inclusão em parafina (FFPE) estabiliza a morfologia dos tecidos e as estruturas das proteínas através da formação de ligações cruzadas covalentes por ação do formaldeído. A inclusão em parafina permite o armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente, mantendo a integridade histológica e molecular para análises retrospetivas.
Como desparafinizar amostras FFPE?
A desparafinização envolve lavagens sequenciais com solventes para remover a parafina: normalmente, duas incubações com xileno, seguidas de duas lavagens com etanol (96%). Após a centrifugação e a secagem, o tecido está pronto para a extração subsequente. Este processo restabelece a acessibilidade da amostra para a lise e a digestão enzimática.
Qual é a finalidade da incubação térmica?
A incubação térmica consiste na exposição controlada de uma amostra a uma temperatura definida durante um período específico, para induzir alterações bioquímicas ou físicas. Em proteómica, é habitualmente utilizada para desnaturar proteínas, reverter ligações cruzadas formadas pelo formaldeído em tecidos FFPE ou aumentar a eficácia do tampão de lise. A temperatura e a duração são parâmetros críticos, ajustados à reação pretendida ou ao tipo de amostra.
O que é a digestão SP3?
A preparação de amostras num único recipiente, melhorada por fase sólida (SP3, Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation), é um fluxo de trabalho de proteómica baseado em esferas. Utiliza esferas paramagnéticas para ligar proteínas, permitindo uma purificação e concentração eficientes, bem como a digestão enzimática nas esferas em condições desnaturantes. A SP3 minimiza a perda de amostra e é altamente compatível com amostras de quantidade inicial reduzida e amostras FFPE.
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassónicos de elevado desempenho de dimensões laboratoriais a industriais.