Desparafinização e extração de proteínas de FFPE
Facilitar a extração de proteínas a partir de secções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) utilizando uma combinação optimizada de desparafinização, solubilização e sonicação com um ultrassom VialTweeter multi-tubo. Este protocolo suporta proteómica baseada em espetrometria de massa a jusante e é compatível com a limpeza SP3 e fluxos de trabalho de digestão enzimática.
Este PON destina-se ao pessoal de laboratório envolvido na análise proteómica de amostras de tecido FFPE utilizando a sonicação de alto desempenho. Está optimizado para um máximo de dez amostras FFPE processadas em paralelo utilizando o VialTweeter Multi-Tube Sonicator.
Sonicador VialTweeter para a sonicação simultânea de 10 amostras, por exemplo, para lise e extração de proteínas de amostras FFPE
Protocolo: Extração de proteínas de amostras FFPE utilizando o VialTweeter
Materiais e reagentes
Reagentes
- Xileno (grau histológico)
- Etanol (absoluto 96%)
- Tampão de lise:
- Inibidor da protease (opcional; por exemplo, cOmplete™ mini sem EDTA)
6 M Cloridrato de guanidina
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfina)
40 mM CAA (2-Cloroacetamida)
Equipamento
- Ultrasonicador multitubos VialTweeter
- Tubos de microcentrífuga de baixa aglutinação de 1,5 ml ou 2,0 ml
- Bloco térmico ou incubadora (regulação 95°C e 80°C)
- Microcentrifugadora
- Batedeira (opcional mas recomendada)
Entrada de amostra
- 1-2 secções de tecido FFPE com 10 µm de espessura por amostra (ou seja, por frasco)
- Um total de ~100 µg de tecido por amostra (ou seja, por frasco)
OU
Nota: Utilizar lâminas novas para a microtomia para minimizar a contaminação com resíduos de parafina.
Procedimento
- desparafinização
- Transferir as secções FFPE para tubos de microcentrifugação de baixa aglutinação.
- Adicionar 1 mL de xileno, agitar brevemente no vórtex.
- Incubar 10 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar a 14 000 × g durante 2 minutos; deitar fora o sobrenadante.
- Repetir a lavagem com xileno mais uma vez (passos 2-4).
- Lavar o sedimento com 1 mL de etanol a 96%, agitar em vórtice e centrifugar a 14 000 × g durante 2 minutos. Eliminar o sobrenadante.
- Repetir a lavagem com etanol mais uma vez (total de 2 lavagens com etanol).
- Secar o sedimento ao ar durante 10 minutos à temperatura ambiente, com as tampas abertas, para evaporar o etanol residual.
- Extração de proteínas e sonicação
- Adicionar 200 µL de tampão de lise a cada sedimento seco.
Nota: Embora o sonicador possa acomodar até 1 mL, 200 µL é o ideal para o processamento a jusante. - Misturar por agitação em vórtex ou pipetagem suave.
- Adicionar 200 µL de tampão de lise a cada sedimento seco.
- Primeira Incubação Térmica
- Incubar os tubos a 95 °C durante 30 minutos, com agitação a 400 rpm, utilizando um termomixer ou um bloco térmico.
- Deixar as amostras arrefecer à temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Primeira Sonicação com o VialTweeter
- Colocar os tubos no VialTweeter.
- Definir o VialTweeter UP200St para os valores abaixo e sonicar.
- Segunda Incubação Térmica
Retirar os tubos e incubar novamente a 95 °C durante 15 min, 400 rpm. - Segunda Sonicação
Repetir a sonicação no VialTweeter utilizando as mesmas definições (como acima) durante mais 10 ciclos (15 min no total). - Clarificação do lisado
- Centrifugar as amostras a 13.000 × g durante 10 minutos a 23°C (temperatura ambiente).
- Recolher cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo Eppendorf Safe-lock de 2,0 ml. Evitar perturbar o pellet.
- Processamento a jusante
O lisado está agora pronto para a limpeza SP3 e para a digestão enzimática.
- Definir a Amplitude (A) para 100%
- Colocar o modo de pulsação (C) a 100%
- Relógio de ponto: Ligado
- Pontualidade: 60s
- Tempo de desativação: 30s
- Valor limite: 15 min (corresponde a 10 ciclos)
(Nota de cálculo: (60 s ligado + 30 s desligado) × 10 ciclos = 900 s = 15 min)
Hielscher VialTweeter com 10 tubos Eppendorf
Notas e boas práticas
- O risco de sobreaquecimento durante a sonicação é atenuado pelo ciclo ON/OFF programado.
- Evitar a agitação em vórtex após a sonicação para evitar a agregação de proteínas.
Eliminação de resíduos e segurança
A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultrassons de laboratório:
| Dispositivos recomendados | Volume do lote | caudal |
|---|---|---|
| Sonicador de placas de 96 poços UIP400MTP | placas multipoços / microtitulação | n.d. |
| CupHorn ultrassónico | CupHorn para frascos ou copo | n.d. |
| GDmini2 | reator de microfluxo ultrassónico | n.d. |
| VialTweeter | 0.5 a 1,5mL | n.d. |
| UP100H | 1 a 500mL | 10 a 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St | 10 a 1000mL | 20 a 200mL/min |
| UP400ST | 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min |
| Agitador de peneiras por ultra-sons | n.d. | n.d. |
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultra-sónicos de alto desempenho para aplicações de mistura, dispersão, emulsificação e extração à escala laboratorial, piloto e industrial.
Literatura / Referências
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
perguntas frequentes
Porque é que as amostras de tecido são fixadas como FFPE?
A preservação de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina (FFPE) estabiliza a morfologia dos tecidos e as estruturas proteicas através da formação de ligações cruzadas covalentes via formaldeído. A inclusão em parafina permite o armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente, mantendo a integridade histológica e molecular para análises retrospectivas.
Como é que desparafinizo amostras FFPE?
A desparafinização envolve lavagens sequenciais com solventes para remover a parafina: normalmente duas incubações com xileno, seguidas de duas lavagens com etanol (96%). Após centrifugação e secagem, o tecido está pronto para extração a jusante. Este processo restaura a acessibilidade da amostra para lise e digestão enzimática.
Qual é o objetivo da incubação térmica?
A incubação térmica refere-se à exposição controlada de uma amostra a uma temperatura definida durante um período de tempo específico para induzir alterações bioquímicas ou físicas. Em proteómica, é normalmente utilizada para desnaturar proteínas, inverter ligações cruzadas de formaldeído em tecidos FFPE ou aumentar a eficácia do tampão de lise. A temperatura e a duração são parâmetros críticos, adaptados à reação alvo ou ao tipo de amostra.
O que é a digestão SP3?
O Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) é um fluxo de trabalho proteómico baseado em esferas. Utiliza esferas paramagnéticas para ligar proteínas, permitindo uma limpeza eficiente, concentração e digestão enzimática na esfera sob condições desnaturantes. O SP3 minimiza a perda de amostras e é altamente compatível com amostras de baixo rendimento e FFPE.
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultra-sónicos de alto desempenho a partir de laboratório para dimensão industrial.