Preparação de amostras FFPE de alto rendimento: Extração de proteínas e corte de ácidos nucleicos
Com o ultrasonicator de alto rendimento UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics aborda os desafios da fixação de formalina e preparação de tecidos embutidos em parafina (FFPE). Saiba como ultrasonication processa amostra FFPE em grande número para FFPE desparafinização, lise tecidual, homogeneização, extração de proteínas e DNA / RNA cisalhamento! Tirar partido da preparação de tecidos FFPE ultra-sons – processamento de grandes quantidades de amostras em placas multipoços! Obter amostras de alta qualidade e obter um elevado número de amostras para resultados de investigação fiáveis! E por último, mas não menos importante, poupe tempo e dinheiro!
Preparação de amostras FFPE facilitada pela sonicação de alto rendimento
A fixação com formalina e inclusão em parafina (FFPE) é o método mais comum para preservar e arquivar tecidos sólidos. A extração de biomoléculas de amostras de tecidos FFPE apresenta frequentemente desafios significativos devido à qualidade das amostras armazenadas. Estas amostras, que são bens inestimáveis em biologia molecular e investigação clínica, constituem uma fonte rica de informações biológicas para estudos retrospectivos e validação de biomarcadores de diagnóstico. No entanto, o processo de fixação em formalina e inclusão em parafina, embora preserve a arquitetura e a morfologia dos tecidos, complica a extração de ácidos nucleicos e proteínas de elevada qualidade. A formalina induz a reticulação de ácidos nucleicos e proteínas, levando à fragmentação molecular e a modificações químicas. Saiba como o ultrasonicator de alto rendimento UIP400MTP supera os desafios da preparação de amostras FFPE!
Ultrassons para uma preparação eficiente de amostras FFPE
- Fluxo de trabalho fácil de utilizar: Processos simplificados que são fáceis de utilizar.
- Desparafinização, extração de proteínas, cisalhamento de ADN / ARN
- Processamento rápido de alto rendimento: Manuseamento eficiente de placas com vários poços.
- Desparafinização eficaz: Solubilização melhorada de proteínas.
- Solventes não tóxicos: Evita a utilização de solventes orgânicos nocivos, como o xileno.
Sonicador de alto rendimento UIP400MTP para processamento de amostras FFPE de elevado rendimento em placas multipoços
Avanços nas técnicas de extração de proteínas de tecidos FFPE
A Hielscher Ultrasonics aborda os desafios na preparação de amostras FFPE de alto rendimento. A sonicação emprega ondas ultra-sónicas para gerar vibrações mecânicas e cavitação focalizada, rompendo eficazmente as estruturas celulares e melhorando a solubilização de biomoléculas. Esta técnica ganhou popularidade devido à sua capacidade de aumentar a eficiência e o rendimento da extração de ácidos nucleicos e proteínas de tecidos FFPE, bem como do corte de ADN e ARN para a preparação de bibliotecas. É muito importante destacar que a ultrassonografia usando o sonicador de placa multiwell UIP400MTP mantém a integridade dessas biomoléculas para aplicações a jusante.
Cisalhamento de ácido nucleico usando ultrassom de alto rendimento
O ultrassonicador de múltiplos poços UIP400MTP para uso em ambientes de alto rendimento leva a preparação de amostras FFPE a um novo nível. Este método de sonicação de placas com vários poços fornece uma solução eficiente e fiável para o processamento simultâneo de várias amostras. Facilita a extração rápida e reprodutível de ADN, ARN e proteínas, que são essenciais para várias técnicas analíticas, incluindo sequenciação de nova geração (NGS), PCR quantitativa e análises proteómicas. A otimização dos parâmetros de sonicação, como a amplitude, a duração e a temperatura, melhora ainda mais a qualidade e a quantidade das biomoléculas extraídas.
O sonicador UIP400MTP para placas multipoços oferece vantagens significativas para a fragmentação e corte de ADN e ARN de tecido FFPE. Uma das caraterísticas de destaque deste sistema é a sua capacidade de atingir tamanhos de fragmentos estreitos de ADN e ARN, proporcionando uma afinação precisa da intensidade de sonicação para obter fragmentos curtos de 150-200 pares de bases (pb) ou fragmentos mais longos de 15-20 pares de quilobases (kbp). Esta versatilidade torna o UIP400MTP indispensável para aplicações de sequenciação de leitura curta e de leitura longa, garantindo resultados de alta qualidade para sequenciação de nova geração (NGS) e sequenciação de genoma completo (WGS). O seu controlo preciso do tamanho do fragmento é crucial para os investigadores em todos os campos da genómica, uma vez que permite preparar amostras de acordo com as especificações.
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Fixadores e seus efeitos
A fixação é uma etapa crucial na preparação de amostras que preserva as estruturas celulares, interrompe as reacções bioquímicas e evita a degradação. São utilizados vários fixadores, dependendo dos requisitos experimentais específicos. Os dois fixadores mais comuns são o formaldeído e o paraformaldeído, que reticulam as proteínas e os ácidos nucleicos, preservando a morfologia e a antigenicidade das células e dos tecidos. Outros fixadores, como o etanol, o metanol e o glutaraldeído, são utilizados para aplicações específicas.
Os fixadores de formaldeído e paraformaldeído formam pontes de metileno entre grupos amino, resultando em ligações cruzadas de proteínas. Este processo imobiliza efetivamente os componentes celulares, preservando a sua integridade durante as etapas de análise subsequentes. Os efeitos destes fixadores podem ser influenciados por factores como a concentração, o pH e a temperatura, e a otimização destes parâmetros é crucial para garantir a preservação ideal das estruturas celulares.
Vantagens da preparação ultra-sónica de FFPE
A ultrassonografia é uma técnica poderosa para romper células e tecidos fixados que supera as técnicas convencionais. Oferece várias vantagens notáveis em relação aos métodos de lise tradicionais:
- Rapidez e eficiência: A lise por ultra-sons proporciona uma rápida rutura das células e tecidos, reduzindo significativamente o tempo de processamento em comparação com os métodos de lise mecânicos ou químicos. As ondas sonoras de alta frequência geradas pela sonda ultra-sónica criam forças de cisalhamento mecânicas, causando a rutura das estruturas celulares fixadas. Esta rutura rápida e eficiente permite aos investigadores processar grandes volumes de amostras num curto espaço de tempo.
- Suave e ajustável: A lise por ultra-sons oferece um mecanismo de rutura suave que minimiza os danos em biomoléculas sensíveis, tais como proteínas, ácidos nucleicos e enzimas. Ao contrário dos métodos mecânicos que geram calor excessivo ou forças de cisalhamento, a lise ultra-sónica utiliza cavitação controlada para romper as células, preservando a integridade e a funcionalidade dos componentes intracelulares.
- Versatilidade: A lise por ultra-sons pode ser aplicada a vários fixadores, permitindo aos investigadores trabalhar com uma vasta gama de amostras fixadas. Quer se utilize formaldeído, paraformaldeído ou fixadores alternativos, a lise por ultra-sons proporciona de forma consistente uma rutura eficiente, assegurando uma recuperação óptima dos componentes celulares.
- Alto rendimento e qualidade: A lise por ultra-sons facilita a obtenção de elevados rendimentos de componentes celulares intactos devido à sua capacidade de romper uniformemente as células e os tecidos fixados. Isto permite que as aplicações a jusante, como a análise de proteínas, a extração de ácidos nucleicos e os ensaios enzimáticos, produzam resultados fiáveis e reprodutíveis.
- Compatibilidade de automação: A lise ultra-sónica pode ser facilmente integrada em sistemas automatizados, permitindo o processamento de amostras de elevado rendimento. Esta compatibilidade permite aos investigadores otimizar o seu fluxo de trabalho e aumentar a produtividade, especialmente em estudos de grande escala.
Sonicador para placas de 96 poços UIP400MTP para a sonicação de placas de microtitulação e multipoços
A lise por ultra-sons revolucionou a rutura de células e tecidos fixados, oferecendo inúmeras vantagens em relação aos métodos de lise tradicionais. A sua velocidade, eficiência, seletividade, versatilidade, elevado rendimento e compatibilidade com a automatização fazem dela uma ferramenta indispensável na investigação em biologia molecular e biotecnologia. Oferecendo sonicadores sem contacto, bem como sonicadores do tipo sonda, a Hielscher Ultrasonics oferece o homogeneizador ultrassónico mais adequado para a sua aplicação em ciências da vida. Quer pretenda processar amostras individuais, amostras múltiplas ou um número muito elevado de amostras em simultâneo, oferecemos-lhe o melhor homogeneizador de ultra-sons que corresponda aos seus requisitos de investigação e diagnóstico.
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Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha
Os ultrassons Hielscher são conhecidos pelos seus elevados padrões de qualidade e design. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração harmoniosa dos nossos ultrassons nas instalações industriais. As condições difíceis e os ambientes exigentes são facilmente controlados pelos ultrassons Hielscher.
A Hielscher Ultrasonics é uma empresa certificada pela ISO e dá especial ênfase aos ultrassons de alto desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os ultrassons da Hielscher estão em conformidade com a CE e cumprem os requisitos da UL, CSA e RoHs.
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Ultrasonicador UIP400MTP: Preparação de amostras FFPE de alto rendimento em placas multipoços
FAQ
Abaixo, respondemos a perguntas frequentes, que são relevantes para a preparação de tecidos FFPE e ultrassom de amostras FFPE.
Como é preparado o tecido FFPE?
Passos para a preparação de tecidos FFPE: O manuseamento e processamento meticulosos de tecido fresco são essenciais para gerar amostras FFPE de alta qualidade. Garantir a preservação da arquitetura celular, dos ácidos nucleicos e das proteínas é essencial para uma análise precisa a jusante. Cada passo - da recolha à incorporação - requer precisão para manter a integridade da amostra para várias análises, incluindo exame histológico, imunohistoquímica e estudos moleculares. Executado corretamente, este processo de fixação e incorporação garante que o tecido preservado reflecte com precisão o estado in vivo, permitindo resultados fiáveis de diagnóstico e investigação.
Acompanhamo-lo nas 6 etapas principais do processo de incorporação de amostras de tecido FFPE.
- Coleção de tecidos
As biópsias de mamíferos vivos e as culturas de tecidos são fontes viáveis para a obtenção de tecido fresco para a preparação de amostras FFPE.
É importante utilizar uma técnica asséptica: Utilizar instrumentos e luvas esterilizados para evitar a contaminação. Idealmente, a colheita de tecidos deve ser efectuada num ambiente estéril, como uma sala de operações ou um exaustor de fluxo laminar.
Uma vez que a amostra é muito frágil, o seu manuseamento sensível é essencial: Minimizar os atrasos no processamento e iniciar imediatamente o processamento subsequente do tecido após a excisão. Isto é crucial para evitar a autólise e a degradação. Manter o tecido à temperatura ambiente; evitar a congelação, uma vez que pode provocar a formação de cristais de gelo e danos nos tecidos. - Fixação de tecidos
Em primeiro lugar, o tecido é tratado com uma solução fixadora: Utilizar 10% de formalina tamponada a neutro (NBF), que é equivalente a 4% de formaldeído em água, tamponada a um pH neutro.
Submergir completamente o tecido em formalina. Assegurar um rácio de volume fixador/tecido de pelo menos 10:1. O tempo de fixação varia tipicamente de 6 a 24 horas, dependendo do tipo e tamanho do tecido. É importante que o fixador possa penetrar completamente no tecido. No entanto, a sobre-fixação pode levar a ligações cruzadas que complicam a recuperação de antigénios, enquanto a sub-fixação pode resultar numa má preservação do tecido. - Corte de tecidos
Em segundo lugar, cortar o tecido com uma espessura de cerca de 3-5 mm para permitir uma penetração adequada do fixador. Assegurar a orientação correta do tecido para captar as estruturas histológicas relevantes. Isto facilita o processo de extração quando o tecido é posteriormente utilizado para análise. - Processamento da amostra fixada
Agora, o tecido fixado deve ser desidratado: Após a fixação, o tecido precisa de ser desidratado para garantir uma penetração completa da cera de parafina. Passar o tecido por uma série graduada de etanol (70%, 80%, 90% e 100%) para remover a água.
Limpeza com xileno: A cera de parafina é insolúvel em água, mas solúvel em xileno. Por conseguinte, a água presente no tecido deve ser substituída por xileno. No entanto, o próprio xileno é insolúvel em água, mas solúvel em álcool, sendo necessário um passo intermédio em que a água é primeiro substituída por álcool.
Infiltração com parafina: Incorporar o tecido em cera de parafina derretida, assegurando uma infiltração completa. Este passo envolve normalmente várias mudanças de parafina para garantir uma impregnação completa. - Incorporação do tecido
Nesta etapa, o tecido é moldado num bloco de tecido: Colocar o tecido num molde com a orientação pretendida e verter parafina derretida sobre o mesmo. Deixar a parafina solidificar por arrefecimento à temperatura ambiente ou numa placa fria. - Seccionamento e montagem
Microtomia: Para cortar o tecido embebido, utilizar um micrótomo para cortar secções finas (normalmente 4-5 micrómetros) do bloco de parafina. Em seguida, a amostra é montada, colocando as secções em lâminas de vidro para posterior coloração e análise microscópica.
Finalmente, verificar a qualidade da histologia: Avaliar as primeiras secções ao microscópio para garantir a fixação e o processamento adequados. Ajustar os protocolos conforme necessário com base no tipo de tecido e na qualidade observada.
Os tecidos FFPE podem ser utilizados para recuperar ARN, ADN e proteínas, bem como para descobrir sinais de cancro ou outras doenças. Podem ser armazenados durante anos e são uma parte essencial da forma como os investigadores e os médicos utilizam as amostras de tecido para diagnóstico e investigação.
Quais são os problemas e desafios comuns com o tecido FFPE?
As amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) são amplamente utilizadas na investigação e no diagnóstico, mas apresentam vários desafios e problemas comuns:
- Degradação de biomoléculas: A fixação prolongada pode levar à degradação do ADN, ARN e proteínas, dificultando a extração de ácidos nucleicos ou proteínas de alta qualidade para aplicações a jusante. A fixação correta (evitando a sub e a sobre-fixação) é essencial para a preservação dos tecidos.
- Mascaramento do antigénio: O processo de fixação pode mascarar locais antigénicos, reduzindo a eficácia da ligação dos anticorpos na imunohistoquímica e noutros ensaios imunológicos. Esta situação exige frequentemente a recuperação do antigénio, um procedimento através do qual o mascaramento de um epítopo é invertido e a ligação epítopo-anticorpo é restaurada. No entanto, a antigenicidade total pode nem sempre ser restaurada.
- Qualidade de fixação variável: As diferenças nos tempos e condições de fixação podem levar a uma qualidade de amostra inconsistente, afectando a reprodutibilidade e a comparabilidade dos resultados. Utilizar protocolos de fixação fiáveis e evitar a sub e sobre-fixação.
- Danos e fragmentação do ADN: A fixação de amostras de FFPE com formalina pode causar vários tipos de danos no ADN, incluindo a desaminação da citosina (mutações de C para T), danos oxidativos (por exemplo, 8-oxo-guanina que conduz a mutações de G para T), bem como rupturas físicas, tais como cortes, lacunas e locais abásicos que impedem a atividade da ADN polimerase. O processo de fixação com formalina pode provocar a fragmentação do ADN, o que complica as análises genéticas e genómicas, como a PCR e a sequenciação.
- Qualidade do ARN: O ARN extraído de tecidos FFPE encontra-se frequentemente fragmentado e quimicamente modificado, o que torna difícil a realização de análises transcriptómicas de elevada qualidade.
- Modificações de proteínas: A formalina pode induzir modificações químicas nas proteínas, afectando a sua estrutura e função, o que pode interferir com as análises proteómicas.
- Artefactos de processamento de amostras: Durante o processo de inclusão e seccionamento, a tensão mecânica e o calor podem introduzir artefactos e causar mais danos ao tecido.
- Variabilidade de lote para lote: As variações nos protocolos de fixação e incorporação entre diferentes lotes podem levar a uma variabilidade significativa nos resultados, complicando as comparações entre estudos.
- Problemas de armazenamento: O armazenamento a longo prazo de blocos FFPE pode levar a uma degradação adicional e à perda de integridade dos ácidos nucleicos ao longo do tempo, afectando a viabilidade das amostras de arquivo para estudos retrospectivos.
Reticulação: A fixação com formalina provoca a reticulação de proteínas e ácidos nucleicos, o que pode dificultar a análise molecular e afetar a precisão da imunohistoquímica e de outros ensaios.
A utilização de protocolos optimizados, o manuseamento cuidadoso das amostras e a aplicação de técnicas avançadas ajudam a melhorar a qualidade e a fiabilidade dos dados obtidos a partir de tecidos FFPE.
Qual é a diferença entre FFPE e tecido congelado?
O tecido FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) é preservado utilizando formalina para fixar o tecido e, em seguida, incorporado em cera de parafina, permitindo o armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente, mantendo a morfologia do tecido. Em contraste, o tecido congelado é rapidamente preservado por congelação, o que mantém melhor a integridade dos ácidos nucleicos e das proteínas, mas requer armazenamento a temperaturas muito baixas.
Que produtos químicos são utilizados para a incorporação de FFPE?
Os produtos químicos utilizados para a incorporação de FFPE incluem normalmente formalina para fixação e cera de parafina para incorporação. Para a inclusão em FFPE, os tecidos são normalmente fixados utilizando formalina tamponada neutra (FA) a 10% (v/v) ou uma solução de formaldeído a 4% (p/v) recentemente preparada (PFA) feita a partir de pó de paraformaldeído. A formalina, que é uma solução de formaldeído em água, é tamponada a um pH neutro para preservar a morfologia do tecido e evitar ligações cruzadas excessivas. A solução à base de paraformaldeído também proporciona uma fixação eficaz através da reticulação de proteínas, estabilizando assim a estrutura do tecido para posterior incorporação em cera de parafina. Estes produtos químicos são essenciais para manter a integridade e a morfologia do tecido durante o processo de fixação e incorporação.
Como é que a parafina é removida das amostras FFPE?
Para remover a parafina das amostras FFPE, as secções de tecido são normalmente submetidas a uma série de lavagens com xileno, seguidas de re-hidratação através de uma série graduada de álcoois e, finalmente, água. Uma vez que o xileno é altamente tóxico, apresentando riscos para a saúde, tais como problemas respiratórios, irritação da pele e potenciais efeitos a longo prazo com a exposição repetida, a remoção de parafina por ultra-sons está a emergir como uma alternativa promissora em muitos laboratórios. Este método utiliza ondas ultra-sónicas intensas para remover a parafina de forma eficiente e segura sem a necessidade de solventes tóxicos como o xileno, reduzindo assim o risco para o pessoal do laboratório e criando um ambiente de trabalho mais seguro.
Durante quanto tempo devo fixar os meus tecidos para obter uma boa qualidade das amostras FFPE?
As recomendações gerais para a duração da fixação sugerem normalmente a fixação de amostras de tecido em formalina durante 24 a 48 horas. Esta duração é geralmente suficiente para preservar a morfologia do tecido e as estruturas celulares, minimizando a fixação excessiva, que pode levar a ligações cruzadas excessivas e à degradação de ácidos nucleicos e proteínas. No entanto, o tempo de fixação ideal pode variar consoante o tamanho e o tipo de tecido, sendo que as amostras mais pequenas ou mais delicadas requerem tempos de fixação mais curtos. É crucial equilibrar a fixação adequada para evitar a autólise e a degradação dos tecidos, evitando ao mesmo tempo uma fixação prolongada que possa complicar as análises moleculares a jusante.