Preparação de amostras FFPE com elevada capacidade de processamento: extração de proteínas e cisalhamento de ácidos nucleicos
Com o sonicador ultrassónico UIP400MTP de elevada capacidade de processamento, a Hielscher Ultrasonics responde aos desafios da preparação de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina (FFPE). Saiba como os ultrassons processam um grande número de amostras FFPE para desparafinização, lise de tecidos, homogeneização, extração de proteínas e cisalhamento de DNA/RNA! Tire partido da preparação ultrassónica de tecidos FFPE – processando um grande número de amostras em placas multipoços! Obtenha amostras de elevada qualidade e um elevado número de amostras para resultados de investigação fiáveis! E, por último, mas não menos importante, poupe tempo e dinheiro!
Preparação de amostras FFPE facilitada pela sonicação com elevada capacidade de processamento
A fixação em formalina e a inclusão em parafina (FFPE) constituem o método mais comum para preservar e arquivar tecidos sólidos. A extração de biomoléculas de amostras de tecidos FFPE apresenta frequentemente desafios significativos devido à qualidade das amostras armazenadas. Estas amostras, que são recursos de valor inestimável em biologia molecular e investigação clínica, fornecem uma fonte rica de informação biológica para estudos retrospetivos e validação de biomarcadores de diagnóstico. No entanto, o processo de fixação em formalina e inclusão em parafina, embora preserve a arquitetura e a morfologia dos tecidos, dificulta a extração de ácidos nucleicos e proteínas de elevada qualidade. A formalina induz a formação de ligações cruzadas entre ácidos nucleicos e proteínas, provocando fragmentação molecular e modificações químicas. Saiba como o sonicador ultrassónico UIP400MTP de elevada capacidade de processamento supera os desafios da preparação de amostras FFPE!
Sonicador ultrassónico para uma preparação eficiente de amostras FFPE
- Fluxo de trabalho fácil de utilizar: processos simplificados e fáceis de executar.
- Desparafinização, extração de proteínas, cisalhamento de DNA / RNA
- Processamento rápido e de elevada capacidade: manuseamento eficiente de placas multipoços.
- Desparafinização eficaz: melhor solubilização das proteínas.
- Solventes não tóxicos: evita a utilização de solventes orgânicos nocivos, como o xileno.
Sonicador UIP400MTP de elevada capacidade de processamento para o processamento de um elevado número de amostras FFPE em placas multipoços
Avanços nas técnicas de extração de proteínas de tecidos FFPE
A Hielscher Ultrasonics responde aos desafios da preparação de um elevado número de amostras FFPE. A sonicação utiliza ondas ultrassónicas para gerar vibrações mecânicas e cavitação concentrada, rompendo eficazmente as estruturas celulares e melhorando a solubilização das biomoléculas. Esta técnica tem ganho popularidade pela sua capacidade de aumentar a eficiência e o rendimento da extração de ácidos nucleicos e proteínas de tecidos FFPE, bem como do cisalhamento de DNA e RNA para a preparação de bibliotecas. É muito importante salientar que a aplicação de ultrassons com o sonicador para placas multipoços UIP400MTP mantém a integridade destas biomoléculas para aplicações subsequentes.
Cisalhamento de ácidos nucleicos com ultrassons de elevada capacidade de processamento
O sonicador ultrassónico para placas multipoços UIP400MTP, destinado a ambientes de elevada capacidade de processamento, eleva a preparação de amostras FFPE a um novo nível. Este método de sonicação de placas multipoços proporciona uma solução eficiente e fiável para o processamento simultâneo de várias amostras. Facilita a extração rápida e reprodutível de DNA, RNA e proteínas, essenciais para várias técnicas analíticas, incluindo a sequenciação de nova geração (NGS), a PCR quantitativa e as análises proteómicas. A otimização de parâmetros de sonicação, como a amplitude, a duração e a temperatura, melhora ainda mais a qualidade e a quantidade das biomoléculas extraídas.
O sonicador UIP400MTP para placas multipoços oferece vantagens significativas na fragmentação e no cisalhamento de DNA e RNA de tecidos FFPE. Uma das características mais notáveis deste sistema é a sua capacidade de obter fragmentos de DNA e RNA numa gama estreita de tamanhos, permitindo ajustar com precisão a intensidade da sonicação para obter fragmentos curtos de 150–200 pares de bases (bp) ou fragmentos mais longos de 15–20 quilopares de bases (kbp). Esta versatilidade torna o UIP400MTP indispensável tanto para aplicações de sequenciação de leituras curtas como de leituras longas, garantindo resultados de elevada qualidade na sequenciação de nova geração (NGS) e na sequenciação do genoma completo (WGS). O seu controlo preciso do tamanho dos fragmentos é crucial para investigadores de todas as áreas da genómica, pois permite preparar amostras de acordo com as especificações.
Contacte-nos para soluções avançadas para tecidos FFPE
Descubra o sonicador para placas multipoços UIP400MTP para a recuperação eficiente de biomoléculas de amostras FFPE, mantendo a integridade dos ácidos nucleicos e das proteínas extraídos e garantindo a reprodutibilidade dos resultados. Esta tecnologia integra-se perfeitamente com outros fluxos de trabalho de preparação e análise, simplificando e melhorando as investigações moleculares que utilizam arquivos de tecidos FFPE.
Fixadores e os seus efeitos
A fixação é uma etapa crucial da preparação de amostras que preserva as estruturas celulares, interrompe as reações bioquímicas e previne a degradação. São utilizados vários fixadores, consoante os requisitos experimentais específicos. Os dois fixadores mais comuns são o formaldeído e o paraformaldeído, que formam ligações cruzadas entre proteínas e ácidos nucleicos, preservando a morfologia e a antigenicidade das células e dos tecidos. Outros fixadores, como o etanol, o metanol e o glutaraldeído, são utilizados em aplicações específicas.
Os fixadores de formaldeído e paraformaldeído formam pontes de metileno entre grupos amino, originando ligações cruzadas entre proteínas. Este processo imobiliza eficazmente os componentes celulares, preservando a sua integridade durante as etapas de análise subsequentes. Os efeitos destes fixadores podem ser influenciados por fatores como a concentração, o pH e a temperatura, sendo crucial otimizar estes parâmetros para garantir a preservação ideal das estruturas celulares.
Vantagens da preparação ultrassónica de amostras FFPE
A aplicação de ultrassons é uma técnica poderosa para romper células e tecidos fixados, que supera as técnicas convencionais. Oferece várias vantagens notáveis em relação aos métodos tradicionais de lise:
- Rapidez e eficiência: A lise ultrassónica proporciona uma rutura rápida das células e dos tecidos, reduzindo significativamente o tempo de processamento em comparação com os métodos de lise mecânica ou química. As ondas sonoras de alta frequência geradas pela sonda ultrassónica criam forças mecânicas de cisalhamento, provocando a rutura das estruturas celulares fixadas. Esta rutura rápida e eficiente permite aos investigadores processar grandes volumes de amostras num curto período de tempo.
- Suave e ajustável: A lise ultrassónica oferece um mecanismo de rutura suave que minimiza os danos em biomoléculas sensíveis, como proteínas, ácidos nucleicos e enzimas. Ao contrário dos métodos mecânicos que geram calor ou forças de cisalhamento excessivos, a lise ultrassónica utiliza cavitação controlada para romper as células, preservando a integridade e a funcionalidade dos componentes intracelulares.
- Versatilidade: A lise ultrassónica pode ser aplicada a amostras tratadas com vários fixadores, permitindo aos investigadores trabalhar com uma vasta gama de amostras fixadas. Quer se utilize formaldeído, paraformaldeído ou fixadores alternativos, a lise ultrassónica proporciona consistentemente uma rutura eficiente, garantindo a recuperação ideal dos componentes celulares.
- Elevado rendimento e qualidade: A lise ultrassónica facilita a obtenção de elevados rendimentos de componentes celulares intactos graças à sua capacidade de romper uniformemente células e tecidos fixados. Isto permite que aplicações subsequentes, como a análise de proteínas, a extração de ácidos nucleicos e os ensaios enzimáticos, produzam resultados fiáveis e reprodutíveis.
- Compatibilidade com a automatização: A lise ultrassónica pode ser facilmente integrada em sistemas automatizados, permitindo o processamento de um elevado número de amostras. Esta compatibilidade permite aos investigadores simplificar o seu fluxo de trabalho e aumentar a produtividade, particularmente em estudos de grande escala.
Sonicador UIP400MTP para placas de 96 poços para a sonicação de placas de microtitulação e placas multipoços
A lise ultrassónica revolucionou a rutura de células e tecidos fixados, oferecendo numerosas vantagens em relação aos métodos tradicionais de lise. A sua rapidez, eficiência, seletividade, versatilidade, elevado rendimento e compatibilidade com a automatização tornam-na uma ferramenta indispensável na investigação em biologia molecular e biotecnologia. Disponibilizando sonicadores sem contacto e sonicadores de sonda, a Hielscher Ultrasonics oferece o homogeneizador ultrassónico mais adequado à sua aplicação nas ciências da vida. Quer pretenda processar amostras individuais, várias amostras ou um número muito elevado de amostras em simultâneo, oferecer-lhe-emos o melhor sonicador para os seus requisitos de investigação e diagnóstico.
Saiba mais sobre os sonicadores sem contacto da Hielscher para a preparação de várias amostras e de um elevado número de amostras!
- investimento único
- utilize os seus próprios consumíveis
- sem custos recorrentes com acessórios e consumíveis exclusivos do fabricante
- elevada capacidade de processamento
- controlo de precisão
- tecnologia de ponta
- fiabilidade e robustez
- controlo do processo ajustável e preciso
- qualidade industrial: pode funcionar continuamente 24/7
- fácil e seguro de operar
- manutenção reduzida
Saiba mais sobre as aplicações dos sonicadores nas ciências da vida!
Sonicador de placas UIP400MTP para quaisquer placas de 96 poços, placas de microtitulação e placas multipoços.
Conceção, fabrico e consultoria – qualidade fabricada na Alemanha
Os sonicadores ultrassónicos Hielscher são reconhecidos pelos seus padrões de qualidade e conceção do mais alto nível. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração harmoniosa dos nossos sonicadores ultrassónicos em instalações industriais. Os sonicadores ultrassónicos Hielscher lidam facilmente com condições adversas e ambientes exigentes.
A Hielscher Ultrasonics é uma empresa com certificação ISO e dá especial ênfase a sonicadores ultrassónicos de elevado desempenho que apresentam tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os sonicadores ultrassónicos Hielscher estão em conformidade com a marcação CE e cumprem os requisitos de UL, CSA e RoHs.
Contacte-nos! / Coloque-nos as suas questões!
Sonicador ultrassónico UIP400MTP: Preparação de um elevado número de amostras FFPE em placas multipoços
Perguntas frequentes
Abaixo, respondemos a perguntas frequentes relevantes para a preparação de tecidos FFPE e a aplicação de ultrassons a amostras FFPE.
Como se preparam os tecidos FFPE?
Etapas da preparação de tecidos FFPE: o manuseamento e o processamento meticulosos de tecidos frescos são fundamentais para produzir amostras FFPE de elevada qualidade. Garantir a preservação da arquitetura celular, dos ácidos nucleicos e das proteínas é essencial para uma análise subsequente precisa. Cada etapa – desde a colheita até à inclusão – exige precisão para manter a integridade da amostra para várias análises, incluindo o exame histológico, a imunohistoquímica e os estudos moleculares. Quando executado corretamente, este processo de fixação e inclusão garante que o tecido preservado reflete com precisão o estado in vivo, permitindo resultados fiáveis de diagnóstico e investigação.
Apresentamos-lhe as 6 principais etapas do processo de inclusão de amostras de tecidos FFPE.
- Colheita de tecidos
As biópsias de mamíferos vivos e as culturas de tecidos são ambas fontes viáveis de tecidos frescos para a preparação de amostras FFPE.
É importante utilizar uma técnica assética: utilize instrumentos e luvas estéreis para evitar a contaminação. Idealmente, colha os tecidos num ambiente estéril, como um bloco operatório ou uma câmara de fluxo laminar.
Como a amostra é muito frágil, é essencial manuseá-la com cuidado: minimize os atrasos no processamento e inicie imediatamente o processamento subsequente do tecido após a excisão. Isto é crucial para prevenir a autólise e a degradação. Mantenha o tecido à temperatura ambiente; evite a congelação, pois pode provocar a formação de cristais de gelo e danos no tecido. - Fixação de tecidos
Primeiro, o tecido é tratado com uma solução fixadora: utilize formalina tamponada neutra a 10% (NBF), equivalente a formaldeído a 4% em água, tamponado a um pH neutro.
Mergulhe completamente o tecido em formalina. Garanta uma relação de volumes entre fixador e tecido de pelo menos 10:1. O tempo de fixação varia normalmente entre 6 e 24 horas, consoante o tipo e o tamanho do tecido. É importante que o fixador possa penetrar completamente no tecido. No entanto, a fixação excessiva pode levar à formação de ligações cruzadas que dificultam a recuperação antigénica, enquanto a fixação insuficiente pode resultar numa má preservação do tecido. - Aparagem de tecidos
Em segundo lugar, apare o tecido para uma espessura de cerca de 3–5 mm, de modo a permitir uma penetração adequada do fixador. Garanta a orientação correta do tecido para abranger as estruturas histológicas relevantes. Isto facilita o processo de extração quando o tecido é posteriormente utilizado para análise.
- Processamento da amostra fixada
Agora, o tecido fixado deve ser desidratado: após a fixação, o tecido precisa de ser desidratado para garantir uma penetração completa da parafina. Faça passar o tecido por uma série de soluções de etanol de concentração crescente (70%, 80%, 90% e 100%) para remover a água.
Diafanização com xileno: a parafina é insolúvel em água, mas solúvel em xileno. Por isso, a água no tecido deve ser substituída por xileno. No entanto, o próprio xileno é insolúvel em água, mas solúvel em álcool, o que exige uma etapa intermédia em que a água é primeiro substituída por álcool. Mergulhe o tecido em xileno ou num substituto do xileno para remover o etanol e preparar o tecido para a infiltração com parafina.
Infiltração com parafina: inclua o tecido em parafina fundida, garantindo uma infiltração completa. Esta etapa envolve normalmente várias mudanças de parafina para garantir uma impregnação completa. - Inclusão do tecido
Nesta etapa, o tecido é moldado num bloco de tecido: coloque o tecido num molde com a orientação pretendida e verta parafina fundida sobre ele. Deixe a parafina solidificar por arrefecimento à temperatura ambiente ou numa placa fria.
- Corte e montagem
Microtomia: para cortar o tecido incluído, utilize um micrótomo para obter cortes finos (normalmente de 4–5 micrómetros) do bloco de parafina. Em seguida, monte a amostra, colocando os cortes em lâminas de vidro para posterior coloração e análise microscópica.
Por fim, verifique a qualidade da histologia: avalie os primeiros cortes ao microscópio para garantir uma fixação e um processamento adequados. Ajuste os protocolos conforme necessário, com base no tipo de tecido e na qualidade observada.
Os tecidos FFPE podem ser utilizados para recuperar RNA, DNA e proteínas, bem como para detetar sinais de cancro ou de outras doenças. Podem ser armazenados durante anos e são uma parte essencial da utilização de amostras de tecidos por investigadores e médicos para diagnóstico e investigação.
Quais são os problemas e desafios comuns dos tecidos FFPE?
As amostras de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina (FFPE) são amplamente utilizadas na investigação e no diagnóstico, mas apresentam vários desafios e problemas comuns:
- Degradação de biomoléculas: A fixação prolongada pode levar à degradação de DNA, RNA e proteínas, dificultando a extração de ácidos nucleicos ou proteínas de elevada qualidade para aplicações subsequentes. Uma fixação correta (evitando a fixação insuficiente e excessiva) é essencial para a preservação dos tecidos.
- Mascaramento de antigénios: O processo de fixação pode mascarar os locais antigénicos, reduzindo a eficácia da ligação dos anticorpos na imunohistoquímica e noutros ensaios imunológicos. Isto exige frequentemente recuperação antigénica, um procedimento que reverte o mascaramento de um epítopo e restabelece a ligação epítopo-anticorpo. No entanto, a antigenicidade total pode nem sempre ser restabelecida.
- Qualidade de fixação variável: As diferenças nos tempos e nas condições de fixação podem levar a uma qualidade inconsistente das amostras, afetando a reprodutibilidade e a comparabilidade dos resultados. Utilize protocolos de fixação fiáveis e evite a fixação insuficiente e excessiva.
- Danos e fragmentação do DNA: A fixação em formalina de amostras FFPE pode provocar vários tipos de danos no DNA, incluindo a desaminação da citosina (mutações de C para T), danos oxidativos (por exemplo, 8-oxo-guanina que leva a mutações de G para T), bem como ruturas físicas, como quebras numa das cadeias, lacunas e locais abásicos que dificultam a atividade da DNA polimerase. O processo de fixação em formalina pode provocar a fragmentação do DNA, dificultando análises genéticas e genómicas, como a PCR e a sequenciação.
- Qualidade do RNA: O RNA extraído de tecidos FFPE está frequentemente fragmentado e quimicamente modificado, o que dificulta a realização de análises transcriptómicas de elevada qualidade.
- Modificações das proteínas: A formalina pode induzir modificações químicas nas proteínas, afetando a sua estrutura e função, o que pode interferir com as análises proteómicas.
- Artefactos de processamento das amostras: Durante o processo de inclusão e corte, a tensão mecânica e o calor podem introduzir artefactos e provocar danos adicionais no tecido.
- Variabilidade entre lotes: As variações nos protocolos de fixação e inclusão entre diferentes lotes podem levar a uma variabilidade significativa dos resultados, dificultando as comparações entre estudos.
- Problemas de armazenamento: O armazenamento prolongado de blocos FFPE pode levar a degradação adicional e à perda de integridade dos ácidos nucleicos ao longo do tempo, afetando a viabilidade das amostras arquivadas para estudos retrospetivos.
Ligações cruzadas: A fixação em formalina provoca a formação de ligações cruzadas entre proteínas e ácidos nucleicos, o que pode dificultar a análise molecular e afetar a precisão da imunohistoquímica e de outros ensaios.
A utilização de protocolos otimizados, o manuseamento cuidadoso das amostras e a aplicação de técnicas avançadas ajudam a melhorar a qualidade e a fiabilidade dos dados obtidos a partir de tecidos FFPE.
Qual é a diferença entre tecidos FFPE e tecidos congelados?
O tecido FFPE (fixado em formalina e incluído em parafina) é preservado utilizando formalina para fixar o tecido e é depois incluído em parafina, permitindo o armazenamento prolongado à temperatura ambiente e mantendo a morfologia do tecido. Em contrapartida, o tecido congelado é rapidamente preservado por congelação, o que mantém melhor a integridade dos ácidos nucleicos e das proteínas, mas exige armazenamento a temperaturas muito baixas.
Que produtos químicos são utilizados na inclusão FFPE?
Os produtos químicos utilizados na inclusão FFPE incluem normalmente formalina para a fixação e parafina para a inclusão. Para a inclusão FFPE, os tecidos são normalmente fixados utilizando formalina tamponada neutra a 10% (v/v) (FA) ou uma solução de formaldeído a 4% (w/v) (PFA), preparada de fresco a partir de pó de paraformaldeído. A formalina, que é uma solução de formaldeído em água, é tamponada a um pH neutro para preservar a morfologia do tecido e evitar a formação excessiva de ligações cruzadas. A solução à base de paraformaldeído também proporciona uma fixação eficaz através da formação de ligações cruzadas entre proteínas, estabilizando assim a estrutura do tecido para posterior inclusão em parafina. Estes produtos químicos são essenciais para manter a integridade e a morfologia do tecido durante o processo de fixação e inclusão.
Como se remove a parafina das amostras FFPE?
Para remover a parafina das amostras FFPE, os cortes de tecido são normalmente submetidos a uma série de lavagens com xileno, seguida de reidratação através de uma série de álcoois de concentração gradual e, por fim, água. Como o xileno é altamente tóxico, apresentando riscos para a saúde, como problemas respiratórios, irritação cutânea e potenciais efeitos a longo prazo com a exposição repetida, a remoção ultrassónica de parafina está a surgir como uma alternativa promissora em muitos laboratórios. Este método utiliza ondas ultrassónicas intensas para remover a parafina de forma eficiente e segura, sem necessidade de solventes tóxicos como o xileno, reduzindo assim o risco para o pessoal do laboratório e criando um ambiente de trabalho mais seguro.
Durante quanto tempo devo fixar os meus tecidos para obter amostras FFPE de boa qualidade?
As recomendações gerais sobre a duração da fixação sugerem normalmente a fixação de amostras de tecidos em formalina durante 24 a 48 horas. Esta duração é geralmente suficiente para preservar a morfologia do tecido e as estruturas celulares, minimizando a fixação excessiva, que pode levar à formação excessiva de ligações cruzadas e à degradação de ácidos nucleicos e proteínas. No entanto, o tempo de fixação ideal pode variar consoante o tamanho e o tipo de tecido, sendo que amostras mais pequenas ou mais delicadas exigem tempos de fixação mais curtos. É crucial equilibrar uma fixação adequada para prevenir a autólise e a degradação dos tecidos com a necessidade de evitar uma fixação prolongada que possa dificultar as análises moleculares subsequentes.