Protocolo de proteómica: a sonicação sem contacto melhora a preparação de amostras de péptidos para MS
A proteómica «bottom-up» tornou-se uma pedra angular da descoberta moderna de biomarcadores, da biologia estrutural e do diagnóstico clínico. Ao decompor as proteínas em péptidos antes da análise por espectrometria de massa (MS), os investigadores conseguem obter uma cobertura de sequências mais abrangente e uma quantificação mais fiável. No entanto, a preparação de amostras biológicas de elevada complexidade para MS continua a ser tecnicamente exigente. Avanços metodológicos recentes destacam como o processamento ultrassónico controlado – especificamente com o sonicador sem contacto VialTweeter Multi-Tube e o sonicador para microplacas UIP400MTP – pode simplificar significativamente este fluxo de trabalho, melhorar a reprodutibilidade e evitar os habituais estrangulamentos dos instrumentos.
Encontre um protocolo detalhado de preparação de amostras para obter péptidos com dimensões adequadas para análise por MS.
Quem deve utilizar a sonicação sem contacto na preparação de amostras de péptidos?
- Proteómica de baixo para cima & Discovery Labs: Investigadores que preparam amostras de elevada complexidade para fluxos de trabalho de LC-MS ou MALDI e que necessitam de uma recuperação de péptidos consistente e de elevado rendimento em diversas matrizes biológicas.
- S-Trap™ & Suspensão que afeta os utilizadores: Equipas que recorrem à purificação por microcolunas e que necessitam de um corte controlado do ADN para evitar o entupimento das colunas e garantir um carregamento e uma digestão das amostras sem problemas.
- clínico & Grupos de Investigação Translacional: Laboratórios que processam tecidos, células, plasma, soro ou líquido cefalorraquidiano, nos quais a reprodutibilidade entre lotes e a integridade das amostras são fundamentais.
- Quantitativo & Equipas do MS Teams visadas: Laboratórios que realizam estudos comparativos rigorosos, nos quais os sonicadores com sondas reutilizáveis apresentam riscos de contaminação cruzada que podem comprometer a quantificação de péptidos de baixa abundância.
- Instalações Centrais & Operações de alto rendimento: Grupos que processam várias réplicas biológicas em simultâneo e que beneficiam da sonicação em bloco de vários tubos, com os tubos fechados, utilizando o VialTweeter, o que elimina a necessidade de limpeza das sondas, reduz o tempo de intervenção manual e mantém as condições assépticas.
- Reunião de Pais e Professores & Investigadores da área das proteínas estruturais: Investigadores que necessitem de um processamento suave e com controlo de temperatura para preservar alterações instáveis e maximizar a cobertura da sequência durante a lise e a homogeneização celular.
Sonicador Multi-Sample “VialTweeter” para a preparação de amostras sem contacto de vários frascos selados para proteómica
Visão geral do protocolo: dos tecidos e células aos peptídeos prontos para análise por RM
O fluxo de trabalho de proteómica «de baixo para cima», amplamente adotado e descrito por Wojtkiewicz et al., proporciona um método robusto e escalável para a preparação de amostras de péptidos a partir de diversas matrizes biológicas. Partindo de 50–100 mg de tecido congelado instantaneamente ou de 1–20 milhões de células, o protocolo integra a tecnologia de retenção em suspensão (S-Trap™) para remover eficientemente detergentes, sais e contaminantes antes da digestão enzimática.
Após a lise, a quantificação das proteínas, a redução e a alquilação, a amostra é acidificada e carregada numa coluna de centrifugação S-Trap™, onde ocorre a digestão com tripsina/lysC. Os péptidos resultantes são eluídos, secos e submetidos a análise por LC-MS. Quando aplicado a 50 mg de tecido cardíaco humano, este fluxo de trabalho produz consistentemente peptídeos suficientes para 30 a 40 injeções, identificando mais de 4 000 proteínas únicas por análise. Embora a química e a purificação baseada em colunas estejam bem definidas, o sucesso do processo depende em grande medida das etapas iniciais de fragmentação física e de gestão do ADN.
O protocolo recomenda a utilização do Sonicador VialTweeter Multi-Tube para a lise das células por sonicação e a fragmentação do ADN – Ambas as etapas são fundamentais para a análise de péptidos.
O VialTweeter submete a sonicação tubos Eppendorf selados de 1,0, 1,5 e 2,0 mL, bem como vários frascos NUNC
Lise ultrassónica de células e tecidos para extração de proteínas
No fluxo de trabalho de proteómica «bottom-up», a sonicação é uma etapa fundamental na lise de amostras celulares para a extração de proteínas, com vista à subsequente análise por espectrometria de massa. Após a adição do tampão de lise celular com SDS ao sedimento celular, as amostras são submetidas a um tratamento ultrassónico utilizando o sonificador VialTweeter Multi-Tube. O protocolo utiliza tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e especifica que o sonicador funcione a 30% da potência, com 10 segundos ligado e 10 segundos desligado, repetindo-se este ciclo 3 vezes. Após uma espera de 1 minuto, o ciclo é repetido mais duas vezes. As amostras são arrefecidas continuamente com gelo.
Este processo não só contribui para a ruptura das células, como é especificamente necessário para fragmentar o ADN genómico libertado durante a lise. Uma fragmentação eficaz do ADN é crucial para reduzir a viscosidade da amostra e evitar o entupimento das colunas S-Trap™, garantindo assim uma recuperação ótima das proteínas e uma digestão fiável dos péptidos nas etapas subsequentes.
O papel fundamental do corte de ADN por ultrassons
Uma das falhas mais frequentes nos fluxos de trabalho baseados no S-Trap™ é o entupimento da coluna, causado quase exclusivamente pelo ADN genómico de elevado peso molecular libertado durante a homogeneização de células ou tecidos. O ADN intacto aumenta drasticamente a viscosidade da amostra, retém péptidos e bloqueia o leito sorvente microporoso do S-Trap™.
O processamento ultrassónico resolve este problema ao fragmentar mecanicamente o ADN em pequenos fragmentos solúveis. Através da aplicação de energia acústica controlada, o VialTweeter fragmenta eficazmente os ácidos nucleicos sem gerar calor excessivo nem introduzir contaminantes externos. Esta redução da viscosidade garante um carregamento suave da amostra, taxas de fluxo consistentes e uma cinética de digestão ininterrupta.
Parâmetros otimizados de sonicação do VialTweeter
O protocolo especifica um regime de sonicação altamente reprodutível, otimizado para preservar a integridade das amostras biológicas e garantir a compatibilidade com a espectrometria de massa (MS) nas etapas subsequentes. Para amostras em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, utilizando o sonicador de bloco sem contacto Hielscher VialTweeter, os seguintes parâmetros proporcionam a lise e o corte ideal do ADN, preservando simultaneamente a estrutura das proteínas:
- Amplitude: 30 % da potência
- Padrão de ciclo: 10 segundos ligado / 10 segundos desligado
- Duração: 3 ciclos (10 segundos ligado/10 segundos desligado) → 1 minuto de descanso com gelo → repetir mais 2 vezes
- Gestão da temperatura: As amostras são colocadas em gelo durante o processamento para evitar a desnaturação térmica e a atividade enzimática prematura
Esta abordagem de sonicação por impulsos evita o sobreaquecimento localizado, minimiza a oxidação dos péptidos e garante uma exposição acústica uniforme em todos os frascos. A configuração de tubo fechado elimina também a necessidade de limpar a sonda entre amostras, reduzindo drasticamente o tempo de intervenção manual e a variabilidade do operador.
Principais vantagens para os fluxos de trabalho modernos em proteómica
A integração do VialTweeter no seu fluxo de trabalho de proteómica «bottom-up» oferece várias vantagens operacionais e científicas:
- Fragmentação consistente do ADN: A distribuição uniforme da energia acústica por todos os frascos garante uma redução reprodutível da viscosidade e evita a variabilidade entre lotes no carregamento do S-Trap™.
- Preservação das modificações lábiles: O processamento a baixa temperatura num banho de gelo protege as modificações pós-traducionais (PTM) e evita a agregação de proteínas induzida pelo calor durante a lise celular.
- Processamento a jusante simplificado: Os lisados tratados com o VialTweeter podem ser diretamente clarificados por centrifugação e quantificados sem etapas adicionais de purificação, acelerando o processo de digestão com o S-Trap™.
- escalabilidade & Flexibilidade: As mesmas configurações de sonicação aplicam-se tanto a amostras de tecido de elevada complexidade como a suspensões celulares, apoiando fluxos de trabalho de proteómica de descoberta, quantificação direcionada e glicoproteómica. Os sonicadores para microplacas da Hielscher permitem um fácil aumento de escala para um grande número de amostras em poços múltiplos.
O Sonicator VialTweeter Multi-Tube sem contacto pode ser utilizado em armários frigoríficos
Sonicadores para a preparação de amostras proteómicas
A preparação de amostras de péptidos de alta qualidade para espectrometria de massa requer mais do que uma lise eficiente – Exige um controlo preciso da fragmentação do ADN, da temperatura e da prevenção da contaminação. Ao incorporar o Hielscher VialTweeter no seu fluxo de trabalho de proteómica «bottom-up», pode eliminar o entupimento do S-Trap™, garantir uma recuperação reprodutível das proteínas e manter a limpeza necessária para análises sensíveis de MS. Quer esteja a processar tecido humano, células cultivadas ou lisados complexos, o processamento ultrassónico em bloco proporciona a fiabilidade, a escalabilidade e o controlo do processo que os laboratórios modernos de proteómica exigem.
Para aumentar o número de amostras, aproveite os modelos de sonicadores para microplacas de contacto não direto e com focalização da Hielscher, os modelos UIP400MTP e UIP550MTP! Processe qualquer placa multipocil de padrão para proteómica de alto rendimento!
Processamento em tubo fechado vs. sonicadores tradicionais com sonda
Historicamente, os investigadores têm recorrido a sonicadores com sonda de contacto direto para a fragmentação do ADN. Embora eficazes, os sistemas com sonda apresentam várias limitações críticas nos fluxos de trabalho de proteómica:
- Risco de contaminação cruzada: A reutilização de uma sonda em várias amostras provoca o transporte de aerossóis e introduz contaminantes cruzados que distorcem os resultados quantitativos da espectrometria de massa.
- Perda de amostra: A inserção direta pode provocar salpicos, evaporação e a aderência de péptidos valiosos à superfície da sonda.
- Limpeza: A descontaminação minuciosa das sondas entre análises é demorada e, muitas vezes, incompleta, comprometendo os estudos de proteínas de baixa abundância.
O sonicador de bloco VialTweeter processa as amostras inteiramente dentro de tubos de microcentrífuga selados. Este design de sistema fechado elimina o contacto entre a sonda e a amostra, impede a geração de aerossóis e mantém condições assépticas rigorosas ao longo de todo o processo de homogeneização e lise. Para laboratórios que processam lisados de tecido de elevada complexidade ou múltiplas linhas celulares, isto traduz-se em dados de MS mais limpos, maior recuperação de péptidos e réplicas biológicas mais fiáveis.
Ampliação para a preparação de amostras de alto rendimento em placas multipocos
Com os modelos de sonicador para microplacas UIP400MTP e UIP550MTP, o processamento em tubos pode ser facilmente adaptado ao processamento de amostras de elevado rendimento em qualquer placa de poços múltiplos padrão.
Sonicador de placas com vários poços UIP400MTP para extração de proteínas de amostras com elevado rendimento
Perguntas frequentes sobre a sonicação na preparação de amostras de péptidos
Por que razão é necessária a sonicação antes do processamento de péptidos com o S-Trap™?
A sonicação é necessária para fragmentar o ADN genómico de elevado peso molecular libertado durante a lise celular ou tecidular. O ADN intacto aumenta drasticamente a viscosidade da amostra, o que pode obstruir a microcoluna S-Trap™ e reter péptidos, reduzindo significativamente a recuperação e a compatibilidade com a espectrometria de massa.
De que forma o sonicador de bloco VialTweeter melhora a preparação de amostras em comparação com os sonicadores de sonda tradicionais?
Ao contrário dos sonicadores com sonda de contacto direto, que exigem uma limpeza cuidadosa entre cada ciclo e apresentam o risco de contaminação por aerossóis, o VialTweeter processa as amostras inteiramente dentro de frascos selados e tubos de microcentrífuga. Este design de tubo fechado elimina a contaminação cruzada, evita a perda de amostras e mantém condições assépticas rigorosas durante todo o processo de homogeneização e lise celular.
Quais são os parâmetros ideais de sonicação para a preparação de amostras em proteómica?
No caso de amostras biológicas, como células e tecidos, o protocolo recomendado prevê a utilização de um sonicador VialTweeter a 30 % da potência, com um ciclo de 10 segundos ligado / 10 segundos desligado, repetido 3 vezes. As amostras devem ser mantidas em gelo durante o processamento, e o ciclo deve ser repetido mais duas vezes se forem processadas ≥5 milhões de células. (cf. Wojtkiewicz et al., 2021)
O que devo fazer se a minha coluna S-Trap™ ficar entupida durante o carregamento da amostra?
O entupimento da coluna é normalmente causado pela elevada viscosidade do ADN ou por uma clarificação insuficiente. Para resolver esta situação, centrifugue bem o seu lisado antes de pipetar e certifique-se de que o ADN é adequadamente fragmentado através da sonicação.
De que forma a sonicação sem contacto beneficia os fluxos de trabalho de proteómica quantitativa?
Em estudos quantitativos, mesmo a contaminação cruzada mínima entre amostras pode distorcer as medições de péptidos de baixa abundância. O processamento em tubo fechado e multifial do VialTweeter elimina a necessidade de inserção de uma sonda, garante a reprodutibilidade entre lotes e mantém a integridade da amostra para análises comparativas precisas.
Que rendimento em proteínas e profundidade de MS posso esperar deste protocolo?
Partindo de 50 mg de tecido cardíaco humano ou 5 milhões de células, o fluxo de trabalho do S-Trap™ produz normalmente peptídeos suficientes para 30 a 50 injeções de LC-MS, identificando de forma consistente mais de 4 000 proteínas únicas por análise. (cf. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatura / Referências
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
A Hielscher Ultrasonics fornece sonicadores potentes e sem contacto para a preparação de amostras e análises clínicas. O sonicador para placas de múltiplos poços UIP400MTP, o VialTweeter, o CupHorn e o sonicador de fluxo GDmini2 processam as amostras sem as tocar.