Sonicagem de microplacas na proteómica «shotgun» – Nota de Aplicação

A proteómica Shotgun depende de uma preparação de amostras eficiente e reprodutível para converter material biológico complexo em péptidos prontos para LC-MS/MS. O sonicador de microplacas UIP400MTP apoia este processo, permitindo a sonicação padronizada e paralela de amostras de pequeno volume, ajudando os laboratórios a melhorar a disrupção, a extração e a resolubilização em fluxos de trabalho baseados em microplacas. Esta nota de aplicação descreve como o UIP400MTP pode ser integrado na preparação de amostras proteómicas, utilizando um fluxo de trabalho com vesículas extracelulares publicado a partir de estudos sobre PLA2G12A/Th17 como exemplo testado em laboratório.

Sonicagem em microplacas para uma proteómica «shotgun» mais reprodutível

Para os investigadores na área da proteómica, a preparação reprodutível das amostras é fundamental para a obtenção de dados de LC-MS/MS de alta qualidade. O sonicador de microplacas UIP400MTP permite uma sonicação padronizada e paralela em fluxos de trabalho baseados em placas e de pequeno volume/alto rendimento.

É especialmente útil para laboratórios que trabalham com:

• Conjuntos de amostras de grande dimensão que exigem um processamento consistente em vários poços
• Material com quantidade limitada, em que a perda e a variabilidade da amostra devem ser minimizadas
• Amostras ricas em lípidos, tais como vesículas extracelulares
• Preparações biológicas complexas que requerem uma disrupção, extração ou resolubilização eficazes
• Proteómica comparativa do tipo «shotgun», em que a reprodutibilidade entre condições e réplicas é essencial

Ao integrar a sonicação em microplacas antes da digestão, os investigadores podem melhorar a preparação das amostras para:

• Extração e resolubilização de proteínas
• Digestão com tripsina/Lys-C
• Aquisição de dados por Nano-LC/MS/MS
• Análise proteómica quantitativa a jusante

 

Amplie a preparação das suas amostras para proteómica com confiança!
Saiba como a sonicação em microplacas ajuda a reduzir a variabilidade manual, a melhorar a disrupção das amostras e a preparar amostras biológicas complexas para uma análise fiável por LC-MS/MS.

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A sonicação em microplacas pode ser benéfica para:

• Instalações centrais de proteómica
• Laboratórios de investigação sobre veículos elétricos
• Laboratórios de imunologia e biologia celular
• Grupos de investigação translacional
• Equipas da área das ciências da vida que estão a passar da preparação de amostras individuais para fluxos de trabalho de maior capacidade

Preparação de amostras de alto rendimento para a análise do proteoma das vesículas extracelulares

O que é a proteómica «shotgun»?

A proteómica de tipo «shotgun» tornou-se uma estratégia analítica central para a caracterização de amostras biológicas complexas, desde lisados de células inteiras e extratos de tecidos até organelos purificados, vesículas extracelulares e amostras clínicas de baixo rendimento. O seu principal ponto forte reside na combinação da digestão de proteínas, da cromatografia líquida de alta resolução acoplada à espectrometria de massa em tandem e da inferência computacional de péptidos a proteínas. No entanto, a qualidade do conjunto de dados proteómicos final é determinada muito antes de a amostra chegar ao espectrómetro de massa. A disrupção eficiente da amostra, a solubilização das proteínas, a remoção de substâncias interferentes, a digestão enzimática reprodutível e a recuperação robusta de péptidos são, todas elas, decisivas para a profundidade de cobertura e a fiabilidade quantitativa.
Para os investigadores da área da proteómica e os laboratórios de ciências da vida que trabalham com amostras limitadas ou valiosas, a preparação das amostras constitui frequentemente o ponto de estrangulamento.

O desafio das vesículas extracelulares na proteómica

As vesículas extracelulares (EVs), por exemplo, representam uma classe de amostras particularmente exigente. São partículas em nanoescala, delimitadas por membranas e ricas em lípidos, com um rendimento proteico relativamente baixo e um elevado potencial de contaminação por lípidos, sais, detergentes, proteínas séricas e outros componentes da matriz. Estas características podem interferir com a eficiência da digestão, o desempenho cromatográfico, a estabilidade do electrospray e a identificação de péptidos. Um fluxo de trabalho de preparação para a proteómica de EVs deve, por isso, ser suficientemente robusto para romper as estruturas das vesículas e solubilizar a carga proteica, mantendo-se simultaneamente compatível com a digestão enzimática a jusante e a análise por LC-MS/MS.
Neste contexto, a sonicação compatível com microplacas oferece uma abordagem prática para o processamento reprodutível e em paralelo de amostras. Os modelos de sonicadores para microplacas da Hielscher, UIP400MTP (400 W) e UIP550MTP (550 W), foram concebidos para a sonicação de amostras em placas multipocilhas e recipientes de pequeno volume, permitindo fluxos de trabalho de maior rendimento do que os sonicadores convencionais de sonda única. Para laboratórios de proteómica, este formato é atraente porque permite reduzir a variabilidade manual, melhorar o tratamento paralelo de múltiplas amostras e integrar-se de forma mais natural nos fluxos de trabalho de preparação de amostras baseados em placas.

Fluxo de trabalho exemplar

Um fluxo de trabalho recente de proteómica de vesículas extracelulares na biologia das células Th17 induzidas pela PLA2G12A constitui um exemplo útil e testado em laboratório de como o sonicador para microplacas UIP400MTP pode ser incorporado na preparação de amostras para proteómica de tipo «shotgun». Nessa série de estudos, as amostras de vesículas extracelulares (EV) foram processadas para análise proteómica através de tratamento com metanol, sonicação com o UIP400MTP, centrifugação, secagem, digestão com tripsina/Lys-C e cromatografia líquida de nanofluxo (LC) acoplada a espectrometria de massa em tandem de alta resolução. Este mesmo trabalho biológico foi inicialmente divulgado como um pré-impresso no bioRxiv e, posteriormente, publicado na revista *Cell Reports*, onde a análise proteómica ajudou a caracterizar a forma como a PLA2G12A altera as proteínas transportadas pelas EV no contexto das respostas patogénicas das células T.

Sonicador de placas com vários poços UIP400MTP

Por que razão se recorre à sonicação em microplacas?
O UIP400MTP permite a sonicação padronizada e em paralelo de amostras de pequeno volume. Isto é útil quando a reprodutibilidade, a utilização de pequenas quantidades de amostra e o processamento de várias amostras são fatores importantes.

Lista de verificação do controlo de qualidade

• Confirme se todas as amostras apresentam uma quantidade equivalente de proteína EV.
• Utilize esquemas de processamento de amostras aleatórios ou equilibrados.
• Mantenha constantes o volume de metanol, o tempo de sonicação, o tempo de secagem e o volume de digestão.
• Acompanhar o rendimento de péptidos e as identificações de proteínas totais.
• Verifique a taxa de clivagem não realizada e a distribuição do comprimento dos péptidos.
• Verifique a forma dos picos cromatográficos e a reprodutibilidade do tempo de retenção.
• Inclua espaços em branco para controlar o arrastamento.
• Utilize amostras de controlo de qualidade agrupadas em estudos de maior dimensão.
• Avaliar o coeficiente de variação das réplicas.
• Utilize a PCA ou métodos relacionados para identificar efeitos de lote ou amostras atípicas.

Recomendações relativas à elaboração de atas

Ao publicar ou documentar este fluxo de trabalho, indique a quantidade de EV introduzida, o formato da placa, o volume de metanol, a amplitude e o tempo de sonicação do UIP400MTP, as condições de centrifugação, o método de secagem, o tampão de digestão, a concentração enzimática, o tempo de digestão, as condições de acidificação, plataforma de LC-MS/MS, modo de aquisição, versão do software, base de dados, limiar de FDR, método de normalização e fluxo de trabalho estatístico.
Todos os sonicadores para microplacas da Hielscher registam automaticamente parâmetros importantes do processo, tais como a amplitude, a duração da sonicação e a temperatura, com indicação da data e da hora, num ficheiro CSV guardado no cartão SD integrado. O registo de dados para fins de reprodutibilidade e controlo de qualidade nunca foi tão fácil!

O estudo em pormenor: Proteómica de EV Shotgun no estudo sobre a PLA2G12A

O estudo sobre a PLA2G12A constitui um exemplo concreto da utilização do UIP400MTP num fluxo de trabalho de proteómica de tipo «shotgun». A questão biológica consistia em saber de que forma a fosfolipase secretada PLA2G12A modifica as vesículas extracelulares derivadas de células Th17 e, consequentemente, influencia a diferenciação das células T patogénicas. Os autores demonstraram que a PLA2G12A atua nas membranas das vesículas extracelulares (EV) para produzir lisofosfolípidos, incluindo a 1-oleoil-lisofosfatidiletanolamina, e que a sinalização a jusante do ácido lisofosfatídico através da LPA2 contribui para a diferenciação das células Th17. Para além da sinalização lipídica, os estudos também examinaram a carga das vesículas extracelulares, incluindo o conteúdo de ARN e proteínas, tornando a proteómica de tipo «shotgun» uma componente importante da estratégia de caracterização.
No fluxo de trabalho de preparação de EV, as células Th17 foram cultivadas em meio contendo soro fetal bovino sem exossomas. Os sobrenadantes de cultura foram primeiro centrifugados para remover as células, filtrados através de um filtro de 0,22 µm, concentrados por ultrafiltração/ultracentrifugação, lavados, ressuspensos em PBS e quantificados através do ensaio de proteínas BCA. Esta preparação prévia de EV garantiu que uma quantidade definida de material EV, equivalente em proteínas, pudesse ser incorporada no fluxo de trabalho de proteómica.
Para a análise proteómica de tipo «shotgun», os autores utilizaram amostras de EV correspondentes a 5 µg de equivalentes de proteína. Estas amostras foram secas em tubos de PCR e adicionou-se 25 µL de metanol. As amostras foram então submetidas a sonicação durante 3 minutos utilizando o sonicador de microplacas UIP400MTP. Após a sonicação, as amostras foram centrifugadas a 4 °C durante 20 minutos a 19 000 × g. Após a remoção de 20 µL de sobrenadante, as amostras foram centrifugadas até à secagem total. As proteínas foram então dissolvidas por sonicação em 4 µL de solução de tripsina/Lys-C a 100 ng/µL em bicarbonato de amónio a 50 mM. A digestão foi realizada durante 2 horas a 37 °C, com agitação a 300 rpm. O produto da digestão foi acidificado com 1 µL de ácido trifluoroacético a 1,25% e submetido a cromatografia líquida de nanofluxo (LC) acoplada a espectrometria de massa em tandem de alta resolução.
Este fluxo de trabalho destaca vários princípios úteis para a proteómica de EV com baixo volume de amostra. Em primeiro lugar, o volume de amostra foi normalizado por equivalente proteico, o que é importante na comparação de EV de diferentes genótipos ou tratamentos. Em segundo lugar, utilizou-se metanol antes da sonicação, o que facilitou a ruptura e a extração, evitando simultaneamente o uso de sistemas detergentes que poderiam complicar a análise por LC-MS/MS. Em terceiro lugar, a etapa de sonicação foi curta e padronizada, o que é compatível com o processamento paralelo de amostras. Em quarto lugar, a digestão com tripsina/Lys-C foi realizada num volume muito pequeno, reduzindo a diluição e facilitando a recuperação de péptidos com baixo volume de amostra. Por fim, a transição direta da digestão para a acidificação e para a LC-MS/MS minimizou etapas de manuseamento desnecessárias.
O método LC-MS/MS a jusante utilizou separação em fase reversa com nanofluxo, acoplada a um espectrómetro de massa Q-Exactive HF Orbitrap. As amostras foram retidas numa pré-coluna C18 e, em seguida, separadas numa coluna analítica com 50 µm de diâmetro interno, a um caudal de 200 nL/min e a 40 °C. O gradiente variou de um baixo teor de solvente orgânico até 35% de solvente B ao longo de 60 minutos, seguido de lavagem com alto teor de solvente orgânico e reequilíbrio. A aquisição de MS foi realizada no modo de iões positivos, utilizando aquisição independente de dados com dissociação colisional de alta energia. Os ficheiros brutos de DIA foram analisados utilizando o DIA-NN 1.8 com uma biblioteca espectral prevista in silico.