Sonicação em microplacas na proteómica shotgun – Nota de aplicação

A proteómica shotgun depende de uma preparação de amostras eficiente e reprodutível para converter material biológico complexo em péptidos prontos para LC-MS/MS. O sonicador de microplacas UIP400MTP apoia este processo ao permitir a sonicação padronizada e em paralelo de amostras de pequeno volume, ajudando os laboratórios a melhorar a rutura, a extração e a resolubilização em fluxos de trabalho baseados em microplacas. Esta nota de aplicação descreve como o UIP400MTP pode ser integrado na preparação de amostras para proteómica, utilizando um fluxo de trabalho publicado para vesículas extracelulares de estudos sobre PLA2G12A/Th17 como exemplo testado em laboratório.

Sonicação em microplacas para uma proteómica shotgun mais reprodutível

Para os investigadores em proteómica, a preparação reprodutível de amostras é fundamental para obter dados LC-MS/MS de elevada qualidade. O sonicador de microplacas UIP400MTP permite a sonicação padronizada e em paralelo em fluxos de trabalho baseados em placas e com pequenos volumes/elevada capacidade de processamento.

É especialmente útil para laboratórios que trabalham com:

• Grandes conjuntos de amostras que exigem um processamento consistente em muitos poços
• Material disponível em quantidades reduzidas, em que a perda de amostra e a variabilidade devem ser minimizadas
• Amostras ricas em lípidos, como vesículas extracelulares
• Preparações biológicas complexas que exigem rutura, extração ou resolubilização eficientes
• Proteómica shotgun comparativa, em que a reprodutibilidade entre condições e réplicas é essencial

Ao integrar a sonicação em microplacas antes da digestão, os investigadores podem melhorar a adequação das amostras para:

• Extração e resolubilização de proteínas
• Digestão com tripsina/Lys-C
• Aquisição por nano-LC/MS/MS
• Análise proteómica quantitativa subsequente

A sonicação em microplacas pode beneficiar:

• Unidades centrais de serviços de proteómica
• Laboratórios de investigação em EV
• Laboratórios de imunologia e biologia celular
• Grupos de investigação translacional
• Equipas de ciências da vida que passam da preparação de amostras individuais para fluxos de trabalho com maior capacidade de processamento

Preparação de amostras com elevada capacidade de processamento para análise do proteoma de vesículas extracelulares

O que é a proteómica shotgun?

A proteómica shotgun tornou-se uma estratégia analítica central para caracterizar amostras biológicas complexas, desde lisados de células inteiras e extratos de tecidos até organelos purificados, vesículas extracelulares e amostras clínicas disponíveis em quantidades reduzidas. A sua principal vantagem reside na combinação da digestão de proteínas, da cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa em tandem de alta resolução e da inferência computacional de proteínas a partir de péptidos. Contudo, a qualidade do conjunto final de dados do proteoma é determinada muito antes de a amostra chegar ao espetrómetro de massa. A rutura eficiente das amostras, a solubilização de proteínas, a remoção de substâncias interferentes, a digestão enzimática reprodutível e a recuperação robusta de péptidos são determinantes para a profundidade de cobertura e a fiabilidade quantitativa.
Para os investigadores em proteómica e os laboratórios de ciências da vida que trabalham com amostras limitadas ou preciosas, a preparação de amostras é frequentemente o ponto de estrangulamento.

O desafio das vesículas extracelulares na proteómica

As vesículas extracelulares (EV), por exemplo, representam uma classe de amostras particularmente exigente. São partículas à escala nanométrica, delimitadas por membranas e ricas em lípidos, com um rendimento proteico relativamente baixo e um elevado potencial de arrastamento de lípidos, sais, detergentes, proteínas séricas e outros componentes da matriz. Estas características podem interferir com a eficiência da digestão, o desempenho cromatográfico, a estabilidade da ionização por electrospray e a identificação de péptidos. Um fluxo de preparação para proteómica de EV deve, por isso, ser suficientemente eficaz para romper as estruturas vesiculares e solubilizar o conteúdo proteico, mantendo simultaneamente a compatibilidade com a digestão enzimática subsequente e a análise LC-MS/MS.
Neste contexto, a aplicação de ultrassons compatível com microplacas oferece uma abordagem prática para o processamento reprodutível de amostras em paralelo. Os modelos de sonicadores de microplacas Hielscher UIP400MTP (400 W) e UIP550MTP (550 W) foram concebidos para a sonicação de amostras em placas multipoços e recipientes de pequeno volume, permitindo fluxos de trabalho com maior capacidade de processamento do que os sonicadores convencionais de sonda única. Para os laboratórios de proteómica, este formato é atrativo porque pode reduzir a variabilidade das operações manuais, melhorar o tratamento em paralelo de várias amostras e integrar-se de forma mais natural nos fluxos de preparação de amostras baseados em placas.

Exemplo de fluxo de trabalho

Um fluxo de trabalho recente de proteómica de vesículas extracelulares no estudo da biologia das células Th17 mediada por PLA2G12A fornece um exemplo útil, testado em laboratório, de como o sonicador de microplacas UIP400MTP pode ser incorporado na preparação de amostras para proteómica shotgun. Nessa série de estudos, as amostras de EV foram processadas para análise do proteoma mediante tratamento com metanol, sonicação com UIP400MTP, centrifugação, secagem, digestão com tripsina/Lys-C e cromatografia líquida (LC) de nanocaudal acoplada à espetrometria de massa (MS) em tandem de alta resolução. O trabalho biológico foi publicado em 2026 por Mochizuki-Ono e colaboradores, tendo a análise proteómica ajudado a caracterizar a forma como PLA2G12A altera as proteínas transportadas pelas EV no contexto das respostas de células T patogénicas.

Sonicador de placas multipoços UIP400MTP

Porquê a sonicação em microplacas?
O UIP400MTP permite a sonicação padronizada e em paralelo de amostras de pequeno volume. Isto é útil quando a reprodutibilidade, a quantidade inicial reduzida de amostra e a capacidade de processamento de múltiplas amostras são importantes.


Lista de verificação do controlo de qualidade

• Confirme que a quantidade inicial de EV equivalente em proteína é igual em todas as amostras.
• Utilize disposições aleatorizadas ou equilibradas para o processamento de amostras.
• Mantenha consistentes o volume de metanol, o tempo de sonicação, o tempo de secagem e o volume de digestão.
• Monitorize o rendimento de péptidos e o número total de identificações de proteínas.
• Verifique a taxa de clivagens não efetuadas e a distribuição do comprimento dos péptidos.
• Inspecione a forma dos picos cromatográficos e a reprodutibilidade dos tempos de retenção.
• Inclua brancos para monitorizar o arrastamento.
• Utilize amostras de controlo de qualidade (QC) agrupadas em estudos de maior dimensão.
• Avalie o coeficiente de variação entre réplicas.
• Utilize PCA ou métodos relacionados para identificar efeitos de lote ou amostras atípicas.

Recomendações de registo

Ao publicar ou documentar este fluxo de trabalho, indique a quantidade inicial de EV, o formato da placa, o volume de metanol, a amplitude e o tempo de sonicação do UIP400MTP, as condições de centrifugação, o método de secagem, o tampão de digestão, a concentração enzimática, o tempo de digestão, as condições de acidificação, a plataforma LC-MS/MS, o modo de aquisição, a versão do software, a base de dados, o limiar de FDR, o método de normalização e o fluxo de análise estatística.
Todos os sonicadores de microplacas Hielscher registam automaticamente parâmetros importantes do processo, como a amplitude, a duração da sonicação e a temperatura, com marcação de data e hora, num ficheiro CVS no cartão SD integrado. O registo de dados para reprodutibilidade e controlo de qualidade nunca foi tão fácil!

O estudo em detalhe: proteómica shotgun de EV no estudo de PLA2G12A

O estudo de PLA2G12A fornece um exemplo concreto da utilização do UIP400MTP num fluxo de trabalho de proteómica shotgun. A questão biológica era saber como a fosfolipase secretada PLA2G12A modifica as vesículas extracelulares derivadas de células Th17 e, desse modo, influencia a diferenciação de células T patogénicas. Os autores demonstraram que PLA2G12A atua nas membranas das EV para produzir lisofosfolípidos, incluindo 1-oleoil-lisofosfatidiletanolamina, e que a sinalização subsequente do ácido lisofosfatídico através de LPA2 contribui para a diferenciação de Th17. Além da sinalização lipídica, os estudos também examinaram o conteúdo das EV, incluindo o teor de RNA e de proteínas, tornando a proteómica shotgun um componente importante da estratégia de caracterização.
No fluxo de preparação de EV, as células Th17 foram cultivadas em meio contendo soro fetal bovino depletado de exossomas. Os sobrenadantes das culturas foram primeiro centrifugados para remover as células, filtrados através de um filtro de 0,22 µm, concentrados por ultrafiltração/ultracentrifugação, lavados, ressuspensos em PBS e quantificados por ensaio de proteínas BCA. Esta preparação prévia das EV assegurou que uma quantidade definida de material de EV equivalente em proteína pudesse ser introduzida no fluxo de trabalho de proteómica.
Para a análise de proteómica shotgun, os autores utilizaram amostras de EV correspondentes a 5 µg de equivalentes de proteína. Estas amostras foram secas em tubos de PCR e adicionaram-se 25 µL de metanol. As amostras foram depois sonicadas durante 3 minutos utilizando o sonicador de microplacas UIP400MTP. Após a sonicação, as amostras foram centrifugadas a 4°C durante 20 minutos a 19 000 × g. Após a remoção de 20 µL de sobrenadante, as amostras foram centrifugadas até à secura. As proteínas foram depois dissolvidas por sonicação em 4 µL de solução de tripsina/Lys-C a 100 ng/µL em bicarbonato de amónio a 50 mM. A digestão foi efetuada durante 2 horas a 37°C, com agitação a 300 rpm. O digerido foi acidificado com 1 µL de ácido trifluoroacético a 1,25% e submetido a cromatografia líquida de nanocaudal acoplada à espetrometria de massa em tandem de alta resolução.
Este fluxo de trabalho destaca vários princípios úteis para a proteómica de EV com quantidades iniciais reduzidas. Primeiro, a quantidade inicial foi normalizada por equivalente de proteína, o que é importante ao comparar EV de diferentes genótipos ou tratamentos. Segundo, o metanol foi utilizado antes da sonicação, favorecendo a rutura e a extração e evitando simultaneamente sistemas de detergentes que podem complicar a LC-MS/MS. Terceiro, a etapa de sonicação foi curta e padronizada, o que é compatível com o processamento de amostras em paralelo. Quarto, a digestão com tripsina/Lys-C foi efetuada num volume muito pequeno, reduzindo a diluição e favorecendo a recuperação de péptidos a partir de quantidades iniciais reduzidas. Por fim, a transição direta da digestão para a acidificação e a LC-MS/MS minimizou as etapas desnecessárias de manipulação.
O método LC-MS/MS subsequente utilizou separação de fase reversa com nanocaudal acoplada a um espetrómetro de massa Q-Exactive HF Orbitrap. As amostras foram retidas numa pré-coluna C18 e depois separadas numa coluna analítica de 50 µm de diâmetro interno, a 200 nL/min e 40°C. O gradiente passou de um baixo teor de solvente orgânico para 35% de solvente B ao longo de 60 minutos, seguido de lavagem com elevado teor de solvente orgânico e reequilibração. A aquisição de MS foi efetuada em modo de iões positivos, utilizando aquisição independente de dados com dissociação por colisão de energia mais elevada. Os ficheiros brutos DIA foram analisados com DIA-NN 1,8, utilizando uma biblioteca espetral prevista in silico.