Zwiększanie skali syntezy peptydów: strategie ultradźwiękowe w procesach okresowych i przepływie ciągłym
Synteza peptydów wspomagana sonikacją łączy sprawdzone metody chemicznej syntezy peptydów z energią mechaniczną o wysokiej częstotliwości, aby przyspieszyć procesy reakcji i transportu. Kawitacja akustyczna – powstawanie i zapadanie się mikroskopijnych pęcherzyków – wywołuje intensywne mieszanie lokalne, mikrostrumienie i siły ścinające. W syntezie peptydów efekty te usprawniają transport reagentów, zwilżanie żywicy, rozpuszczanie i rozbijanie agregatów. Ultradźwięki o niskiej częstotliwości działają zatem przede wszystkim jako narzędzie intensyfikacji procesu: nie zastępują chemicznych metod sprzęgania, ale mogą sprawić, że sprzęganie, usuwanie grup ochronnych, przemywanie, odszczepianie i obróbka mieszaniny poreakcyjnej będą znacznie szybsze i wydajniejsze.
Wyzwania związane ze zwiększaniem skali produkcji peptydów
Zwiększanie skali produkcji peptydów od skali laboratoryjnej do produkcyjnej jest trudne, ponieważ niewielkie niedoskonałości procesu kumulują się w wielu cyklach sprzęgania i usuwania grup ochronnych, zmniejszając wydajność i zwiększając ilość trudnych do usunięcia zanieczyszczeń. Większe reaktory wprowadzają również ograniczenia w mieszaniu, wymianie ciepła, pęcznieniu żywicy i transporcie reagentów, podczas gdy zużycie rozpuszczalników, wymagania dotyczące oczyszczania i koszty produkcji gwałtownie rosną. Skuteczne zwiększanie skali musi zatem zachować jednorodność reakcji i jakość produktu, zapewniając jednocześnie powtarzalną wydajność przetwarzania, efektywne wykorzystanie zasobów i precyzyjną kontrolę wszystkich krytycznych parametrów procesu.
Reaktor okresowy do zastosowań farmaceutycznych z sonikatorem UIP2000hdT do usprawnionej syntezy peptydów
Strategie syntezy peptydów wspomaganej sonikacją
Ultradźwiękowa synteza peptydów w fazie stałej
Synteza peptydów w fazie stałej metodą Fmoc (SPPS) jest najdokładniej zbadaną strategią ultradźwiękową. Sonikacja zwiększa wnikanie reagentów do usuwania grup ochronnych i sprzęgania do spęczniałych kulek polimerowych, jednocześnie zmniejszając nieruchome warstwy graniczne wokół żywicy. Może również rozbijać agregaty na żywicy, których powstawanie jest ważną przyczyną niepełnej konwersji w przypadku sekwencji hydrofobowych i innych „trudnych” sekwencji.
Badania eksperymentalne wykazały możliwość wspomaganej ultradźwiękami syntezy biologicznie aktywnych peptydów zawierających nawet 44 reszty, przy mniejszym zużyciu materiałów i krótszych czasach reakcji, bez zaobserwowanego nasilenia głównych reakcji ubocznych w opisanych warunkach. (por. Merlino i wsp., 2019)
W innym badaniu odnotowano od czterokrotnego do czternastokrotnego skrócenia czasu syntezy wybranych peptydów; 25-mer bogaty w reszty hydrofobowe zsyntetyzowano w 347 minut. (por. Silva i wsp., 2021)
Ultradźwięki można stosować podczas:
- Pęcznienia żywicy i wymiany reagentów
- Usuwania grup ochronnych Fmoc lub Boc
- Aktywacji i sprzęgania aminokwasów
- Przemywania między etapami
- Cyklizacji na żywicy
- Odszczepiania gotowego peptydu od nośnika
Synteza w fazie ciekłej i synteza wspomagana znacznikiem
Ultradźwięki mogą również intensyfikować konwencjonalną syntezę peptydów w fazie ciekłej poprzez przyspieszanie rozpuszczania, dyspergowania reagentów i transportu masy w mieszaninach niejednorodnych lub lepkich. Korzyści są na ogół największe, gdy proces jest ograniczony przez mieszanie lub transport; w całkowicie jednorodnej reakcji, której przebieg jest kontrolowany wyłącznie przez właściwą jej kinetykę chemiczną, poprawa może być mniejsza.
W syntezie peptydów wspomaganej znacznikiem rosnący peptyd jest przyłączony do rozpuszczalnej lub możliwej do wytrącenia kotwicy organicznej. Reakcje zachodzą w roztworze, po czym produkt pośredni ze znacznikiem jest odzyskiwany przez wytrącanie lub filtrację. Sonikacja może przyspieszać sprzęganie, usuwanie grup ochronnych, cyklizację i odszczepianie znacznika, utrzymując jednocześnie słabo rozpuszczalne produkty pośrednie w stanie zdyspergowanym.
| Technika | Jak sonikacja wspomaga tę technikę | Znaczenie i ograniczenia |
|---|---|---|
| Synteza peptydów w fazie stałej metodą Fmoc | Sonikacja przyspiesza wnikanie piperydyny i usuwanie produktów Fmoc; usprawnia transport aktywowanych aminokwasów do spęczniałej żywicy; rozbija agregaty na żywicy | Najsilniejsze dowody i zazwyczaj największe korzyści |
| Synteza w fazie stałej metodą Boc | Sonikacja usprawnia wnikanie kwasu, wymianę reagentów, sprzęganie i przemywanie podobnie jak w metodzie Fmoc | Zapobieganie wydostawaniu się kwasu i nagrzewanie wymagają ostrożności |
| Synteza w roztworze/fazie ciekłej | Sonikacja usprawnia rozpuszczanie chronionych aminokwasów, dysperguje osady i zwiększa kontakt w reakcjach dwufazowych lub prowadzonych w zawiesinie | Korzyści są mniejsze, gdy reakcja jest już jednorodna, a jej szybkość ogranicza kinetyka chemiczna |
| Synteza z rozpuszczalnym znacznikiem lub oparta na wytrącaniu | Sonikacja utrzymuje produkty pośrednie ze znacznikiem w stanie zdyspergowanym podczas sprzęgania i może usprawniać rozpuszczanie przed filtracją lub wytrącaniem | Przydatna przy otrzymywaniu słabo rozpuszczalnych produktów lub preparatów w dużej ilości; ultradźwięki wspomagają głównie operacje procesowe i transport masy |
| Synteza przepływowa lub ciągła | Sonikacja pomaga utrzymywać kontakt między żywicą a cieczą oraz ograniczać lokalne obszary zastoju lub agregację | Zwiększanie skali z konstrukcją komory przepływowej zapewniającą równomierną ekspozycję na ultradźwięki |
| Ligacja fragmentów i cyklizacja | Sonikacja może zwiększać rozpuszczalność fragmentów hydrofobowych, rozbijać agregaty i poprawiać kontakt międzycząsteczkowy | Sama w sobie nie przyspiesza każdej natywnej ligacji chemicznej ani makrocyklizacji; nadmierne rozcieńczenie lub agregacja międzycząsteczkowa mogą nadal dominować |
| Enzymatyczna synteza peptydów | Przy odpowiednim natężeniu sonikacja może modyfikować dynamikę enzymów i usprawniać transport substratów, szczególnie w przypadku enzymów immobilizowanych lub środowisk dwufazowych | Silnie zależna od enzymu; nadmierna moc powoduje rozwijanie struktury lub inaktywację |
| Synteza rybosomalna/rekombinacyjna | Brak bezpośredniego wpływu na translację | Sonikacja jest stosowana głównie do rozbijania komórek po ekspresji |
Zwiększanie skali procesów ultradźwiękowych: przetwarzanie okresowe, recyrkulacyjne i w przepływie ciągłym
Sonikatory Hielscher można bezproblemowo zintegrować z konkretną instalacją produkcyjną do syntezy peptydów.
Przy zwiększaniu skali istotne są trzy konfiguracje reaktorów:
- Sonikacja okresowa jest prosta i elastyczna, ale wraz ze wzrostem objętości naczynia coraz trudniej jest nią sterować tak, aby uzyskać optymalną, jednorodną sonikację.
- Przetwarzanie recyrkulacyjne polega na wielokrotnym przepompowywaniu zawartości reaktora przez ultradźwiękową komorę przepływową, co zapewnia bardziej równomierną obróbkę przy zachowaniu elastyczności procesu okresowego.
- W przepływie ciągłym strumień reakcyjny przechodzi przez jedną lub więcej kontrolowanych stref sonikacji. Czas przebywania, natężenie przepływu i dopływ energii można precyzyjnie określić, dzięki czemu jest to preferowana architektura do powtarzalnej produkcji o wysokiej wydajności przetwarzania.
W procesach opartych na żywicy droga przepływu, pompa i zawory muszą być dostosowane do rozmiaru kulek, aby zapobiegać ich ścieraniu i blokowaniu przepływu. Alternatywą jest zatrzymanie żywicy w reaktorze z mieszadłem i cyrkulacja wyłącznie fazy ciekłej przez komorę ultradźwiękową.
2x sonikatory przemysłowe modelu UIP4000hdT podłączone do reaktora z komorą przepływową ze stali nierdzewnej do produkcji peptydów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące zwiększania skali ultradźwiękowej syntezy peptydów
Czym jest ultradźwiękowa synteza peptydów?
Ultradźwiękowa synteza peptydów wykorzystuje fale dźwiękowe o wysokim natężeniu do usprawniania mieszania, transportu masy i kinetyki reakcji podczas budowania łańcucha peptydowego. Kawitacja akustyczna pomaga reagentom wnikać do spęczniałej żywicy, dysperguje agregaty i przyspiesza etapy sprzęgania, usuwania grup ochronnych, przemywania i odszczepiania.
Jak ultradźwięki usprawniają syntezę peptydów w fazie stałej?
W syntezie peptydów w fazie stałej wspomaganej ultradźwiękami (US-SPPS) sonikacja poprawia kontakt między peptydem związanym z żywicą a rozpuszczonymi reagentami. Może to skracać cykle reakcyjne, sprzyjać pełniejszemu sprzęganiu i ograniczać delecje w sekwencji, szczególnie podczas syntezy peptydów hydrofobowych, podatnych na agregację lub trudnych z innych względów.
Czy sonikacja może zwiększać wydajność syntezy i czystość peptydów?
Sonikacja może poprawiać konwersję, wydajność otrzymywania surowego produktu i czystość, sprzyjając równomiernemu rozprowadzeniu reagentów i ograniczając niepełne sprzęganie. Wynik zależy od sekwencji peptydu, żywicy, rozpuszczalnika, chemicznej metody sprzęgania i parametrów ultradźwięków, dlatego każdy proces należy zoptymalizować i zwalidować analitycznie.
Które etapy syntezy peptydów można poddawać sonikacji?
Ultradźwięki mogą wspomagać pęcznienie żywicy, usuwanie grup ochronnych Fmoc lub Boc, sprzęganie aminokwasów, przemywanie, kondensację fragmentów, cyklizację i odszczepianie od stałego nośnika. Mogą również usprawniać rozpuszczanie i transport masy w syntezie peptydów w fazie ciekłej oraz syntezie wspomaganej znacznikiem.
Poznaj ultradźwiękową syntezę peptydów – do syntezy peptydów w fazie stałej oraz – syntezę w fazie ciekłej techniką TAGGING!
Czy ultradźwiękowa synteza peptydów nadaje się do trudnych sekwencji?
Tak. Ultradźwięki są szczególnie przydatne w przypadku sekwencji hydrofobowych i podatnych na agregację, ponieważ kawitacja i mikroprzepływy pomagają rozbijać agregaty na żywicy i poprawiać dostęp reagentów do miejsc reaktywnych. Trudne sprzęgania mogą nadal wymagać zoptymalizowanych reagentów, powtórnego sprzęgania lub dostosowania warunków reakcji.
Czy można zwiększać skalę ultradźwiękowej syntezy peptydów?
Ultradźwiękową syntezę peptydów można przenieść z prób laboratoryjnych do produkcji okresowej, recyrkulacyjnej lub prowadzonej w przepływie ciągłym. Zwiększanie skali osiąga się przez utrzymywanie krytycznych parametrów, takich jak amplituda, energia właściwa, temperatura i czas przebywania, przy jednoczesnym zwiększaniu mocy ultradźwięków, powierzchni sonotrody lub liczby modułów procesowych.
Co oznacza liniowa skalowalność w obróbce ultradźwiękowej?
Liniowa skalowalność oznacza, że wydajność przetwarzania może wzrastać w przybliżeniu proporcjonalnie do zainstalowanej mocy ultradźwięków, gdy wymagana energia na jednostkę objętości i pozostałe warunki procesu pozostają stałe. Na przykład podwojenie efektywnej mocy ultradźwięków może w przybliżeniu podwoić natężenie przepływu, pod warunkiem zachowania geometrii reaktora, temperatury i docelowych parametrów jakości produktu.
Dlaczego sonikatory Hielscher nadają się do zwiększania skali produkcji peptydów?
Sonikatory Hielscher obejmują laboratoryjne, pilotażowe i przemysłowe zakresy mocy, wykorzystując spójne parametry pracy, które można kontrolować. Regulowana amplituda, automatyczna rejestracja danych, monitorowanie temperatury i ciśnienia, kompatybilność z komorami przepływowymi oraz konfiguracje modułowe wspierają powtarzalne przenoszenie procesu i niezawodną produkcję.
Czy sonikatory Hielscher mogą pracować w ciągłej produkcji peptydów?
Tak. Przemysłowe sonikatory Hielscher można integrować z obiegami recyrkulacyjnymi i przepływowymi reaktorami z komorami przepływowymi pracującymi w sposób ciągły. Konfiguracje te zapewniają kontrolowany czas przebywania i dopływ energii, jednocześnie ograniczając różnice między partiami. Systemy przemysłowe są zaprojektowane do ciągłej pracy 24/7 w wymagających warunkach produkcyjnych.
Czy do syntezy peptydów lepsze są łaźnie ultradźwiękowe, czy sonikatory sondowe?
Łaźnie ultradźwiękowe mogą być wygodne do wstępnych badań przesiewowych i jednoczesnej obróbki małych zamkniętych naczyń. Sonikatory sondowe dostarczają ultradźwięki bezpośrednio do ośrodka, oferując wyższe natężenie, lepszą kontrolę parametrów i większą skalowalność. Dlatego sonotrody i komory przepływowe są na ogół preferowane w produkcji pilotażowej i przemysłowej.
Jak kontroluje się temperaturę podczas ultradźwiękowej syntezy peptydów?
Ponieważ sonikacja wprowadza energię do mieszaniny reakcyjnej, skuteczne chłodzenie jest niezbędne. Sonikatory Hielscher są dostępne z naczyniami z płaszczem, zewnętrznymi wymiennikami ciepła, recyrkulacją z kontrolą temperatury i sonikacją impulsową, dzięki czemu skutecznie zapobiega się przegrzewaniu. Podłączane czujniki temperatury i programowalne limity temperatury umożliwiają niezawodne monitorowanie i rejestrowanie temperatury przez cały okres opracowywania procesu i produkcji.
Jak wybrać sonikator Hielscher do syntezy peptydów?
Wybór zależy od objętości partii, pożądanego natężenia przepływu, rozpuszczalnika, lepkości, stężenia substancji stałych lub żywicy, wymaganej energii właściwej i harmonogramu produkcji. Badania laboratoryjne określają zakres parametrów skutecznego prowadzenia procesu, po czym można dobrać sonikator Hielscher, sonotrodę i konfigurację komory przepływowej do planowanej wydajności przetwarzania.
Literatura / Źródła
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe w rozmiarach od laboratoryjnych po przemysłowe.