Ultradźwiękowa synteza peptydów z wykorzystaniem techniki TAGGING

Synteza peptydów stanowi fundament badań i rozwoju w farmacji, jednak konwencjonalne metody – synteza peptydów w fazie stałej (SPPS) i klasyczne sprzęganie w roztworze – pozostają pracochłonne, powodują marnotrawstwo odczynników i są trudne do skalowania. Wydajniejsza alternatywa powstała dzięki połączeniu dwóch ortogonalnych strategii: techniki TAGGING (tymczasowej grupy kotwiczącej) do budowania peptydów w roztworze oraz obróbki ultradźwiękowej (sonochemicznej) przyspieszającej etapy sprzęgania, usuwania grup ochronnych i obróbki mieszaniny poreakcyjnej. Razem umożliwiają produkcję peptydów terapeutycznych – takich jak lipobaktyna, lipopeptyd o działaniu antybiotycznym i przeciwnowotworowym – od skali gramowej po skalę masową, z wysoką czystością, mniejszym nakładem pracy związanym z oczyszczaniem i znacznie mniejszą liczbą czynności ręcznych.

Jakie korzyści daje ultradźwiękowa synteza peptydów?

• Ekonomiczność syntezy w roztworze: Reakcje przebiegają w roztworze przy znacznie mniejszym zużyciu aminokwasów niż w syntezie peptydów w fazie stałej
• Oczyszczanie przez filtrację: Peptyd związany z TAG wytrąca się w rozpuszczalnikach polarnych, dzięki czemu produkty pośrednie izoluje się przez prostą filtrację – bez konieczności stosowania chromatografii kolumnowej ani charakteryzowania produktu po każdym etapie.
• Ogromna oszczędność pracy: Wyeliminowanie oczyszczania produktów pośrednich i kontroli widm pozwala zaoszczędzić znaczną liczbę roboczogodzin w całym cyklu syntezy.
• Przyspieszenie sonochemiczne: Sonikacja skraca każdy kluczowy etap – usuwanie grupy ochronnej Fmoc, sprzęganie łańcuchów bocznych, cyklizację i usuwanie wszystkich grup ochronnych – bez pogorszenia selektywności.
• Wysokie wydajności, wysoka czystość: Każde sprzęganie fragmentów i końcowe połączenie ich w lipobaktynę przebiegają z wysoką wydajnością; usunięcie wszystkich grup ochronnych daje produkt docelowy z wydajnością ~83 %.
• Gotowość do produkcji masowej: Technika TAGGING jest wyraźnie opisywana jako umożliwiająca otrzymywanie peptydów w skali masowej z najwyższą czystością, co czyni ją praktyczną drogą do uzyskiwania gramowych i kilogramowych ilości lipopeptydów o znaczeniu terapeutycznym.
• Pełna kompatybilność metod: Podejście to jest w pełni kompatybilne z konwencjonalną SPPS i chemią w roztworze, dlatego dotychczasowe strategie stosowania grup ochronnych (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) oraz odczynniki sprzęgające (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) można stosować bez zmian.

Czym jest technika TAGGING?

W podejściu TAG fragment peptydu jest kowalencyjnie przyłączony do usuwalnej, przypominającej żywicę grupy kotwiczącej (TAG), która pozostaje w roztworze. Pozwala to postępować z rosnącym łańcuchem jak z peptydem w fazie stałej, ale w fazie ciekłej:

• Po każdym sprzęganiu lub usunięciu grup ochronnych peptyd związany z TAG odzyskuje się jako ciało stałe przez prostą filtrację lub wytrącanie w środowisku polarnym lub antyrozpuszczalnikowym, a rozpuszczalne zanieczyszczenia i produkty uboczne są wymywane.
• Ponieważ peptyd pozostaje przyłączony do łącznika, chromatografia kolumnowa i pełna charakterystyka każdego produktu pośredniego są w dużej mierze wyeliminowane, co pozwala zaoszczędzić dużo czasu i pracy.
• Reakcje można prowadzić w roztworze, zużywając znacznie mniej aminokwasów niż w SPPS, a produkt końcowy uwalnia się przez odszczepienie grupy TAG pod koniec syntezy.

 
W przypadku lipobaktyny w retrosyntezie wykorzystano trzy fragmenty – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH oraz fragment lipidowy C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – sprzęgane zgodnie ze strategią kondensacji fragmentów w celu uzyskania długiego peptydu z bardzo wysokimi wydajnościami. (por. Ramya et al., 2025)

Całkowita synteza peptydu lipobaktyny wspomagana przez TAG jest przyspieszana przez sonikację.
(Badanie: Ramya et al., 2025)

Jak sonikacja usprawnia syntezę peptydów w roztworze

Obróbka ultradźwiękowa służy do intensyfikacji i skrócenia kluczowych etapów prowadzonych w roztworze. W syntezie lipobaktyny opisanej przez Ramya et al. (2025) sonikację stosuje się do:

Ponieważ chemia TAG już sama dostarcza produkty pośrednie w postaci ciał stałych możliwych do oddzielenia przez filtrację, obróbka ultradźwiękowa i TAGGING wzajemnie się uzupełniają: ultradźwięki przyspieszają przenoszenie masy, mieszanie i kinetykę reakcji, a grupa kotwicząca utrzymuje peptyd w postaci możliwego do odzyskania ciała stałego, zapewniając czysty przebieg procesu z ograniczonym wykorzystaniem chromatografii.

Łatwe zwiększanie skali produkcji peptydów o wysokiej czystości dzięki sonikacji

Częstym wyzwaniem przy przenoszeniu procesów wytwarzania peptydów i leków peptydowych ze skali laboratoryjnej do produkcyjnej jest zachowanie efektu sonochemicznego przy większych objętościach i przepływie ciągłym. Hielscher rozwiązuje ten problem dzięki pełnej gamie procesorów ultradźwiękowych, od skali laboratoryjnej po pełną skalę przemysłową, zapewniających zwalidowaną, powtarzalną moc i udokumentowaną kontrolę procesu.
 

Przemysłowy sonikator UIP4000hdT (4000W, 20kHz) do syntezy peptydów wspomaganej ultradźwiękami

Literatura / Źródła

• M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
• Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
• Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
• M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.