Synteza peptydów metodą ultradźwiękową z wykorzystaniem techniki TAGGING
Synteza peptydów stanowi fundament badań i rozwoju w branży farmaceutycznej, jednak konwencjonalne metody – synteza peptydów w fazie stałej (SPPS) oraz klasyczne sprzęganie w fazie roztworowej – nadal są pracochłonne, powodują marnotrawstwo odczynników i trudne do skalowania. Bardziej wydajną alternatywą okazało się połączenie dwóch ortogonalnych strategii: techniki TAGGING (temporary anchoring group) służącej do syntezy peptydów w fazie roztworowej oraz przetwarzania ultradźwiękowego (sonochemicznego) w celu przyspieszenia etapów sprzęgania, usuwania grup ochronnych i oczyszczania. Połączenie tych metod umożliwia produkcję peptydów terapeutycznych na skalę od gramów do masową. – takie jak lipobaktyna – lipopeptyd o działaniu antybiotycznym i przeciwnowotworowym – charakteryzujące się wysoką czystością, mniejszym nakładem pracy związanym z oczyszczaniem oraz znacznie mniejszą liczbą czynności wykonywanych ręcznie.
Jakie zalety ma synteza peptydów metodą ultradźwiękową?
- Ekonomia fazy roztworowej: Reakcje przebiegają w roztworze przy znacznie mniejszym zużyciu aminokwasów niż w przypadku syntezy peptydów w fazie stałej
- Oczyszczanie oparte na filtracji: Peptyd związany z białkiem TAG wytrąca się w rozpuszczalnikach polarnych, więc produkty pośrednie izoluje się poprzez zwykłą filtrację – nie jest wymagana chromatografia kolumnowa ani charakterystyka na poszczególnych etapach.
- Ogromna oszczędność nakładu pracy: Wyeliminowanie pośrednich etapów oczyszczania i kontroli spektralnej pozwala zaoszczędzić znaczną liczbę godzin pracy w ramach całego cyklu syntezy.
- Przyspieszenie sonochemiczne: Ultradźwiękowanie skraca każdy kluczowy etap – Usunięcie grupy Fmoc, sprzęganie łańcuchów bocznych, cyklizacja i całkowite usunięcie grup ochronnych – bez uszczerbku dla selektywności.
- Wysoka wydajność, wysoka czystość: Każda reakcja sprzęgania fragmentów oraz końcowe połączenie cząsteczki lipobaktyny przebiegają z wysoką wydajnością; całkowite usunięcie grup ochronnych pozwala uzyskać związek docelowy z wydajnością wynoszącą około 83 %.
- Gotowość na dużą skalę: Technika TAGGING została wyraźnie opisana jako umożliwiająca przygotowywanie peptydów na dużą skalę z zachowaniem najwyższej czystości, co czyni ją praktyczną metodą uzyskiwania lipopeptydów o znaczeniu terapeutycznym w ilościach rzędu gramów i kilogramów.
- Pełna zgodność metod: Metoda ta jest w pełni zgodna z konwencjonalną chemią SPPS i chemią w fazie roztworowej, dzięki czemu dotychczasowe strategie stosowania grup ochronnych (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) oraz środków sprzęgających (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) mogą być stosowane bez zmian.
Opowiedz nam o wyzwaniach związanych z procesem syntezy peptydów. Nasi eksperci ds. sonikacji zaproponują Ci idealną konfigurację sonikatora dostosowaną do Twoich celów w zakresie produkcji peptydów!
Sonikator przemysłowy UIP2000hdT z reaktorem do produkcji farmaceutycznej, służącym do usprawnienia syntezy peptydów
Czym jest technika TAGGINGU?
W metodzie TAG fragment peptydowy jest kowalencyjnie przyłączony do usuwalnej grupy kotwiczącej (TAG) o właściwościach podobnych do żywicy, która pozostaje w roztworze. Dzięki temu powstający łańcuch można traktować jak peptyd w fazie stałej, ale w fazie ciekłej:
- Po każdym sprzężeniu lub usunięciu grupy ochronnej peptyd związany z TAG-iem jest odzyskiwany w postaci substancji stałej poprzez prostą filtrację lub strącanie w środowisku polarnym lub w rozpuszczalniku przeciwstawnym, podczas gdy rozpuszczalne zanieczyszczenia i produkty uboczne są wypłukiwane.
- Ponieważ peptyd pozostaje przyłączony do łącznika, w znacznym stopniu eliminuje to konieczność stosowania chromatografii kolumnowej oraz pełnej charakterystyki każdego półproduktu, co pozwala zaoszczędzić sporo czasu i wysiłku.
- Reakcje można przeprowadzać w fazie roztworowej, zużywając znacznie mniej aminokwasów niż w przypadku metody SPPS, a produkt końcowy jest uwalniany w wyniku odszczepienia grupy TAG pod koniec syntezy.
W przypadku lipobaktyny w retrosyntezie wykorzystano trzy fragmenty – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH oraz fragment lipidowy C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – w połączeniu ze strategią kondensacji fragmentów, co pozwala uzyskać długi peptyd z bardzo wysoką wydajnością. (por. Ramya i in., 2025)
Pełna synteza peptydu lipobaktyny z wykorzystaniem technologii TAG przebiega szybciej dzięki zastosowaniu ultradźwięków.
(Badanie: Ramya i in., 2025)
W jaki sposób sonikacja usprawnia syntezę peptydów w fazie roztworowej
Ultradźwiękowanie stosuje się w celu intensyfikacji i skrócenia kluczowych etapów zachodzących w fazie roztworowej. W syntezie lipobaktyny opisanej przez Ramya i in. (2025) sonikację stosuje się w celu:
Ponieważ w procesie TAG produkty pośrednie występują już w postaci substancji stałych nadających się do filtrowania, ultrasonikacja i technika TAGGING wzajemnie się uzupełniają: ultradźwięki przyspieszają transfer masy, mieszanie i kinetykę reakcji, podczas gdy kotwica utrzymuje peptyd w postaci substancji stałej, którą można odzyskać, co pozwala na czysty proces o niewielkim nakładzie chromatografii.
Sonicator UP200St: Reaktor z mieszaniem ultradźwiękowym do przyspieszonej syntezy peptydów.
Łatwe zwiększanie skali produkcji peptydów o wysokiej czystości z wykorzystaniem ultradźwięków
Częstym wyzwaniem przy przenoszeniu procesów związanych z peptydami i lekami peptydowymi z etapu badań laboratoryjnych do produkcji jest zachowanie efektu sonochemicznego przy większych objętościach i przepływie ciągłym. Firma Hielscher rozwiązuje ten problem, oferując szeroką gamę procesorów ultradźwiękowych — od urządzeń laboratoryjnych po urządzenia na pełną skalę przemysłową — zapewniających sprawdzoną, powtarzalną moc oraz udokumentowaną kontrolę procesu.
Przemysłowy sonikator UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) do syntezy peptydów wspomaganej ultradźwiękami
Najczęściej zadawane pytania dotyczące syntezy peptydów TAG wspomaganej ultradźwiękami
Czym jest synteza peptydów w fazie ciekłej (LPPS)?
Synteza peptydów w fazie ciekłej (LPPS) to metoda polegająca na stopniowym budowaniu peptydów w roztworze przy użyciu klasycznych narzędzi chemii organicznej. Jest to jedna z czterech głównych metod wytwarzania peptydów, znana z tego, że jest opłacalna, skalowalna i najbardziej przyjazna dla środowiska spośród wszystkich metod syntezy peptydów. Metoda ta nadaje się szczególnie dobrze do krótszych peptydów, choć w przypadku dłuższych sekwencji mogą pojawić się trudności związane z utrzymaniem spójności reakcji, rozpuszczalnością oraz usuwaniem niepożądanych produktów ubocznych.
W jaki sposób ultradźwięki usprawniają syntezę peptydów w fazie ciekłej?
Ultradźwięki (sonikacja) usprawniają proces LPPS poprzez przyspieszenie zarówno etapu sprzęgania, jak i usuwania grupy ochronnej. Fale ultradźwiękowe poprawiają transfer masy i kinetykę reakcji, co prowadzi do:
- Skrócenie czasu reakcji: cykle sprzęgania i odłączania zabezpieczeń można znacznie skrócić
- Wyższe plony: bardziej kompletna konwersja na każdym etapie
- Zwiększona czystość produktu surowego: mniej niekompletnych produktów ubocznych sprzężenia
- Mniejsze zużycie odczynników: potrzeba mniejszej ilości odpowiedników odczynników sprzęgających i aminokwasów ze względu na szybsze i wydajniejsze reakcje
Czym jest synteza peptydów wspomagana technologią TAG (TAPS)?
Synteza peptydów wspomagana znacznikami (TAPS) stanowi szczególny przypadek syntezy peptydów w fazie ciekłej, w której peptydy są budowane krok po kroku w roztworze przy użyciu rozpuszczalnych znaczników organicznych zamiast nośnika stałego. Znaczniki te, analogiczne do nośników stałych stosowanych w syntezie SPPS, ułatwiają izolację po każdym etapie syntezy, umożliwiając separację poprzez strącanie, filtrację lub ekstrakcję. Znaczniki muszą rozpuszczać się w rozpuszczalnikach organicznych, pozostając jednocześnie odróżnialnymi od innych substancji.
W jaki sposób ultradźwięki usprawniają proces TAGGINGU?
Gdy ultradźwiękowanie łączy się z syntezą wspomaganą techniką TAG, korzyści obejmują:
- Szybsze cykle sprzęgania i odblokowywania – ultradźwięki przyspieszają reakcje w fazie roztworowej, skracając czas trwania poszczególnych etapów
- Zwiększona rozpuszczalność i przenoszenie masy – kawitacja ultradźwiękowa pomaga zachować jednorodność znakowanego peptydu w roztworze, co ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozpuszczalność stanowi główną zaletę metody TAPS w porównaniu z metodą SPPS
- Zmniejszona ilość odczynników – wyższa wydajność reakcji oznacza, że potrzeba mniej równoważników aminokwasów i odczynników sprzęgających
- Bardziej wyczerpujące reakcje – zmniejszenie ilości niekompletnych produktów ubocznych sprzężenia, co prowadzi do wyższej czystości surowca i uproszczenia dalszego procesu oczyszczania
Godnym uwagi przykładem jest całkowita synteza lipobaktyny z wykorzystaniem techniki TAG i ultradźwięków, która wykazała, że technika TAGGING jest w pełni kompatybilna z metodami stosowanymi w fazie roztworowej, a ultradźwięki zapewniają wysoką wydajność na każdym etapie. (por. Ramya i in., 2025)
Jakie długości peptydów można uzyskać przy użyciu metody TAPS wspomaganej ultradźwiękami?
Peptydy krótkie i średniej długości (~5–20 reszt) stanowią optymalny zakres, w którym metoda TAPS zapewnia wysoką czystość i wiarygodne wyniki.
Dłuższe peptydy można uzyskać za pomocą strategii kondensacji fragmentów: mniejsze fragmenty (6–10-mery) są syntetyzowane z wykorzystaniem tagu, a następnie łączone ze sobą w celu uzyskania pełnej długości docelowego peptydu.
W przypadku bardzo długich lub złożonych celów można zastosować podejście hybrydowe łączące metody SPPS i TAPS.
Dowiedz się, w jaki sposób sonikacja usprawniła syntezę peptydów w fazie stałej (SPPS)!
Czy synteza peptydów w fazie ciekłej wspomagana ultradźwiękami może zostać wdrożona na skalę przemysłową?
Tak, przemysłowe ultradźwiękowce – takie jak modele Hielscher UIP2000hdT lub UIP4000hdT – można je zintegrować z reaktorami okresowymi i komorami przepływowymi, co umożliwia produkcję peptydów na dużą skalę. Modernizacja istniejących reaktorów pozwala usprawnić dotychczasowe procesy syntezy peptydów.
Jakie są główne zalety ultradźwiękowego systemu LPPS w porównaniu z konwencjonalnym systemem LPPS?
- Prędkość: Czas reakcji ulega znacznemu skróceniu na każdym etapie sprzęgania i usuwania grupy ochronnej.
- Wydajność: Wyższe wydajności na poszczególnych etapach prowadzą do wyższej wydajności całkowitej w przypadku peptydów zawierających wiele reszt.
- Zrównoważony rozwój: mniej równoważników odczynników i potencjalnie mniej rozpuszczalnika dzięki szybszym reakcjom.
- Dostępność: wymaga jedynie standardowej wanny ultradźwiękowej, bez specjalistycznego sprzętu.
- Zgodność: działa z typowymi odczynnikami sprzęgającymi (DIC, HATU, TBTU, Oxyma itp.) oraz strategiami wykorzystującymi grupy ochronne (Boc, Fmoc).
Literatura / Referencje
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Ultradźwiękowy CupHorn do intensywnego sonikowania zamkniętych probówek i fiolek w celu sterylnego sonikowania peptydów.
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe od laboratorium do rozmiar przemysłowy.