세균 시료의 초음파를 이용한 세포 분산
세균 시료가 진정한 단일 세포 현탁액 형태로 도착하는 경우는 드뭅니다. 배양된 세균은 사슬이나 응집체 형태로 자라며, 환경에서 분리된 균주는 세포외 고분자 물질에 의해 결합된 응집체를 형성하고, 원심분리된 침전물은 철저한 보텍싱을 거치더라도 재현탁이 잘 되지 않는 경우가 많습니다. 생존 세균 수 측정, 광학 밀도 측정, 유세포 분석 및 미생물군집 프로파일링은 모두 하나의 입자가 하나의 세포에 해당한다고 가정합니다. 초음파 세포 분산법은 이러한 모순을 해결합니다. 짧고 제어된 초음파 처리를 통해 응집체를 세포를 용해시키지 않고 단일 세포로 분리합니다.
세포 응집이 연구 결과를 왜곡하는 이유
응집은 생물학적 특성이지, 시료 전처리 오류가 아닙니다. 포도상구균, 연쇄상구균, 유산균, 방선균 및 많은 환경 미생물은 사슬, 군집 또는 생물막 조각 형태로 증식하며, 세포외 DNA와 다당류가 세포들을 서로 붙들어 뭉치게 하여 펠릿과 면봉 용출액에서 응집체를 형성합니다. 이로 인한 분석적 결과는 체계적입니다:
- 군집 수는 과소평가되는데, 이는 하나의 덩어리가 포함된 세포의 수와 관계없이 하나의 군집을 형성하기 때문이다.
- 광학 밀도 및 입자 계수기는 세포 대신 응집체를 측정하므로, 성장 곡선에 편향을 초래합니다.
- 유세포 분석 및 세포 선별 과정에서는 뭉쳐진 세포를 잘못 집계하여 분석에서 제외합니다.
- DNA 및 단백질 추출물은 응집체 표면에 있는 세포만을 반영하므로, 미생물군집 및 오믹스 데이터에 편향을 초래합니다.
기존의 처리 방법은 속도가 느리거나, 불완전하거나, 화학적 변화를 일으킵니다. 격렬한 피펫팅과 보텍싱을 해도 미세 응집체는 남아 있게 됩니다. 효소나 킬레이트제를 이용한 분산 방법은 분석하고자 하는 세포 표면을 변형시킬 수 있습니다. 제어된 캐비테이션을 통한 기계적 분산 처리는 몇 초 만에 효과를 발휘하며, 첨가제가 필요하지 않습니다.
하나의 집합체는 하나의 군락에 해당한다 – 그리고 잘못된 결과 하나. 초음파 분산 기술이 세포 용해, 에어로졸 발생, 프로브 취급 없이 진정한 단일 세포 현탁액을 어떻게 생성하는지 확인해 보세요. 자세한 정보를 요청하세요!
멀티 튜브 소닉레이터 바이알트위터 비접촉식 시료 전처리를 위해: 밀봉된 튜브 내의 세포 덩어리를 분산시키십시오.
초음파 처리가 세포를 용해시키지 않고 어떻게 분산시키는가
초음파를 이용한 세포 분산 기술은 기계적 강도의 차이를 이용합니다. 박테리아 응집체는 비교적 약한 세포 간 결합과 세포외 기질에 의해 서로 묶여 있는 반면, 온전한 세포막은 훨씬 더 높은 전단력을 견뎌냅니다. 보정된 초음파가 현탁액에 유입되면, 음향 캐비테이션에 의해 미세 유동, 압력 펄스 및 전단력이 발생하며, 이들은 먼저 응집체의 경계면에서 작용합니다. 막이 파열(용해)되는 에너지 수준에 도달하기 전에 덩어리, 사슬 및 생물막 파편이 전단 작용을 통해 분리됩니다(분산).
초음파를 이용한 세균 세포 덩어리의 분산
분해 또는 용해 – 초음파 처리 매개변수의 중요성
실질적인 결과는, 분산과 용해가 서로 다른 매개변수로 작동되는 동일한 장비라는 점입니다. 적당한 진폭, 짧은 펄스 주기 및 제어된 온도 조건에서 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 진폭, 노출 시간 또는 시료 온도를 높이면 세포 내 표적을 대상으로 하는 완전한 세포 파열 과정으로 전환됩니다. Hielscher 발생기를 사용하면 진폭, 출력, 펄스 및 에너지 입력을 정밀하게 설정하고 해당 방법을 저장할 수 있으므로, 분산 단계가 시료, 작업자 및 실행에 관계없이 재현 가능합니다.
효율적인 비접촉식 초음파 처리
욕조 방식의 초음파 처리는 이러한 정밀도를 따라갈 수 없습니다. 초음파 세척 욕조와 탱크는 낮은 수준의 초음파 에너지만을 제공하기 때문에 시료 전처리가 불완전할 뿐만 아니라, 캐비테이션이 고르지 않게 발생하여 각 튜브는 욕조 내 위치에 따라 서로 다른 처리를 받게 됩니다. VialTweeter는 강력하고 집중된 초음파 에너지를 용기 벽을 통해 직접 전달하여, 최대 10개의 밀봉된 시료를 동시에 처리합니다. 세척조에서 장시간에 걸쳐 노출 시간을 조절해야 하는 처리 과정도 표준화된 펄스 패턴으로 완료됩니다.
Hielscher의 비접촉식 초음파 처리기(sonicator)는 밀폐된 바이알의 벽을 통해 강력하고 집중된 초음파를 전달합니다. VialTweeter는 시료 내에 프로브를 삽입할 필요 없이, 교차 오염이나 에어로졸 방출 없이 최대 10개의 바이알을 동일한 강도로 동시에 처리합니다. 처리량이 많은 경우, UIP400MTP 및 UIP550MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기는 멀티웰 플레이트에도 동일한 제어된 에너지 전달을 제공합니다.
VialTweeter (바이알트위터) 최대 10개의 작은 바이알과 최대 5개의 큰 시험관을 동시에 초음파 처리합니다.
비접촉식 초음파 분산법의 장점
- 교차 오염이 전혀 없음: 바이알은 항상 밀폐된 상태로 유지되며, 시료에 프로브가 담그어지지 않기 때문에 교차 오염과 시료 손실을 완전히 방지할 수 있습니다. 시료 분석 사이에 멸균해야 할 부분이 없으며, 한 번의 분석 결과가 다음 분석에 영향을 미치지 않습니다.
- 에어로졸 방지: 개방형 프로브 초음파 처리는 감염성 에어로졸을 발생시키고 기기 표면을 오염시킵니다. 밀폐형 바이알 초음파 처리는 시료를 전용 튜브 안에 밀폐시켜 두기 때문에, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 기타 BSL-2 또는 BSL-3 등급 병원체를 취급할 때 특히 중요합니다.
- 팁 마모 없음: 티타늄 프로브는 작동 중에 시료로 소량의 미세 입자를 방출할 수 있습니다. 이러한 입자들은 후단 공정에서 광학 밀도와 입자 수에 변화를 일으킵니다. 용기 벽을 통한 간접 초음파 처리는 이러한 고형물의 발생 원인을 완전히 제거합니다.
- 일정한 처리량: VialTweeter는 최대 10개의 바이알 각각에 동일한 초음파 강도를 전달하므로, 초음파 처리에 대한 결과가 균일하고 재현성이 뛰어납니다. 초음파 욕조나 단일 시료 프로빙에서 흔히 발생하는 위치에 따른 영향이 사라지며, 반복 실험 간에도 기준선을 일관되게 유지할 수 있습니다.
- 시료의 무결성: 처리 과정 전반에 걸쳐 튜브가 밀폐된 상태를 유지하므로, 시료가 오염되거나 변질되거나 휘발될 우려가 없습니다. 추가 이송 단계를 거칠 수 없는 귀중한 임상용 펠릿을 포함하여, 소량의 시료도 희석 없이 처리할 수 있습니다.
- 순서 관리: 진폭은 20%에서 100%까지, 펄스 모드는 0%에서 100%까지 조절할 수 있으며, 이 시스템은 온도 모니터링 기능을 지원하여 온도에 민감한 균주와 단백질이 손상이 발생하는 임계치 이하로 유지되도록 합니다.
일반적인 애플리케이션
- 미생물군집 및 장 내용물 분석: 배양 또는 시퀀싱 전에 락토바실러스, 비피도박테리움 및 분변 시료를 잘 흩뜨려, 덩어리로 인해 계수 결과가 낮게 나오지 않도록 한다.
- 식품 및 물 미생물학: 정확한 콜로니 수 및 생존력 측정을 위해 면봉, 헹굼액 및 배양액 내 플록을 분해하는 방법.
- 생물막 연구: 표면 단백질을 제거할 수 있는 효소 처리를 거치지 않고, 운반체 및 표면에서 세포를 단일 세포 현탁액 형태로 회수하는 방법.
- 임상 진단: 격리 조건 하에서 가래, 고름 및 면봉 추출물을 재현탁시키는 과정.
- 세포 배양: 계수 및 이식을 하기 전에 뭉쳐진 포유류, 곤충 및 CHO 세포 덩어리를 분리하는 과정.
- 전체 워크플로우 준비: 낮은 진폭에서는 세포를 분해하고, 더 높은 설정에서는 세포를 완전히 파쇄하는 동일한 장치를 사용하므로, 튜브를 옮길 필요 없이 용해, 단백질 추출 및 DNA 단편화 과정을 순차적으로 진행할 수 있습니다.
멀티 웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP 세포 덩어리의 고처리량 분산용
UIP400MTP 및 UIP550MTP 모델의 마이크로플레이트 초음파 처리기는 멀티웰 플레이트뿐만 아니라 튜브 랙도 처리할 수 있습니다.
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VialTweeter 멀티 튜브 초음파 발생기
무균 밀봉 바이알의 분산을 위한 최적의 방법입니다. 자동 튜닝 기능이 탑재된 26kHz, 200와트 출력의 UP200St 프로세서가 구동하며, VialTweeter는 최대 10개의 밀폐된 바이알 벽을 통해 동시에 간접적으로 초음파를 전달하며, 바이알당 최대 10W의 출력을 제공하여 교차 오염이나 시료 손실 없이 균일하고 재현성 높은 결과를 보장합니다. 티타늄 재질의 VialTweeter 소노트로드는 오토클레이브 처리가 가능하며, 진폭과 펄스를 조절 및 저장할 수 있어, 분산 프로토콜에 필요한 제어 범위를 충족합니다. 표준 10구 소노트로드는 오토샘플러 바이알, 마이크로 원심분리기 튜브, 1~5 mL 용량의 Eppendorf 또는 Nunc 튜브를 수용합니다. VialPress 클램핑 장치는 직경 최대 20 mm의 대형 용기 최대 5개를 처리할 수 있습니다.
Falcon 튜브용 및 용기 크기에 맞춰 맞춤 제작된 단일 바이알용 전용 VialTweeter 모델이 제공됩니다. 블록 소노트로드를 분해하면 UP200St 코어 유닛은 소형에서 중형 규모의 시료를 직접 처리할 수 있는 일반적인 프로브형 초음파 처리기로 작동합니다.
마이크로플레이트 초음파 처리기
멀티웰 플레이트 초음파 처리를 통한 고처리량 시료 전처리 확장: 플레이트 기반 워크플로우의 경우, 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP 및 UIP550MTP를 사용하면 10개의 튜브에서 전체 플레이트에 이르기까지 비접촉식 균일한 초음파 처리가 가능합니다.
400와트 용량의 UIP400MTP는 96웰 형식을 포함한 표준 마이크로타이터 및 멀티웰 플레이트를 처리하며, 정밀한 진폭, 출력 및 펄스 제어 기능은 물론 타이머, 온도 프로브 및 수조 냉각 기능을 갖추고 있습니다. 생물막 제거 및 박테리아 배양 처리는 UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기의 대표적인 응용 분야입니다.
550와트급 UIP550MTP는 더 강력한 성능을 자랑하는 모델입니다. – 더 까다로운 용도에 이상적입니다.
두 비접촉식 초음파 처리 시스템 모두 6웰, 12웰, 24웰, 48웰, 96웰 및 384웰 플레이스는 물론 튜브 랙과 페트리 접시까지 안정적으로 처리합니다. Hielscher 마이크로플레이트 초음파 처리는 모든 표준 플레이트와 호환되므로, 고가의 전용 소모품을 사용할 필요가 없습니다. 프로그래밍 가능한 온도 제한 기능을 통해, 시료 온도가 최대치에 도달하면 초음파 처리가 자동으로 일시 중지되고 냉각 후 재개되어, 반복적인 사이클에서도 세포 생존력을 보호합니다. 재현성 높은 결과를 위한 스마트하고 신뢰할 수 있는 고처리량 시료 전처리 솔루션입니다.
아래 표는 생명과학, 유전체학, 단백질체학 및 진단 분야에서 사용되는 당사의 실험실용 시료 초음파 처리기의 대략적인 처리 용량을 개괄적으로 보여줍니다:
| 권장 장치 | 배치 볼륨(Batch Volume) | 유량 |
|---|---|---|
| VialTweeter 멀티 튜브 초음파 발생기 | 00.5~1.5mL 바이알 | N.A. 개시 |
| UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기 (440와트) | Multi-well / Microtiter 플레이트 | N.A. 개시 |
| UIP550MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기 (550와트) | Multi-well / Microtiter 플레이트 | N.A. 개시 |
| 초음파 CupHorn | 바이알 또는 비커용 CupHorn | N.A. 개시 |
| UP100H 100와트 프로브형 초음파 처리기 | 1 내지 500mL | 10 내지 200mL/분 |
| UP200HT, UP200세인트 200와트 프로브형 초음파 처리기 모델 | 10 내지 1000mL | 20 - 200mL/분 |
| UP400St 400와트 프로브형 초음파 처리기 | 10 내지 2000mL | 20 내지 400mL/분 |
| GD미니2 | 무균 초음파 미세유동 반응기 | N.A. 개시 |
| 초음파 체 셰이커 | N.A. 개시 | N.A. 개시 |
초음파 세포 분리에 관한 자주 묻는 질문
세포 분산과 세포 용해의 차이점은 무엇인가요?
분산(disaggregation)은 응집 해체(deagglomeration)라고도 하며, 세포가 온전하고 생존 가능한 상태를 유지한 채로 뭉쳐 있는 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리하는 과정입니다. 용해는 세포막을 파열시켜 세포 내부의 내용물을 방출하는 과정입니다. 두 과정 모두 캐비테이션 전단력에 의해 발생하지만, 에너지 투입량에서 차이가 있습니다. 진폭, 펄스 및 온도 설정을 최적화하면 초음파 처리를 통해 용해 임계치 이하에서 분산 효과를 얻을 수 있습니다.
초음파 세척기는 왜 표준화된 분해 과정에 적합하지 않은가요?
욕조는 낮은 수준의 초음파 에너지만을 제공하므로 처리가 불완전할 뿐만 아니라, 탱크 전체에 걸쳐 캐비테이션이 매우 고르지 않게 발생하기 때문에 각 시료는 위치에 따라 서로 다른 처리를 받게 됩니다. 미생물 수 측정 및 비교 연구는 비교 가능성에 달려 있습니다. Multi-Tube Sonicator VialTweeter와 같은 비접촉식 초음파 처리기 및 마이크로플레이트용 초음파 처리기 모델인 UIP400MTP와 UIP550MTP는 모든 용기를 조정된 초음파 조건 하에서 처리하므로, 반복 실험 전반에 걸쳐 재현성을 향상시킵니다.
초음파 처리가 세포에 손상을 줄 수 있나요?
네, 매개변수를 적절히 조절하지 않으면 그렇습니다. 과도한 초음파 처리나 통제되지 않은 가열은 세포를 손상시킬 수 있으며, 방출된 DNA는 시료의 점도를 높이고 재응집을 촉진합니다. 그렇기 때문에 이 공정은 신중하게 개발되어야 합니다. 적당한 진폭, 펄스 사이클, 냉각 기능, 그리고 온도 제한 기능이 있는 장비를 사용하면 처리가 곡선의 분산 영역 내에서 이루어지도록 할 수 있습니다.
모든 Hielscher 디지털 초음파 처리기는 정밀한 매개변수 제어, 탈부착 가능한 온도 센서, 프로그래밍 가능한 설정 및 자동 데이터 기록 기능을 제공하여 신뢰할 수 있는 시료 전처를 가능하게 합니다.
시료를 다른 용기로 옮겨야 합니까?
아닙니다. 바이알과 플레이트는 원래의 밀봉된 용기 상태에서 처리됩니다. 간접 초음파 처리를 통해 이송 시 발생하는 손실과 프로브 취급 시 발생하는 이물 혼입을 모두 방지할 수 있습니다.
VialTweeter는 어떤 형태의 바이알을 처리할 수 있나요?
표준 10구 소노트로드는 오토샘플러 바이알, 마이크로 원심분리 튜브, 그리고 1~5mL 용량의 에펜도르프(Eppendorf) 또는 누크(Nunc) 튜브를 사용할 수 있습니다. VialPress 액세서리는 직경 최대 20mm의 대형 용기 최대 5개까지 수용할 수 있습니다. Falcon 튜브 및 맞춤형 단일 바이알 또는 더 큰 규격의 용기를 위한 전용 Single-Tube VialTweeter 모델도 제공됩니다.
하나의 기기로 세포를 분리한 다음 용해할 수 있나요?
네. 적당한 진폭에서 세포를 분해하는 동일한 장치를 사용하면, 진폭을 높이고 노출 시간을 늘릴 경우 세포를 완전히 분해할 수 있으므로, 플랫폼을 변경하지 않고도 단일 세포 현탁액 준비와 후속 추출 과정을 연속적으로 진행할 수 있습니다.
MBEC 분석에 초음파 처리가 사용되나요?
초음파 처리는 확립된, 대체로 표준적인 절차입니다. 페그-뚜껑 MBEC 분석법에서, 폴리스티렌 페그 위에 생물막이 형성되고 항생제에 노출된 후, 페그를 새로운 배지로 옮겨 보텍싱과 초음파 처리를 실시하여 부착된 생물막 세포를 분리 및 분산시켜 플랑크톤 현탁액으로 만든 다음, 연속 희석 및 생존 세포 수 측정을 수행합니다 (MBEC는 처리되지 않은 생물막에 비해 회수된 세포 수를 ≥3 log10 감소시키는 최저 농도로 판독됩니다). 초음파 처리는 분산 품질을 크게 향상시킵니다. EPS 매트릭스에서 매립된 세포가 불완전하게 방출되면 박멸률이 과소평가되고 MBEC 값이 부풀려집니다. 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP를 사용하여 분석 플레이트 전반에 걸쳐 PEG 홀더 웰을 표적 초음파 처리함으로써, 욕조식 초음파 처리의 전통적인 단점을 극복할 수 있습니다. – 즉, 에너지 분포의 불균형, 발열 및 에어로졸/교차 오염 위험 등이다.
비접촉식 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP가 MBEC 분석을 어떻게 용이하게 하는지 알아보세요!
MIC 분석에 초음파 처리가 사용되나요?
효율성과 재현성을 높이기 위해 MIC와 관련된 다양한 작업 단계에서 초음파 처리가 적용됩니다:
- 마이코박테리아학 분야에서는 감수성 검사를 실시하기 전에 가래 및 기타 점성이 있는 검체를 일상적으로 오염 제거하고 균질화하며, 때로는 초음파 처리를 하기도 하는데, 덩어리를 형성하는 마이코박테리아 접종균의 경우 정확한 MIC 값을 얻기 위해 잠시 분산시키는 것이 도움이 된다;
- 미세 응집체가 접종액의 밀도를 왜곡시키는 응집 경향이 있는 미생물(예: 펠릿 형태의 연쇄상구균, 포도상구균) 및;
- 인공 관절 감염의 경우, 임플란트 초음파 세척 및 배양 검사에 이어 감수성 검사를 실시하는 등 복합적인 진단법(전통적인 MIC 방식이 아닌 MBEC 방식과 유사한 적용법).
문헌 / 참고문헌
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
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