세균 시료의 초음파 세포 응집 해체
세균 시료가 진정한 단일 세포 현탁액 상태로 제공되는 경우는 드뭅니다. 배양된 세균은 사슬과 플록을 형성하며 성장하고, 환경 분리주는 세포외 고분자 물질로 결합된 응집체를 형성하며, 원심분리된 펠릿은 충분히 보텍싱해도 재현탁이 잘 되지 않는 경우가 많습니다. 생균수 측정, 광학 밀도 측정, 유세포 분석 및 마이크로바이옴 프로파일링은 모두 입자 하나가 세포 하나에 해당한다고 가정합니다. 초음파 세포 응집 해체는 이러한 불일치를 해결합니다. 짧고 제어된 초음파 펄스를 가하면 세포를 용해하지 않고 응집체를 개별 세포로 분리할 수 있습니다.
세포 응집이 결과의 신뢰성을 떨어뜨리는 이유
응집은 시료 전처리 오류가 아니라 생물학적 특성입니다. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces 및 많은 환경 미생물종은 사슬, 군집 또는 생물막 조각의 형태로 성장하며, 세포외 DNA와 다당류는 펠릿과 면봉 용출액에서 세포들을 서로 달라붙게 합니다. 이로 인해 분석 결과에 체계적인 오차가 발생합니다.
- 하나의 세포 덩어리는 포함된 세포 수와 관계없이 하나의 집락을 형성하므로 집락수가 과소평가됩니다.
- 광학 밀도 측정과 입자 계수기는 세포 대신 응집체를 반영하므로 성장 곡선에 편향이 발생합니다.
- 유세포 분석과 세포 분류에서는 세포 덩어리에서 발생하는 이벤트를 잘못 계수하고 분석에서 제외합니다.
- DNA와 단백질 추출은 응집체 표면의 세포만을 반영하므로 마이크로바이옴 및 오믹스 데이터가 왜곡됩니다.
기존 해결 방법은 느리거나 불완전하거나 화학적 변화를 일으킵니다. 강한 피펫팅과 보텍싱 후에도 미세 응집체가 남습니다. 효소나 킬레이트제를 이용한 분산은 분석하려는 세포 표면을 변형시킬 수 있습니다. 제어된 캐비테이션을 이용한 기계적 응집 해체는 수초 내에 작용하며 첨가제가 필요하지 않습니다.
응집체 하나가 집락 하나로 계수됩니다 – 그리고 잘못된 결과 하나로 이어집니다. 초음파 응집 해체로 세포 용해, 에어로졸 발생 또는 프로브 취급 없이 진정한 단일 세포 현탁액을 만드는 방법을 알아보세요. 자세한 정보를 요청하세요!
다중 튜브 초음파 처리기 VialTweeter를 이용한 비접촉 시료 전처리: 밀봉된 튜브 안에서 세포 덩어리의 응집을 해체하세요
초음파 처리가 세포를 용해하지 않고 응집을 해체하는 원리
초음파 세포 응집 해체는 기계적 강도의 차이를 이용합니다. 세균 응집체는 비교적 약한 세포 간 결합과 세포외 기질에 의해 유지되는 반면, 온전한 세포 외피는 훨씬 높은 전단을 견딥니다. 보정된 초음파가 현탁액에 전달되면 음향 캐비테이션이 미세유동, 압력 펄스 및 전단력을 발생시키며, 이들은 응집체의 계면에 먼저 작용합니다. 막이 파열되는 에너지 수준에 도달하여 세포 용해가 일어나기 전에 세포 덩어리, 사슬 및 생물막 조각이 전단에 의해 분리됩니다(응집 해체).
세균 세포 덩어리의 초음파 응집 해체
응집 해체 또는 세포 용해 – 초음파 처리 매개변수의 중요성
실제로 이는 동일한 장비를 서로 다른 매개변수로 작동하여 응집 해체와 세포 용해를 수행할 수 있음을 의미합니다. 적당한 진폭, 짧은 펄스 주기 및 제어된 온도에서는 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 진폭, 노출 시간 또는 시료 온도를 높이면 세포 내 표적 물질을 얻기 위한 완전한 세포 파쇄 쪽으로 공정이 전환됩니다. Hielscher 발생기를 사용하면 진폭, 출력, 펄스 및 에너지 투입량을 정밀하게 설정하고 처리 방법을 저장할 수 있으므로 시료, 작업자 및 처리 회차가 달라져도 응집 해체 단계의 재현성을 확보할 수 있습니다.
효율적인 비접촉 초음파 처리
수조식 초음파 처리로는 이와 같은 제어 수준을 구현할 수 없습니다. 초음파 세척 수조와 탱크는 낮은 초음파 에너지만 제공하므로 시료 전처리가 불완전하며, 캐비테이션도 불균일하게 발생하여 각 튜브는 수조 내 위치에 따라 다르게 처리됩니다. VialTweeter는 강력하고 집중된 초음파력을 용기 벽을 통해 최대 10개의 밀폐된 시료에 동시에 직접 전달합니다. 수조에서 길고 일정하지 않은 노출 시간이 필요한 처리도 표준화된 펄스 패턴으로 완료됩니다.
Hielscher 비접촉식 초음파 처리기는 밀폐된 바이알의 벽을 통해 강력하고 집중된 초음파를 가합니다. VialTweeter는 시료에 프로브를 넣지 않고 교차 오염이나 에어로졸 방출 없이 최대 10개의 바이알을 동일한 강도로 동시에 처리합니다. 처리량 요건상 필요한 경우, UIP400MTP 및 UIP550MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기는 동일하게 제어된 에너지 전달을 다중 웰 플레이트로 확장합니다.
VialTweeter는 소형 바이알 최대 10개와 대형 시험관 최대 5개를 동시에 초음파 처리합니다.
비접촉식 초음파 탈응집의 장점
- 교차 오염 없음: 바이알이 계속 밀폐된 상태를 유지하고 시료에 프로브를 담그지 않으므로 교차 오염과 시료 손실을 완전히 방지합니다. 시료 처리 사이에 멸균할 대상이 없으며, 한 번의 처리 작업이 다음 작업에 영향을 미칠 수 없습니다.
- 에어로졸로부터 보호: 개방형 프로브 초음파 처리는 감염성 에어로졸을 발생시키고 기기 표면을 오염시킵니다. 밀폐형 바이알 초음파 처리는 시료를 해당 튜브 내부에 가두어 두므로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 같은 병원성 세균 및 기타 BSL-2 또는 BSL-3 병원체를 취급할 때 중요합니다.
- 팁 침식 없음: 티타늄 프로브는 작동 중 소량의 미세 입자를 시료에 방출할 수 있습니다. 이러한 입자는 후속 단계에서 광학 밀도와 입자 계수값을 변화시킵니다. 용기 벽을 통한 간접 초음파 처리는 이러한 고형물 발생원을 완전히 제거합니다.
- 균일한 처리량: VialTweeter는 최대 10개의 바이알 각각에 동일한 초음파 강도를 전달하므로 초음파 처리 결과가 균일하고 재현성이 있습니다. 수조와 단일 시료 프로브 처리를 괴롭히는 위치 효과가 사라지며, 반복 시료 간 기준값의 비교 가능성이 유지됩니다.
- 시료 무결성: 처리 과정 내내 튜브가 밀폐된 상태를 유지하므로 시료가 오염되거나 변질되거나 휘발될 수 없습니다. 추가 이송 단계를 거칠 여유가 없는 귀중한 임상 시료 펠릿을 포함하여 소량의 시료도 희석 없이 처리할 수 있습니다.
- 공정 제어: 진폭은 20~100%, 펄스 모드는 0~100%로 조절할 수 있으며, 시스템은 온도 모니터링을 지원하므로 열에 민감한 균주와 단백질의 온도를 손상 임계값 미만으로 유지할 수 있습니다.
대표적인 응용 분야
- 마이크로바이옴 및 장 내용물 분석: 평판 접종이나 시퀀싱 전에 Lactobacillus, Bifidobacterium 및 분변 시료를 분산시켜 응집체로 인해 계수값이 낮아지지 않도록 합니다.
- 식품 및 수질 미생물학: 집락 수와 생존율을 정확하게 측정하기 위해 스왑, 세척액 및 증균 배양액의 플록을 탈응집합니다.
- 생물막 연구: 표면 단백질을 제거할 수 있는 효소 처리 없이 담체와 표면에서 세포를 단일 세포 현탁액으로 회수합니다.
- 임상 진단: 봉쇄 조건에서 객담, 고름 및 스왑 용출액을 재현탁합니다.
- 세포 배양: 계수와 계대 배양 전에 응집된 포유류 세포, 곤충 세포 및 CHO 세포의 응집체를 분리합니다.
- 전체 작업 흐름에 걸친 전처리: 낮은 진폭에서 탈응집을 수행하는 동일한 기기가 더 높은 설정에서는 완전한 세포 파쇄를 수행하므로, 튜브 간 이송 없이 세포 용해, 단백질 추출 및 DNA 단편화를 연속해서 진행할 수 있습니다.
다중 웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP – 세포 응집체의 고처리량 탈응집용
마이크로플레이트 초음파 처리기 모델 UIP400MTP와 UIP550MTP는 다중 웰 플레이트뿐 아니라 튜브 랙도 처리합니다.
탈응집 작업 흐름에 적합한 초음파 처리기 찾기
VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기
멸균 상태의 밀봉 바이알 내 응집 해체에 가장 적합한 방법입니다. 자동 동조 기능을 갖춘 200와트 UP200St 프로세서로 26 kHz에서 구동되는 VialTweeter는 최대 10개의 밀폐 바이알 벽을 통해 튜브당 최대 10 W의 초음파를 동시에 간접적으로 전달하여, 교차 오염과 시료 손실 없이 균일하고 재현성 있는 결과를 제공합니다. 티타늄 VialTweeter 소노트로드는 고압증기멸균이 가능하며, 진폭과 펄스 설정을 조절하고 저장할 수 있어 탈응집 프로토콜에 필요한 제어 범위를 제공합니다. 표준 10위치 소노트로드에는 자동 시료 주입기용 바이알, 미세원심분리 튜브, 1–5 mL 용량의 Eppendorf 또는 Nunc 튜브를 장착할 수 있습니다. VialPress 클램핑 장치는 직경이 최대 20 mm인 대형 용기를 최대 5개까지 고정할 수 있습니다.
Falcon 튜브용 및 용기 크기에 맞춘 단일 바이알용 전용 단일 튜브 VialTweeter 모델을 사용할 수 있습니다. 블록 소노트로드를 분리하면 UP200St 본체는 소형에서 중형 시료를 직접 처리하는 일반적인 프로브형 초음파 처리기로 작동합니다.
마이크로플레이트 초음파 처리기
멀티웰 플레이트 초음파 처리로 고처리량 시료 전처리까지 규모 확대: 플레이트 기반 워크플로를 위한 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP와 UIP550MTP는 비접촉식 균일 초음파 처리 범위를 튜브 열 개에서 플레이트 전체로 확장합니다.
400와트 UIP400MTP는 정밀한 진폭, 출력 및 펄스 제어와 함께 타이머, 온도 프로브 및 수조 냉각 기능을 갖추고 96웰 형식을 포함한 표준 마이크로타이터 및 멀티웰 플레이트를 처리합니다. 바이오필름 탈리와 세균 배양물 처리는 UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기의 확립된 응용 분야입니다.
550와트 UIP550MTP는 출력이 더 높은 옵션으로, 더 까다로운 응용 분야에 이상적입니다.
두 비접촉식 초음파 처리 시스템 모두 6, 12, 24, 48, 96 및 384웰 플레이트뿐 아니라 튜브 랙과 페트리 접시도 안정적으로 처리합니다. Hielscher 마이크로플레이트 초음파 처리기는 모든 표준 플레이트와 호환되므로 고가의 전용 소모품을 사용하지 않아도 됩니다. 온도 한계를 프로그래밍할 수 있어 시료가 최고 온도에 도달하면 초음파 처리가 자동으로 일시 중지되고 냉각 후 재개되므로, 반복 주기 동안 생존성을 보호합니다. 반복 가능한 결과를 위한 지능적이고 신뢰할 수 있는 고처리량 시료 전처리입니다.
아래 표는 생명과학, 유전체학, 단백질체학 및 진단에 사용되는 당사의 실험실 시료용 초음파 처리기의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다:
| 권장 장치 | 배치 부피 | 유량 |
|---|---|---|
| VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기 | 0.5–1.5mL 바이알 | 해당 없음 |
| UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기(440와트) | 멀티웰 / 마이크로타이터 플레이트 | 해당 없음 |
| UIP550MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기(550와트) | 멀티웰 / 마이크로타이터 플레이트 | 해당 없음 |
| 초음파 CupHorn | 바이알 또는 비커용 CupHorn | 해당 없음 |
| UP100H 100와트 프로브형 초음파 처리기 | 1–500mL | 10–200mL/min |
| UP200Ht, UP200St 200와트 프로브형 초음파 처리기 모델 | 10–1000mL | 20–200mL/min |
| UP400St 400와트 프로브형 초음파 처리기 | 10–2000mL | 20–400mL/min |
| GDmini2 | 멸균 초음파 미세유동 반응기 | 해당 없음 |
| 초음파 체 진탕기 | 해당 없음 | 해당 없음 |
초음파 세포 응집 해체에 관한 자주 묻는 질문
세포 응집 해체와 세포 용해의 차이는 무엇인가요?
탈응집이라고도 하는 응집 해체는 세포가 온전한 상태와 생존성을 유지하면서 뭉친 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액으로 만드는 과정입니다. 세포 용해는 세포 외피를 파열시켜 세포 내 내용물을 방출합니다. 두 과정 모두 캐비테이션에 의한 전단 작용으로 일어나며, 차이는 에너지 투입량에 있습니다. 진폭, 펄스 및 온도 설정을 최적화하면 초음파 처리로 세포 용해 임계값 미만에서 응집 해체를 달성할 수 있습니다.
초음파 수조가 표준화된 응집 해체에 적합하지 않은 이유는 무엇인가요?
초음파 수조는 낮은 초음파 에너지만 제공하므로 시료 전처리가 불완전해지며, 수조 전체에서 캐비테이션이 매우 불균일하게 발생하므로 각 시료는 위치에 따라 서로 다른 처리를 받습니다. 미생물 계수와 비교 연구에서는 비교 가능성이 중요합니다. 다중 튜브 초음파 처리기 VialTweeter와 마이크로플레이트 초음파 처리기 모델 UIP400MTP 및 UIP550MTP 같은 비접촉식 초음파 처리기는 조정된 초음파 조건에서 모든 용기를 처리하여 반복 시료 간 재현성을 높입니다.
초음파 처리가 세포를 손상시킬 수 있나요?
네, 매개변수를 제어하지 않으면 세포가 손상될 수 있습니다. 과도한 초음파 처리나 제어되지 않는 가열은 세포를 손상시킬 수 있으며, 방출된 DNA는 시료의 점성을 높이고 재응집을 촉진합니다. 따라서 공정은 신중하게 개발해야 합니다. 적절한 진폭, 펄스 주기, 냉각 및 온도 제한 기능이 있는 장비를 사용하면 처리 조건을 응집 해체와 세포 용해를 구분하는 곡선에서 응집 해체 영역에 유지할 수 있습니다.
모든 Hielscher 디지털 초음파 처리기는 신뢰할 수 있는 시료 전처리를 위해 정밀하게 제어할 수 있는 매개변수, 연결형 온도 센서, 프로그래밍 가능한 설정 및 자동 데이터 기록 기능을 제공합니다.
시료를 다른 용기로 옮겨야 하나요?
아니요. 바이알과 플레이트는 원래의 밀폐된 용기에서 처리됩니다. 간접 초음파 처리는 시료 이동에 따른 손실과 프로브 취급에 따른 오염물 이월을 모두 방지합니다.
VialTweeter는 어떤 형식의 바이알을 처리할 수 있나요?
표준 10위치 소노트로드에는 자동 시료 주입기용 바이알, 미량 원심분리 튜브 및 1–5 mL 용량의 Eppendorf 또는 Nunc 튜브를 장착할 수 있습니다. VialPress 액세서리에는 직경이 최대 20 mm인 대형 용기를 최대 5개 장착할 수 있습니다. Falcon 튜브용 및 맞춤형 단일 바이알이나 더 큰 용기 형식용으로 전용 단일 튜브 VialTweeter 모델이 제공됩니다.
하나의 장비로 응집 해체와 세포 용해를 모두 할 수 있나요?
네. 적절한 진폭에서 응집을 해체하는 동일한 장비 구성으로 진폭을 높이고 노출 시간을 늘리면 완전한 세포 파쇄를 수행할 수 있으므로, 플랫폼을 바꾸지 않고 단일 세포 현탁액 준비와 후속 추출을 연속으로 진행할 수 있습니다.
MBEC 분석에 초음파 처리를 사용하나요?
초음파 처리는 확립되어 있으며 대체로 표준적인 절차 요소입니다. 페그 뚜껑을 사용하는 MBEC 분석에서는 폴리스티렌 페그에 생물막을 성장시키고 항생제에 노출한 다음, 페그를 새 배지로 옮겨 보텍싱과 초음파 처리를 함께 수행합니다. 이를 통해 부착된 생물막 세포를 떼어내고 응집을 해체하여 부유성 세포 현탁액을 만든 후 연속 희석과 생균 계수를 수행합니다(MBEC는 미처리 생물막 대비 회수된 생균 수를 ≥3 log10만큼 감소시키는 최저 농도로 판독합니다). 초음파 처리는 분산 품질을 크게 향상시킵니다. EPS 기질에 내재된 세포가 불완전하게 방출되면 박멸 효과가 과소평가되고 MBEC 값이 높아집니다. 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP로 분석 플레이트 전반의 페그 홀더 웰에 초음파를 집중적으로 가하면 수조 초음파 처리의 기존 약점인 불균일한 에너지 분포, 가열 및 에어로졸 발생/교차 오염 위험을 극복할 수 있습니다.
비접촉식 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP가 MBEC 분석을 어떻게 용이하게 하는지 알아보세요!
MIC 분석에 초음파 처리를 사용하나요?
초음파 처리는 효율성과 재현성을 높이기 위해 MIC와 관련된 다양한 작업 흐름에 적용됩니다:
- 항균제 감수성 시험 전에 객담과 기타 점성 검체를 일상적으로 제염하고 균질화하며 때로는 초음파 처리도 사용하는 마이코박테리아학 분야에서는, 응집체를 형성하는 마이코박테리아 접종액을 짧게 분산시키면 정확한 MIC 측정에 도움이 됩니다;
- 미세 응집체가 접종액 밀도를 왜곡하는 응집성 미생물(예: 연쇄상구균, 펠릿 내 포도상구균)에 적용됩니다; 그리고
- 인공관절 감염에서 임플란트 초음파 처리액을 배양한 뒤 항균제 감수성 시험을 수행하는 등의 복합 진단에 적용됩니다(전형적인 MIC 적용이 아니라 MBEC와 유사한 적용).
문헌 / 참고문헌
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
원하는 플레이트를 선택하세요! 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP550MTP는 모든 표준 멀티웰 플레이트에서 세균 시료의 응집을 해체합니다.
Hielscher 다중 시료 초음파 처리기 모델 마이크로플레이트용 UIP400MTP, VialTweeter 및 CupHorn: 고속 및 고처리량 시료 전처리