생물막 및 단백질체 분석에서 Hielscher 다중 샘플 초음파 발생기를 사용하는 프로토콜

VialTweeter Multi-Tube Sonicator 및 UIP400MTP Microplate Sonicator와 같은 다중 샘플 초음파 발생기를 사용하면 고처리량 응용 분야를 위한 실험실 워크플로를 간소화할 수 있습니다. 두 장치 모두 여러 샘플에서 정밀하고 균일한 초음파 처리를 가능하게 하여 변동성을 최소화하고 재현성을 향상시킵니다. 이는 일관된 시료 용해, 생물막 분리, 단백질 추출 또는 단백질 분해 분해가 필요한 실험에서 특히 유리하며, 수동 또는 단일 시료 분석법은 효율성이 떨어지고 불일치가 발생하기 쉽습니다.

Multi-Sample Sonicators를 통한 워크플로우 간소화

예를 들어, 이 UIP400MTP는 마이크로플레이트 웰의 동시 초음파 처리를 가능하게 하여 생물막 또는 세포 물질의 균일한 분리를 보장합니다. 한편, VialTweeter는 교차 오염 없이 여러 튜브 샘플의 정밀한 용해 및 균질화를 제공합니다. 이러한 초음파 발생기는 처리 시간을 크게 단축하고 실험 재현성을 개선하며 높은 시료 무결성을 유지하여 미생물학, 단백질체학 및 분자 생물학 연구에 없어서는 안될 도구입니다.
다음은 대장균 생물막 형성 및 후속 단백질체 분석과 관련된 연구에서 Hielscher 다중 샘플 초음파 발생기 모델, VialTweeter Multi-Tube Sonicator 및 Microplate Sonicator UIP400MTP의 사용을 보여주는 자세한 프로토콜입니다.

프로토콜 : Hielscher Multi-Sample Sonicators를 사용한 생물막 형성, 분리 및 단백질체 분석

1. 세균 배양 준비

• E. coli biofilm 형성에 유리한 온도인 30°C에서 다음을 포함하는 트립톤 브로스(TB) 배지에서 E. coli 박테리아(균주 W3110)를 배양합니다.
  – 10g/L 트립톤
  – 5g/L NaCl
• 플라스미드 유지를 보장하기 위해 필요에 따라 항생제를 보충합니다.
• 현미경 검사 및 프로모터 활성 연구의 경우, rplL 프로모터의 제어 하에 게놈 강화 GFP(eGFP) 리포터와 함께 W3110 대장균 균주를 사용하십시오.
• 다양한 promoter에 대해 GFP reporter plasmid를 활용합니다(예: csgA, csgD, fliA, fliC, flhD )을 사용하여 프로모터 활동을 측정합니다.

2. 생물막 재배 및 분리

• 웰당 1.5mL의 희석된 박테리아 배양액을 12웰 플레이트(CellStar 12웰 플레이트, Greiner Bio-One)에 파종합니다.
• 생물막 형성을 허용하기 위해 배양합니다.
• 플랑크톤(비부착성) 배양물을 조심스럽게 제거하십시오.

– 500μL PBS로 각각을 잘 씻으십시오.
– UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 발생기에서 12웰 플레이트를 초음파 처리하여 부착된 세포를 분리합니다. 이 UIP400MTP는 모든 웰에 일관된 초음파 에너지를 전달하여 균일한 분리를 보장합니다.
– 초음파 처리 설정 : 60 % 진폭, 사이클 모드 : 60 초 켜기 / 30 초 끄기.

3. 세포 수확 및 용해

• 4,500g에서 5분 동안 생물막 세포를 원심분리하여 분리했습니다.
• PBS로 펠릿 세포를 세척합니다.
• 2% 소듐 라우로일 사르코시네이트(SLS) 100μL에 세포를 현탁시키고 95°C에서 15분 동안 배양합니다.
• 완전한 세포 용해를 보장하기 위해 VialTweeter Multi-Tube Sonicator를 사용하여 초음파 처리합니다.
  – 초음파 처리 설정 : 100 % 진폭, 50 분 총 실행 시간 동안 10 초 ON / 10 초 OFF; 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

4. 환원과 알킬화

• 5mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 첨가하여 이황화물 결합을 줄이고 95°C에서 15분 동안 배양합니다.
• 25°C에서 30분 동안 10mM 요오도아세트아미드로 단백질을 알킬레이트합니다.

5. 단백질 정량화 및 소화

• 원심분리기는 이물질을 제거하기 위해 용해됩니다.
• Pierce BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 함량을 정량화할 수 있습니다.
• 2% SLS 및 100mM 중탄산암모늄을 함유한 용액에서 50μg의 총 단백질과 1μg의 트립신을 분해합니다.
• 30°C에서 하룻밤 동안 분해 반응을 배양합니다.

6. 펩타이드 정제

• 1.5% 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 SLS를 침전시킨 다음 원심분리기를 첨가합니다.
• C18 마이크로스핀 컬럼을 사용하여 펩타이드를 정제합니다.
• 정제된 펩타이드를 건조시키고 0.1% TFA로 재현탁합니다.

7. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS)

• Ultimate 3000 RSLC 나노 시스템과 결합된 Q-Exactive Plus 질량분석기에서 펩타이드를 분석합니다.
• C18 수지(2.4μm)로 충전된 역상 HPLC 컬럼(75μm × 42cm)을 사용하여 펩타이드를 분리합니다.
• 140분 동안 2%에서 35% 용매 B(0.15% 포름산이 포함된 아세토니트릴)까지의 그래디언트를 적용합니다.
• 고분해능 MS 스캔을 사용한 후 가장 강한 이온 10개의 MS/MS 스캔을 사용하여 데이터를 획득합니다.

8. 데이터 분석

• Progenesis 소프트웨어를 사용하여 원시 LC-MS 데이터를 처리합니다.
• .mgf 파일을 내보내고 MASCOT으로 분석합니다.
• 품질 관리 및 거짓 발견 조정을 위해 SafeQuant를 사용하여 펩타이드 정량을 수행합니다.
• 재현성을 보장하기 위해 모든 실험을 중복 또는 삼중으로 수행합니다.

고처리량 시료 전처리를 위한 다중 시료 초음파 발생기

다중 샘플 초음파 발생기 모델 VialTweeter 및 UIP400MTP는 특히 생물막 연구 및 단백질체학에서 실험 워크플로우의 정밀도와 효율성을 크게 향상시킵니다. 여러 샘플을 균일하게 처리할 수 있는 능력은 데이터 품질을 손상시키지 않으면서 높은 처리량 용량을 보장합니다. 위에서 설명한 간소화 된 워크 플로우와 결합 된 이러한 이점은 Hielscher 다중 샘플 초음파 발생기를 현대 생물학 연구를위한 필수 도구로 만듭니다.

설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질

Hielscher 초음파는 최고의 품질과 디자인 표준으로 잘 알려져 있습니다. 견고 함과 쉬운 작동으로 초음파를 산업 시설에 원활하게 통합 할 수 있습니다. 거친 조건과 까다로운 환경은 Hielscher 초음파기로 쉽게 처리 할 수 있습니다.

Hielscher 초음파는 ISO 인증 회사이며 최첨단 기술과 사용자 친화성을 갖춘 고성능 초음파에 특히 중점을 둡니다. 물론, Hielscher 초음파는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.