바이오필름 및 단백질체 분석에서 Hielscher 다중 시료 초음파 처리기를 사용하는 프로토콜

VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기 및 UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기와 같은 다중 시료 초음파 처리기를 사용하면 고처리량 응용 분야의 실험실 작업 흐름을 간소화할 수 있습니다. 두 장치 모두 여러 시료에 걸쳐 정밀하고 균일한 초음파 처리를 수행하여 변동성을 최소화하고 재현성을 높입니다. 이는 일관된 시료 세포 용해, 바이오필름 탈리, 단백질 추출 또는 단백질 분해효소 소화를 요구하는 실험에서 특히 유리합니다. 이러한 실험에서는 수동 방식이나 단일 시료 처리 방식의 효율성이 낮고 결과가 불균일해지기 쉽습니다.

다중 시료 초음파 처리기로 작업 흐름 간소화

예를 들어 UIP400MTP는 마이크로플레이트의 웰을 동시에 초음파 처리하여 바이오필름이나 세포 물질의 균일한 탈리를 보장합니다. 한편 VialTweeter는 교차 오염 없이 여러 튜브 시료를 정밀하게 세포 용해하고 균질화합니다. 이러한 초음파 처리기는 처리 시간을 크게 줄이고, 실험 재현성을 높이며, 시료의 높은 완전성을 유지하므로 미생물학, 단백질체학 및 분자생물학 연구에 필수적인 도구입니다.
아래에는 E. coli 바이오필름 형성과 후속 단백질체 분석 연구에서 Hielscher 다중 시료 초음파 처리기 모델인 VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기와 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP를 사용하는 예를 보여 주는 상세 프로토콜이 제시되어 있습니다.

프로토콜: Hielscher 다중 시료 초음파 처리기를 이용한 바이오필름 형성, 탈리 및 단백질체 분석

1. 세균 배양 준비

• 다음 성분을 함유한 트립톤 액체배지(TB)에서 E. coli 세균(W3110 균주)을 E. coli 바이오필름 형성에 유리한 온도인 30°C에서 배양합니다:
  – 트립톤 10 g/L
  – NaCl 5 g/L
• 플라스미드가 유지되도록 필요에 따라 항생제를 첨가합니다.
• 현미경 관찰 및 프로모터 활성 연구에는 rplL 프로모터의 조절을 받는 향상된 GFP(eGFP) 리포터가 유전체에 포함된 W3110 E. coli 균주를 사용합니다.
• 다양한 프로모터(예: csgA, csgD, fliA, fliC, flhD )에 대한 GFP 리포터 플라스미드를 사용하여 프로모터 활성을 측정합니다.

2. 바이오필름 배양 및 탈리

• 희석한 세균 배양액을 12웰 플레이트(CellStar 12웰 플레이트, Greiner Bio-One)의 각 웰에 1.5 mL씩 접종합니다.
• 바이오필름이 형성되도록 배양합니다.
• 부유성(비부착성) 배양액을 조심스럽게 제거합니다.

– 각 웰을 PBS 500 µL로 세척합니다.
– UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기에서 12웰 플레이트를 초음파 처리하여 부착된 세포를 탈리시킵니다. UIP400MTP는 모든 웰에 일관된 초음파 에너지를 전달하여 균일한 탈리를 보장합니다.
– 초음파 처리 설정: 진폭 60%, 사이클 모드: 60 sec 켜짐 / 30 sec 꺼짐.

3. 세포 수확 및 세포 용해

• 탈리된 바이오필름 세포를 4,500 g에서 5분간 원심분리합니다.
• 펠릿으로 모인 세포를 PBS로 세척합니다.
• 세포를 2% 라우로일사르코신산 나트륨(SLS) 100 µL에 재현탁하고 95°C에서 15분간 배양합니다.
• VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기를 사용하여 초음파 처리함으로써 완전한 세포 용해를 보장합니다.
  – 초음파 처리 설정: 진폭 100%, 50 s 켜짐 / 10 s 꺼짐으로 총 10 min 동안 가동합니다. 시료는 얼음 위에 유지합니다.

4. 환원 및 알킬화

• 이황화 결합을 환원하기 위해 5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 첨가하고 95°C에서 15분간 배양합니다.
• 10 mM 요오도아세트아미드로 25°C에서 30분간 단백질을 알킬화합니다.

5. 단백질 정량 및 소화

• 용해물을 원심분리하여 잔해를 제거합니다.
• Pierce BCA Protein Assay Kit를 사용하여 총단백질 함량을 정량합니다.
• 2% SLS와 100 mM 탄산수소암모늄을 함유한 용액에서 총단백질 50 µg을 트립신 1 µg으로 소화합니다.
• 소화 반응액을 30°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

6. 펩타이드 정제

• 1.5% 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 SLS를 침전시킨 다음 원심분리합니다.
• C18 마이크로스핀 컬럼을 사용하여 펩타이드를 정제합니다.
• 정제한 펩타이드를 건조한 후 0.1% TFA에 재현탁합니다.

7. 액체 크로마토그래피–질량분석법(LC-MS/MS)

• Ultimate 3000 RSLC nano 시스템과 결합된 Q-Exactive Plus 질량분석기로 펩타이드를 분석합니다.
• C18 수지(2.4 µm)가 충전된 역상 HPLC 컬럼(75 µm × 42 cm)을 사용하여 펩타이드를 분리합니다.
• 140분에 걸쳐 용매 B(0.15% 포름산을 함유한 아세토니트릴)의 비율을 2%에서 35%로 높이는 구배를 적용합니다.
• 고해상도 MS 스캔을 수행한 후 신호 강도가 가장 높은 이온 10개에 대한 탠덤 MS/MS 스캔을 수행하여 데이터를 수집합니다.

8. 데이터 분석

• Progenesis 소프트웨어를 사용하여 원시 LC-MS 데이터를 처리합니다.
• .mgf 파일을 내보내고 MASCOT으로 분석합니다.
• 품질 관리 및 거짓 발견 보정을 위해 SafeQuant를 사용하여 펩타이드를 정량합니다.
• 재현성을 보장하기 위해 모든 실험을 두 번 또는 세 번 반복 수행합니다.

고처리량 시료 전처리를 위한 다중 시료 초음파 처리기

다중 시료 초음파 처리기 모델인 VialTweeter와 UIP400MTP는 특히 바이오필름 연구 및 단백질체학에서 실험 작업 흐름의 정밀도와 효율성을 크게 높입니다. 여러 시료를 균일하게 처리하는 능력은 데이터 품질을 저하시키지 않으면서 높은 시료 처리량을 보장합니다. 이러한 이점은 위에서 설명한 간소화된 작업 흐름과 결합되어 Hielscher 다중 시료 초음파 처리기를 현대 생물학 연구의 필수 도구로 만듭니다.

설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질

Hielscher 초음파 처리기는 최고 수준의 품질 및 설계 기준으로 잘 알려져 있습니다. 견고성과 간편한 작동 덕분에 당사의 초음파 처리기를 산업 시설에 원활하게 통합할 수 있습니다. Hielscher 초음파 처리기는 열악한 조건과 까다로운 환경에서도 쉽게 작동합니다.

Hielscher Ultrasonics는 ISO 인증 기업으로, 최첨단 기술과 사용자 친화성을 갖춘 고성능 초음파 처리기에 특히 중점을 둡니다. 물론 Hielscher 초음파 처리기는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.