FFPE 탈파라핀 및 단백질 추출

탈파라핀, 가용화 및 VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기를 이용한 초음파 처리를 최적으로 조합하여 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에서 단백질을 효율적으로 추출하십시오. 이 프로토콜은 후속 질량 분석 기반 단백질체학 분석을 지원하며, SP3 정제 및 효소 소화 워크플로와 호환됩니다.

이 표준 작업 절차(SOP)는 고성능 초음파 처리를 이용하여 FFPE 조직 검체의 단백질체 분석을 수행하는 실험실 인력을 대상으로 합니다. VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기를 사용하여 최대 열 개의 FFPE 시료를 병렬 처리하도록 최적화되어 있습니다.

프로토콜: VialTweeter를 이용한 FFPE 시료의 단백질 추출

재료 및 시약

시약

• 자일렌(조직학용 등급)
• 에탄올(무수 96%)
• 세포 용해 완충액:

6 M 구아니딘 염산염
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)
40 mM CAA(2-클로로아세트아미드)

• 단백질분해효소 억제제(선택 사항; 예: cOmplete™ mini EDTA-free)

장비

• VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기
• 1.5 mL 또는 2.0 mL 저흡착 미세원심분리 튜브
• 히트 블록 또는 인큐베이터(95°C 및 80°C 설정)
• 미세원심분리기
• 써모믹서(선택 사항이나 권장됨)

시료 투입량

• 시료당(즉, 바이알당) 두께 10 µm의 FFPE 조직 절편 1–2개

또는

• 시료당(즉, 바이알당) 총 ~100 µg의 조직

참고: 파라핀 잔해에 의한 오염을 최소화하려면 미세절편 제작 시 새 칼날을 사용하십시오.

절차

1. 탈파라핀
   1. FFPE 절편을 저흡착 미세원심분리 튜브로 옮기십시오.
   2. 자일렌 1 mL를 넣고 짧게 볼텍싱하십시오.
   3. 실온에서 10분간 인큐베이션하십시오.
   4. 14,000 × g에서 2분간 원심분리한 후 상층액을 버리십시오.
   5. 자일렌 세척을 한 번 더 반복하십시오(2–4단계).
   6. 펠릿을 96% 에탄올 1 mL로 세척하고 볼텍싱한 다음, 14,000 × g에서 2분간 원심분리하십시오. 상층액을 버리십시오.
   7. 에탄올 세척을 한 번 더 반복하십시오(에탄올 세척 총 2회).
   8. 잔류 에탄올이 증발하도록 뚜껑을 연 상태로 실온에서 펠릿을 10분간 자연 건조하십시오.
2. 단백질 추출 및 초음파 처리
   1. 각각의 건조된 펠릿에 세포 용해 완충액 200 µL를 넣으십시오.

      참고: 초음파 처리기는 최대 1 mL까지 수용할 수 있지만, 후속 처리에는 200 µL가 최적입니다.

   2. 볼텍싱하거나 부드럽게 피펫팅하여 혼합하십시오.
3. 첫 번째 가열 인큐베이션
   1. 써모믹서 또는 히트 블록을 사용하여 400 rpm으로 교반하면서 튜브를 95 °C에서 30 min 동안 인큐베이션하십시오.
   2. 시료를 실온에서 5 min 동안 식히십시오.
4. VialTweeter를 이용한 첫 번째 초음파 처리
   1. 튜브를 VialTweeter에 넣으십시오.
   2. VialTweeter UP200St를 아래 값으로 설정하고 초음파 처리하십시오.
초음파 처리기 설정
• 진폭(A)을 100%로 설정하십시오
• 펄스 모드(C)를 100%로 설정하십시오
• 주기 타이머: 켜짐
• 작동 시간: 60s
• 정지 시간: 30s
• 한계값: 15 min(10주기에 해당)
(계산 참고: (60 s 작동 + 30 s 정지) × 10주기 = 900 s = 15 min)
5. 두 번째 가열 인큐베이션
   튜브를 꺼내어 95 °C, 400 rpm에서 15 min 동안 다시 인큐베이션하십시오.
6. 두 번째 초음파 처리
   동일한 설정(위 참조)으로 VialTweeter에서 초음파 처리를 추가로 10주기(총 15 min) 반복하십시오.
7. 용해액 청징
   1. 시료를 23°C(실온), 13,000 × g에서 10 min 동안 원심분리하십시오.
   2. 상층액을 새 2.0 mL Safe-lock Eppendorf 튜브에 조심스럽게 옮기십시오. 펠릿이 흐트러지지 않도록 하십시오.
8. 후속 처리
   이제 용해액은 SP3 정제 및 효소 소화를 수행할 준비가 되었습니다.

참고 사항 및 권장 작업 방법

1. 프로그래밍된 작동/정지 주기 반복으로 초음파 처리 중 과열 위험을 줄입니다.
2. 단백질 응집을 방지하려면 초음파 처리 후 볼텍싱을 피하십시오.

폐기물 처리 및 안전

아래 표는 당사 실험실용 초음파 처리기의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다: