FFPE에서 탈파라핀화 및 단백질 추출

VialTweeter 다중 튜브 초음파기를 사용하여 탈파라핀화, 가용화 및 초음파 처리의 최적화된 조합을 사용하여 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에서 단백질 추출을 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 질량 분석 기반 단백질체학을 지원하며 SP3 클린업 및 효소 분해 워크플로우와 호환됩니다.

이 SOP는 고성능 초음파 처리를 사용하여 FFPE 조직 표본의 단백질체 분석과 관련된 실험실 직원을 위한 것입니다. VialTweeter Multi-Tube Sonicator를 사용하여 병렬로 처리되는 최대 10개의 FFPE 샘플에 최적화되어 있습니다.

프로토콜: VialTweeter를 사용한 FFPE 샘플에서 단백질 추출

재료 및 시약

시약

• 크실렌(조직학 등급)
• 에탄올 (절대 96%)
• 용해 버퍼:

6M 구아니딘 염산염
50mM 트리스-HCl, pH 8.5
10mM TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)
40mM CAA(2-클로로아세트아미드)

• 프로테아제 억제제(선택 사항, 예: cOmplete™ mini EDTA-free)

설비

• VialTweeter 다중 튜브 초음파 발생기
• 1.5 mL 또는 2.0 mL 저결합 마이크로 원심분리기 튜브
• 히트 블록 또는 인큐베이터(95°C 및 80°C 설정)
• 마이크로 원심분리기
• Thermomixer (선택 사항이지만 권장됨)

샘플 입력

• 샘플당(즉, 바이알당) 10μm 두께의 FFPE 조직 1-2개 섹션

또는

• 샘플당 총 ~100 μg 조직(즉, 바이알당)

참고: 파라핀 파편 오염을 최소화하기 위해 마이크로토미술에 새 칼날을 사용하십시오.

절차

1. 탈파라핀화
   1. FFPE 절편을 결합이 낮은 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   2. 자일렌 1mL를 넣고 간단히 소용돌이칩니다.
   3. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   4. 14,000 × g에서 2 분 동안 원심 분리기; 상등액을 버리십시오.
   5. 크실렌 세척을 한 번 더 반복합니다(2-4단계).
   6. 펠릿을 1mL의 96% 에탄올, 볼텍스로 세척한 다음 14,000×g에서 2분 동안 원심분리기를 세척합니다. 상등액을 버리십시오.
   7. 에탄올 세척을 한 번 더 반복합니다(총 2회 에탄올 세척).
   8. 잔류 에탄올을 증발시키기 위해 뚜껑을 열고 실온에서 펠릿을 10분 동안 자연 건조합니다.
2. 단백질 추출 및 초음파 처리
   1. 각 건조 펠릿에 200μL 용해 완충액을 추가합니다.
      참고: 초음파 처리기는 최대 1mL를 수용할 수 있지만 다운스트림 공정에는 200μL가 최적입니다.

   2. 볼텍싱 또는 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.
3. 첫 번째 열 배양
   1. 95°C에서 30분 동안 튜브를 배양하고 써모믹서 또는 열 블록을 사용하여 400rpm에서 교반합니다.
   2. 샘플을 실온에서 5분 동안 식힙니다.
4. VialTweeter를 사용한 첫 번째 초음파 처리
   1. 튜브를 VialTweeter에 놓습니다.
   2. VialTweeter UP200St를 아래 값으로 설정하고 초음파 처리합니다.
초음파 발생기 설정
• 진폭(A)을 100%로 설정합니다.
• 맥동 모드(C)를 100%로 설정
• 기간 시계: 켜짐
• 정시: 60초
• 꺼짐 시간: 30초
• 한계 값: 15분(10사이클에 해당)
(계산 참고 사항: (60초 켜기 + 30초 끄기) × 10 사이클 = 900초 = 15분)
5. 두 번째 열 배양
   튜브를 제거하고 95°C에서 15분, 400rpm 동안 다시 배양합니다.
6. 두 번째 초음파 처리
   추가 10 사이클 (총 15 분) 동안 동일한 설정 (위와 같이)을 사용하여 VialTwitterer에서 초음파 처리를 반복합니다.
7. Lysate의 정화
   1. 샘플을 13,000 × g에서 23°C(실온)에서 10분 동안 원심분리합니다.
   2. 상층액을 새 2.0 mL Safe-lock Eppendorf tube에 조심스럽게 모읍니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
8. 다운스트림 프로세싱
   이제 용해물을 SP3 클린업 및 효소 분해를 위한 준비가 되었습니다.

참고 사항 및 모범 사례

1. 초음파 처리 중 과열 위험은 프로그래밍된 ON/OFF 사이클링에 의해 완화됩니다.
2. 단백질 응집을 방지하기 위해 초음파 처리 후 와류를 피하십시오.

폐기물 처리 및 안전

아래 표는 실험실 크기의 초음파기의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.