FFPE 고처리량 시료 전처리: 단백질 추출 및 핵산 전단
Hielscher Ultrasonics는 고처리량 초음파 처리기 UIP400MTP로 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 조직 전처리의 어려움을 해결합니다. 초음파 처리를 통해 다수의 FFPE 시료를 처리하여 FFPE 탈파라핀, 조직 용해, 균질화, 단백질 추출 및 DNA/RNA 전단을 수행하는 방법을 알아보세요! 멀티웰 플레이트에서 다수의 시료를 처리하는 초음파 FFPE 조직 전처리의 이점을 활용하세요! 신뢰할 수 있는 연구 결과를 위해 고품질 시료를 대량으로 확보하세요! 마지막으로, 시간과 비용도 절약하세요!
고처리량 초음파 처리로 용이해지는 FFPE 시료 전처리
포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE)는 고형 조직을 보존하고 보관하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. FFPE 조직 시료에서 생체분자를 추출하는 작업은 보관된 시료의 품질로 인해 상당한 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 분자생물학과 임상 연구에서 매우 귀중한 자산인 이러한 시료는 후향적 연구와 진단 바이오마커 검증에 풍부한 생물학적 정보를 제공합니다. 그러나 포르말린 고정 및 파라핀 포매 과정은 조직의 구조와 형태를 보존하는 동시에 고품질 핵산과 단백질의 추출을 어렵게 합니다. 포르말린은 핵산과 단백질의 가교결합을 유도하여 분자 단편화와 화학적 변형을 일으킵니다. 고처리량 초음파 처리기 UIP400MTP가 FFPE 시료 전처리의 어려움을 어떻게 극복하는지 알아보세요!
효율적인 FFPE 시료 전처리를 위한 초음파 처리기
- 사용하기 쉬운 작업 흐름: 사용자 친화적으로 간소화된 공정.
- 탈파라핀, 단백질 추출, DNA / RNA 전단
- 신속한 고처리량 처리: 멀티웰 플레이트의 효율적인 처리.
- 효과적인 탈파라핀: 단백질 가용화 개선.
- 무독성 용매: 자일렌과 같은 유해한 유기 용매의 사용을 피합니다.
UIP400MTP 고처리량 초음파 처리기는 멀티웰 플레이트에서 FFPE 시료를 고처리량으로 처리하는 데 사용됩니다
FFPE 조직에서 단백질을 추출하는 기술의 발전
Hielscher Ultrasonics는 고처리량 FFPE 시료 전처리의 어려움을 해결합니다. 초음파 처리는 초음파를 이용하여 기계적 진동과 집중된 캐비테이션을 발생시켜 세포 구조를 효과적으로 파괴하고 생체분자의 가용화를 향상시킵니다. 이 기술은 FFPE 조직에서 핵산과 단백질을 추출하는 효율과 수율을 높이고 라이브러리 제작을 위한 DNA 및 RNA 전단의 효율과 수율도 높일 수 있어 널리 사용되고 있습니다. UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기를 이용한 초음파 처리가 후속 응용을 위해 이러한 생체분자의 온전성을 유지한다는 점을 강조하는 것은 매우 중요합니다.
고처리량 초음파 처리를 이용한 핵산 전단
고처리량 환경에서 사용하도록 설계된 다중 웰 초음파 처리기 UIP400MTP는 FFPE 시료 준비를 새로운 수준으로 끌어올립니다. 이 다중 웰 플레이트 초음파 처리 방법은 여러 시료를 동시에 처리할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 솔루션을 제공합니다. 차세대 시퀀싱(NGS), 정량 PCR, 단백질체 분석을 비롯한 다양한 분석 기법에 필수적인 DNA, RNA 및 단백질을 신속하고 재현성 있게 추출할 수 있도록 합니다. 진폭, 처리 시간, 온도 등의 초음파 처리 매개변수를 최적화하면 추출된 생체분자의 품질과 양을 더욱 향상시킬 수 있습니다.
다중 웰 플레이트용 초음파 처리기 UIP400MTP는 FFPE 조직에서 유래한 DNA와 RNA의 단편화 및 전단에 상당한 이점을 제공합니다. 이 시스템의 두드러진 특징 중 하나는 DNA와 RNA의 단편 크기를 좁은 범위로 조절할 수 있다는 점으로, 초음파 처리 강도를 정밀하게 조절하여 150–200 염기쌍(bp)의 짧은 단편이나 15–20 킬로염기쌍(kbp)의 더 긴 단편을 얻을 수 있습니다. 이러한 다용도성 덕분에 UIP400MTP는 짧은 리드 및 긴 리드 시퀀싱 응용 분야 모두에 필수적이며, 차세대 시퀀싱(NGS)과 전장 유전체 시퀀싱(WGS)에서 고품질 결과를 보장합니다. 단편 크기를 정밀하게 제어하면 규격에 맞춰 시료를 준비할 수 있으므로, 이는 유전체학의 모든 분야에 종사하는 연구자에게 매우 중요합니다.
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추출된 핵산과 단백질의 온전성을 유지하고 결과의 재현성을 보장하면서 FFPE 시료에서 생체분자를 효율적으로 회수할 수 있는 UIP400MTP 다중 웰 플레이트 초음파 처리기를 만나보세요. 이 기술은 다른 전처리 및 분석 작업 흐름과 원활하게 통합되어, 보관된 FFPE 조직을 활용하는 분자 수준의 연구를 간소화하고 향상시킵니다.
고정제와 그 영향
고정은 세포 구조를 보존하고 생화학 반응을 멈추며 분해를 방지하는 시료 준비의 핵심 단계입니다. 구체적인 실험 요건에 따라 다양한 고정제가 사용됩니다. 가장 일반적인 두 가지 고정제는 포름알데히드와 파라포름알데히드로, 단백질과 핵산을 가교하여 세포와 조직의 형태 및 항원성을 보존합니다. 에탄올, 메탄올, 글루타르알데히드 등의 다른 고정제는 특정 용도에 사용됩니다.
포름알데히드 및 파라포름알데히드 고정제는 아미노기 사이에 메틸렌 가교를 형성하여 단백질 가교를 유도합니다. 이 과정은 세포 구성 성분을 효과적으로 고정하여 후속 분석 단계에서 온전성을 보존합니다. 이러한 고정제의 효과는 농도, pH, 온도 등의 요인에 영향을 받을 수 있으며, 세포 구조를 최적으로 보존하려면 이러한 매개변수를 최적화하는 것이 매우 중요합니다.
초음파 FFPE 시료 준비의 장점
초음파 처리는 고정된 세포와 조직을 파쇄하는 강력한 기법으로, 기존 기법보다 우수합니다. 기존 세포 용해 방법에 비해 다음과 같은 몇 가지 주목할 만한 장점이 있습니다:
- 속도와 효율성: 초음파 세포 용해는 세포와 조직을 신속하게 파쇄하여 기계적 또는 화학적 세포 용해 방법에 비해 처리 시간을 크게 단축합니다. 초음파 프로브에서 발생하는 고주파 음파는 기계적 전단력을 생성하여 고정된 세포 구조를 파쇄합니다. 이러한 빠르고 효율적인 파쇄를 통해 연구자는 짧은 시간 안에 대용량 시료를 처리할 수 있습니다.
- 온화한 처리 및 조절 가능성: 초음파 세포 용해는 단백질, 핵산, 효소와 같은 민감한 생체분자의 손상을 최소화하는 온화한 파쇄 메커니즘을 제공합니다. 과도한 열이나 전단력을 발생시키는 기계적 방법과 달리, 초음파 세포 용해는 제어된 캐비테이션을 이용하여 세포 내 구성 성분의 온전성과 기능을 보존하면서 세포를 파쇄합니다.
- 다용도성: 초음파 세포 용해는 다양한 고정제에 적용할 수 있어 연구자가 폭넓은 종류의 고정 시료를 다룰 수 있습니다. 포름알데히드, 파라포름알데히드 또는 다른 고정제를 사용하든 초음파 세포 용해는 일관되게 효율적인 파쇄를 제공하여 세포 구성 성분의 최적 회수를 보장합니다.
- 높은 수율과 품질: 초음파 세포 용해는 고정된 세포와 조직을 균일하게 파쇄할 수 있어 온전한 세포 구성 성분을 높은 수율로 얻을 수 있도록 합니다. 이를 통해 단백질 분석, 핵산 추출, 효소 분석 등의 후속 응용에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.
- 자동화 호환성: 초음파 세포 용해는 자동화 시스템에 쉽게 통합할 수 있어 고처리량 시료 처리가 가능합니다. 이러한 호환성을 통해 연구자는 특히 대규모 연구에서 작업 흐름을 간소화하고 생산성을 높일 수 있습니다.
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96웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP (마이크로타이터 및 멀티웰 플레이트의 초음파 처리용)
초음파 세포 용해는 고정된 세포와 조직의 파쇄에 혁신을 가져왔으며, 기존 세포 용해 방법에 비해 수많은 이점을 제공합니다. 빠른 속도, 효율성, 선택성, 범용성, 높은 수율, 자동화 호환성을 갖추고 있어 분자생물학 및 생명공학 연구에 없어서는 안 될 도구입니다. Hielscher Ultrasonics는 비접촉식 초음파 처리기와 프로브형 초음파 처리기를 모두 제공하여 고객의 생명과학 응용에 가장 적합한 초음파 균질기를 제공합니다. 단일 시료, 여러 시료 또는 매우 많은 수의 시료를 동시에 처리하고자 하는 경우 모두 고객의 연구 및 진단 요구 사항에 부합하는 최상의 초음파 처리기를 제공해 드립니다.
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설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만들어지는 품질
Hielscher 초음파 처리기는 최고 수준의 품질 및 설계 기준으로 잘 알려져 있습니다. 견고성과 간편한 조작 덕분에 당사의 초음파 처리기를 산업 시설에 원활하게 통합할 수 있습니다. Hielscher 초음파 처리기는 가혹한 조건과 까다로운 환경에서도 손쉽게 작동합니다.
Hielscher Ultrasonics는 ISO 인증 기업으로, 최첨단 기술과 사용자 편의성을 갖춘 고성능 초음파 처리기에 특히 중점을 두고 있습니다. 물론 Hielscher 초음파 처리기는 CE 기준을 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.
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UIP400MTP 초음파 처리기: 멀티웰 플레이트에서의 고처리량 FFPE 시료 준비
자주 묻는 질문
아래에서는 FFPE 조직 준비 및 FFPE 시료의 초음파 처리와 관련하여 자주 묻는 질문에 답변합니다.
FFPE 조직은 어떻게 준비하나요?
FFPE 조직 준비 단계: 고품질 FFPE 시료를 얻으려면 신선한 조직을 세심하게 취급하고 처리하는 것이 매우 중요합니다. 정확한 후속 분석을 위해서는 세포 구조, 핵산 및 단백질이 보존되도록 해야 합니다. 채취부터 포매까지 각 단계에서는 조직학적 검사, 면역조직화학 및 분자 연구를 비롯한 다양한 분석을 위해 시료의 온전성을 유지할 수 있도록 정밀한 작업이 필요합니다. 이 고정 및 포매 과정을 적절하게 수행하면 보존된 조직이 생체 내 상태를 정확하게 반영하여 신뢰할 수 있는 진단 및 연구 결과를 얻을 수 있습니다.
FFPE 조직 시료의 포매 과정에서 주요 6단계를 안내합니다.
- 조직 채취
살아 있는 포유류에서 채취한 생검 조직과 조직 배양물은 모두 FFPE 시료 준비에 필요한 신선한 조직을 얻을 수 있는 적합한 공급원입니다.
무균 기법을 사용하는 것이 중요합니다. 오염을 방지하기 위해 멸균 기구와 장갑을 사용하십시오. 가능하면 수술실이나 층류 후드와 같은 무균 환경에서 조직을 채취하십시오.
검체는 매우 손상되기 쉬우므로 세심하게 취급해야 합니다. 처리 지연을 최소화하고 절제 직후 후속 조직 처리를 시작하십시오. 이는 자가분해와 분해를 방지하는 데 매우 중요합니다. 조직을 실온으로 유지하십시오. 동결은 얼음 결정 형성과 조직 손상을 유발할 수 있으므로 피하십시오. - 조직 고정
먼저 조직을 고정액으로 처리합니다. 중성 pH로 완충된 4% 포름알데히드 수용액에 해당하는 10% 중성 완충 포르말린(NBF)을 사용하십시오.
조직을 포르말린에 완전히 담그십시오. 고정액과 조직의 부피비가 최소 10:1이 되도록 하십시오. 고정 시간은 조직의 유형과 크기에 따라 일반적으로 6–24시간입니다. 고정액이 조직 전체에 충분히 침투할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 그러나 과도한 고정은 항원 회복을 어렵게 하는 가교 결합을 유발할 수 있으며, 불충분한 고정은 조직 보존 상태를 저하시킬 수 있습니다. - 조직 다듬기
두 번째로, 고정액이 충분히 침투할 수 있도록 조직을 약 3–5 mm 두께로 다듬으십시오. 관련 조직학적 구조가 포함되도록 조직의 방향을 적절히 맞추십시오. 이렇게 하면 나중에 조직을 분석에 사용할 때 추출 과정이 수월해집니다. - 고정된 시료 처리
이제 고정된 조직을 탈수해야 합니다. 고정 후에는 파라핀 왁스가 조직 전체에 충분히 침투할 수 있도록 조직을 탈수해야 합니다. 조직을 농도가 단계적으로 증가하는 에탄올 용액(70%, 80%, 90%, 100%)에 차례로 통과시켜 수분을 제거하십시오.
자일렌을 이용한 투명화: 파라핀 왁스는 물에 녹지 않지만 자일렌에는 녹습니다. 따라서 조직 내 수분을 자일렌으로 치환해야 합니다. 그러나 자일렌 자체는 물에 녹지 않고 알코올에는 녹으므로, 먼저 수분을 알코올로 치환하는 중간 단계가 필요합니다. 조직을 자일렌 또는 자일렌 대체제에 담가 에탄올을 제거하고 파라핀 침투를 준비하십시오.
파라핀을 이용한 침투: 조직을 용융 파라핀 왁스에 넣어 완전히 침투하도록 하십시오. 이 단계에서는 일반적으로 파라핀이 조직 전체에 충분히 스며들도록 파라핀을 여러 차례 교체합니다. - 조직 포매
이 단계에서는 조직을 조직 블록으로 만듭니다. 원하는 방향으로 조직을 주형에 배치하고 그 위에 용융 파라핀을 부으십시오. 실온이나 냉각판 위에서 냉각하여 파라핀이 굳도록 하십시오. - 박절 및 슬라이드 부착
박절: 포매된 조직을 얇게 자르려면 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록에서 얇은 절편(일반적으로 4–5마이크로미터)을 만드십시오. 그런 다음 후속 염색 및 현미경 분석을 위해 절편을 유리 슬라이드에 올려 시료를 부착합니다.
마지막으로 조직학적 품질을 확인하십시오. 처음 만든 절편을 현미경으로 평가하여 고정 및 처리가 적절하게 이루어졌는지 확인하십시오. 조직 유형과 관찰된 품질에 따라 필요시 프로토콜을 조정하십시오.
FFPE 조직은 RNA, DNA 및 단백질을 회수하고 암이나 기타 질병의 징후를 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 수년간 보관할 수 있으며, 연구자와 의사가 진단 및 연구에 조직 시료를 활용하는 데 필수적인 역할을 합니다.
FFPE 조직의 일반적인 문제점과 과제는 무엇인가요?
포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 시료는 연구와 진단에 널리 사용되지만, 몇 가지 과제와 일반적인 문제점이 있습니다:
- 생체분자의 분해: 장시간 고정하면 DNA, RNA 및 단백질이 분해되어 후속 응용에 필요한 고품질 핵산이나 단백질을 추출하기 어려워질 수 있습니다. 조직 보존에는 적절한 고정(불충분한 고정과 과도한 고정을 피하는 것)이 필수적입니다.
- 항원 차폐: 고정 과정은 항원 부위를 차폐하여 면역조직화학 및 기타 면역학적 분석에서 항체 결합의 효과를 떨어뜨릴 수 있습니다. 이 때문에 에피토프의 차폐를 해제하고 에피토프와 항체의 결합을 회복시키는 절차인 항원 회복이 필요한 경우가 많습니다. 그러나 항원성이 항상 완전히 회복되는 것은 아닙니다.
- 고정 품질의 변동: 고정 시간과 조건의 차이로 시료 품질이 일정하지 않게 되어 결과의 재현성과 비교 가능성에 영향을 줄 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 고정 프로토콜을 사용하고 불충분한 고정과 과도한 고정을 피하세요.
- DNA 손상 및 단편화: FFPE 시료의 포르말린 고정은 시토신 탈아미노화(C에서 T로의 돌연변이), 산화 손상(예: G에서 T로의 돌연변이를 유발하는 8-옥소구아닌)을 비롯하여 DNA 중합효소의 활성을 방해하는 단일 가닥 절단, 간극, 염기 소실 부위와 같은 물리적 손상 등 다양한 유형의 DNA 손상을 유발할 수 있습니다. 포르말린 고정 과정은 DNA 단편화를 유발하여 PCR 및 시퀀싱과 같은 유전학 및 유전체학 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다.
- RNA 품질: FFPE 조직에서 추출한 RNA는 단편화되고 화학적으로 변형된 경우가 많아 고품질 전사체 분석을 수행하기 어렵습니다.
- 단백질 변형: 포르말린은 단백질의 화학적 변형을 유발하여 구조와 기능에 영향을 줄 수 있으며, 이는 단백질체 분석을 방해할 수 있습니다.
- 시료 처리에 따른 인공산물: 포매 및 절편 제작 과정에서 기계적 응력과 열이 인공산물을 유발하고 조직에 추가 손상을 줄 수 있습니다.
- 배치 간 변동성: 배치마다 고정 및 포매 프로토콜이 다르면 결과에 상당한 변동이 발생하여 연구 간 비교가 복잡해질 수 있습니다.
- 보관 문제: FFPE 블록을 장기간 보관하면 시간이 지남에 따라 추가적인 분해와 핵산의 온전성 손실이 발생하여 후향적 연구에서 보관 시료의 활용 가능성에 영향을 줄 수 있습니다.
가교 형성: 포르말린 고정은 단백질과 핵산의 가교 형성을 유발하며, 이는 분자 분석을 방해하고 면역조직화학 및 기타 분석의 정확도에 영향을 줄 수 있습니다.
최적화된 프로토콜 사용, 세심한 시료 취급 및 첨단 기법 적용은 FFPE 조직에서 얻은 데이터의 품질과 신뢰성을 높이는 데 도움이 됩니다.
FFPE 조직과 동결 조직의 차이점은 무엇인가요?
FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매) 조직은 포르말린으로 조직을 고정한 다음 파라핀 왁스에 포매하여 보존하므로, 조직 형태를 유지하면서 실온에서 장기간 보관할 수 있습니다. 반면, 동결 조직은 냉동을 통해 신속하게 보존하므로 핵산과 단백질의 온전성을 더 잘 유지하지만, 매우 낮은 온도에서 보관해야 합니다.
FFPE 포매에는 어떤 화학물질이 사용되나요?
FFPE 포매에 사용되는 화학물질에는 일반적으로 고정용 포르말린과 포매용 파라핀 왁스가 포함됩니다. FFPE 포매 시 조직은 일반적으로 10% (v/v) 중성 완충 포르말린(FA) 또는 파라포름알데히드 분말로 새로 조제한 4% (w/v) 포름알데히드 용액(PFA)으로 고정합니다. 포름알데히드 수용액인 포르말린은 조직 형태를 보존하고 과도한 가교 결합을 방지하기 위해 중성 pH로 완충됩니다. 파라포름알데히드 기반 용액도 단백질을 가교 결합하여 효과적으로 고정하므로, 이후 파라핀 왁스 포매를 위해 조직 구조를 안정화합니다. 이러한 화학물질은 고정 및 포매 과정에서 조직의 온전성과 형태를 유지하는 데 필수적입니다.
FFPE 시료에서 파라핀은 어떻게 제거하나요?
FFPE 시료에서 파라핀을 제거하려면 일반적으로 조직 절편을 자일렌으로 여러 차례 세척한 후, 농도가 단계적으로 낮아지는 알코올 용액을 거쳐 마지막으로 물에서 재수화합니다. 자일렌은 독성이 매우 강하여 호흡기 문제, 피부 자극, 반복 노출에 따른 잠재적인 장기적 영향 등의 건강 위험을 초래하므로, 많은 실험실에서 초음파 파라핀 제거가 유망한 대안으로 떠오르고 있습니다. 이 방법은 강력한 초음파를 사용하여 자일렌과 같은 독성 용매 없이도 파라핀을 효율적이고 안전하게 제거하므로, 실험실 작업자의 위험을 줄이고 더 안전한 작업 환경을 조성합니다.
양질의 FFPE 시료를 얻으려면 조직을 얼마나 오래 고정해야 하나요?
고정 시간에 관한 일반적인 권고에서는 보통 조직 시료를 포르말린으로 24시간에서 48시간 동안 고정하도록 제안합니다. 이 시간은 일반적으로 조직 형태와 세포 구조를 보존하면서, 과도한 가교 결합과 핵산 및 단백질의 분해를 유발할 수 있는 과도한 고정을 최소화하기에 충분합니다. 그러나 최적의 고정 시간은 조직의 크기와 유형에 따라 달라질 수 있으며, 더 작거나 더 섬세한 시료에는 더 짧은 고정 시간이 필요합니다. 조직의 자가용해와 분해를 방지할 수 있도록 충분히 고정하면서도 후속 분자 분석을 어렵게 할 수 있는 장시간의 고정은 피하도록 균형을 맞추는 것이 매우 중요합니다.