FFPE 고처리량 시료 전처리: 단백질 추출 및 핵산 전단
고처리량 초음파 발생기 UIP400MTP를 통해 Hielscher 초음파는 포르말린 고정 및 파라핀 내장 (FFPE) 조직 준비의 문제를 해결합니다. 초음파가 FFPE 탈파라핀화, 조직 용해, 균질화, 단백질 추출 및 DNA/RNA 전단을 위해 FFPE 샘플을 대량으로 처리하는 방법을 알아보십시오! 초음파 FFPE 조직 준비 활용 – 멀티웰 플레이트에서 많은 수의 시료 처리! 신뢰할 수 있는 연구 결과를 위해 고품질 샘플을 얻고 높은 샘플 수를 얻으십시오! 마지막으로 시간과 비용을 절약하십시오!
고처리량 초음파 처리로 촉진되는 FFPE 샘플 준비
포르말린 고정 및 파라핀 삽입(FFPE)은 고형 조직을 보존하고 보관하는 가장 일반적인 방법입니다. FFPE 조직 샘플에서 생체 분자를 추출하는 것은 종종 저장된 샘플의 품질로 인해 상당한 문제를 야기합니다. 분자 생물학 및 임상 연구에서 매우 귀중한 자산인 이러한 샘플은 후향적 연구 및 진단 바이오마커 검증을 위한 풍부한 생물학적 정보 소스를 제공합니다. 그러나 포르말린 고정 및 파라핀 포매 과정은 조직 구조와 형태를 보존하면서 고품질 핵산 및 단백질의 추출을 복잡하게 만듭니다. 포르말린은 핵산과 단백질의 가교를 유도하여 분자 단편화와 화학적 변형을 일으킵니다. 고스루젼 초음파기가 FFPE 시료 준비의 어려움을 어떻게 극복하는지 알아보십시오UIP400MTP!
효율적인 FFPE 시료 준비를 위한 초음파기
- 사용하기 쉬운 워크플로우: 사용자 친화적인 간소화된 프로세스.
- 탈파라핀화, 단백질 추출, DNA/RNA 전단
- 신속한 고처리량 처리: 멀티웰 플레이트의 효율적인 처리.
- 효과적인 탈파라핀화: 단백질의 용해화가 개선되었습니다.
- 무독성 용제: 크실렌과 같은 유해한 유기 용제의 사용을 피합니다.
UIP400MTP 고처리량 초음파 발생기 멀티웰 플레이트에서 고처리량 FFPE 시료 처리용
FFPE 조직에서 단백질 추출 기술의 발전
Hielscher 초음파는 고처리량 FFPE 샘플 준비의 문제를 해결합니다. 초음파 처리는 초음파를 사용하여 기계적 진동과 집중 캐비테이션을 생성하여 세포 구조를 효과적으로 파괴하고 생체 분자의 용해성을 향상시킵니다. 이 기술은 라이브러리 준비를 위한 DNA 및 RNA 전단뿐만 아니라 FFPE 조직에서 핵산 및 단백질 추출의 효율성과 수율을 높일 수 있는 능력으로 인해 인기를 얻고 있습니다. UIP400MTP multiwell plate sonicator를 사용한 초음파는 다운 스트림 응용 분야에서 이러한 생체 분자의 무결성을 유지한다는 점을 강조하는 것이 매우 중요합니다.
High-Throughput Ultrasonication을 사용한 핵산 전단
고처리량 설정에서 사용하기 위한 다중 웰 초음파 발생기 UIP400MTP는 FFPE 샘플의 준비를 새로운 차원으로 끌어 올립니다. 이 multiwell-plate 초음파 처리 방법은 여러 샘플의 동시 처리를위한 효율적이고 신뢰할 수있는 솔루션을 제공합니다. DNA, RNA 및 단백질의 빠르고 재현성 있는 추출을 용이하게 하며, 이는 차세대 염기서열분석(NGS), 정량적 PCR 및 단백질체 분석을 포함한 다양한 분석 기술에 중요합니다. 진폭, 지속 시간 및 온도와 같은 초음파 처리 매개 변수의 최적화는 추출 된 생체 분자의 품질과 양을 더욱 향상시킵니다.
멀티웰 플레이트용 UIP400MTP 초음파 발생기는 FFPE 조직에서 DNA 및 RNA의 단편화 및 전단에 상당한 이점을 제공합니다. 이 시스템의 두드러진 특징 중 하나는 DNA와 RNA의 좁은 단편 크기를 달성하여 150-200 염기쌍 (bp)의 짧은 단편 또는 15-20 킬로염기 쌍 (kbp)의 긴 단편을 얻기 위해 초음파 처리 강도의 정확한 조정 가능성을 제공하는 능력입니다. 이러한 다양성으로 인해 이 UIP400MTP는 단기 판독 및 장기 판독 염기서열 분석 응용 분야 모두에 없어서는 안 될 필수 요소이며, 차세대 염기서열 분석(NGS) 및 전체 게놈 염기서열 분석(WGS)을 위한 고품질 결과를 보장합니다. 분절 크기에 대한 정확한 제어는 사양에 따라 샘플을 준비할 수 있기 때문에 유전체학의 모든 분야의 연구자에게 매우 중요합니다.
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FFPE 샘플에서 효율적인 생체 분자 회수를 위한 UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 발생기에 대해 알아보십시오. 추출된 핵산 및 단백질의 무결성을 유지하고 결과의 재현성을 보장합니다. 이 기술은 다른 분취 및 분석 워크플로우와 원활하게 통합되어 FFPE 조직 아카이브를 사용하여 분자 조사를 간소화하고 향상시킵니다.
정착제와 그 효과
고정은 세포 구조를 보존하고 생화학 반응을 중단하며 분해를 방지하는 시료 전처리의 중요한 단계입니다. 특정 실험 요구 사항에 따라 다양한 고정제가 사용됩니다. 가장 흔한 두 가지 고정제는 포름알데히드와 파라포름알데히드로, 단백질과 핵산을 교차 결합하여 세포와 조직의 형태와 항원성을 보존합니다. 에탄올, 메탄올 및 글루타르알데히드와 같은 다른 고정제는 특정 응용 분야에 사용됩니다.
포름알데히드와 파라포름알데히드 고정제는 아미노기 사이에 메틸렌 다리를 형성하여 단백질 가교를 일으킵니다. 이 프로세스는 세포 구성 요소를 효과적으로 고정시켜 후속 분석 단계에서 무결성을 보존합니다. 이러한 고정제의 효과는 농도, pH 및 온도와 같은 요인의 영향을 받을 수 있으며, 이러한 매개변수를 최적화하는 것은 세포 구조의 최적 보존을 보장하는 데 중요합니다.
초음파 FFPE 준비의 장점
초음파는 기존 기술을 능가하는 고정 된 세포와 조직을 파괴하는 강력한 기술입니다. 기존 lysis 방법에 비해 몇 가지 주목할 만한 이점을 제공합니다.
- 속도와 효율성: 초음파 용해는 세포와 조직을 빠르게 파괴하여 기계적 또는 화학적 용해 방법에 비해 처리 시간을 크게 단축합니다. 초음파 프로브에 의해 생성된 고주파 음파는 기계적 전단력을 생성하여 고정된 세포 구조를 파괴합니다. 이러한 빠르고 효율적인 파괴를 통해 연구원들은 짧은 시간 내에 많은 양의 시료를 처리할 수 있습니다.
- 부드럽고 조정 가능: 초음파 용해는 단백질, 핵산 및 효소와 같은 민감한 생체 분자에 대한 손상을 최소화하는 부드러운 파괴 메커니즘을 제공합니다. 과도한 열이나 전단력을 생성하는 기계적 방법과 달리 초음파 용해는 제어 된 캐비테이션을 사용하여 세포 내 구성 요소의 무결성과 기능을 유지하면서 세포를 파괴합니다.
- 다재: 초음파 용해는 다양한 고정제에 적용할 수 있으므로 연구자들은 광범위한 고정된 샘플로 작업할 수 있습니다. 포름알데히드, 파라포름알데히드 또는 대체 고정제를 사용하든 초음파 용해는 일관되게 효율적인 파괴를 제공하여 세포 구성 요소의 최적 회수를 보장합니다.
- 높은 수율과 품질: 초음파 용해는 고정 된 세포와 조직을 균일하게 파괴하는 능력으로 인해 손상되지 않은 세포 구성 요소의 높은 수율을 촉진합니다. 이를 통해 단백질 분석, 핵산 추출 및 효소 분석과 같은 다운스트림 응용 분야에서 신뢰할 수 있고 재현성 있는 결과를 얻을 수 있습니다.
- 자동화 호환성: 초음파 용해는 자동화 시스템에 쉽게 통합될 수 있어 고처리량 시료 처리가 가능합니다. 이러한 호환성을 통해 연구자들은 특히 대규모 연구에서 워크플로우를 간소화하고 생산성을 높일 수 있습니다.
96웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP Microtiter 및 Multiwell 플레이트의 초음파 처리용
초음파 용해는 고정된 세포와 조직의 파괴에 혁명을 일으켜 기존 용해 방법에 비해 많은 이점을 제공합니다. 속도, 효율성, 선택성, 다양성, 높은 수율 및 자동화 호환성으로 인해 분자 생물학 및 생명 공학 연구에 없어서는 안될 도구입니다. 비접촉식 초음파 발생기와 프로브 형 초음파를 제공하는 Hielscher 초음파는 생명 과학 응용 분야에 가장 적합한 초음파 균질화를 제공합니다. 단일 샘플, 여러 샘플 또는 매우 높은 샘플 수를 동시에 처리하려는 경우 연구 및 진단 요구 사항에 맞는 최고의 초음파 발생기를 제공합니다.
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설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질
Hielscher 초음파는 최고의 품질과 디자인 표준으로 잘 알려져 있습니다. 견고 함과 쉬운 작동으로 초음파를 산업 시설에 원활하게 통합 할 수 있습니다. 거친 조건과 까다로운 환경은 Hielscher 초음파기로 쉽게 처리 할 수 있습니다.
Hielscher 초음파는 ISO 인증 회사이며 최첨단 기술과 사용자 친화성을 갖춘 고성능 초음파에 특히 중점을 둡니다. 물론, Hielscher 초음파는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.
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UIP400MTP 초음파 발생기 : Multi-Well-Plate의 고처리량 FFPE 시료 전처리
자주 묻는 질문(FAQ)
아래에서는 FFPE 조직 준비 및 FFPE 샘플의 초음파와 관련된 자주 묻는 질문에 답변합니다.
FFPE 조직은 어떻게 준비됩니까?
FFPE 조직 준비 단계: 신선한 조직의 세심한 취급 및 처리는 고품질 FFPE 샘플을 생성하는 데 매우 중요합니다. 세포 구조, 핵산 및 단백질의 보존을 보장하는 것은 정확한 다운스트림 분석에 필수적입니다. 수집에서 임베딩에 이르는 각 단계에는 조직학적 검사, 면역조직화학 및 분자 연구를 포함한 다양한 분석을 위해 시료의 무결성을 유지하기 위한 정밀도가 필요합니다. 이 고정 및 부착 과정이 적절하게 실행되면 보존된 조직이 생체 내 상태를 정확하게 반영하여 신뢰할 수 있는 진단 및 연구 결과를 얻을 수 있습니다.
FFPE 조직 샘플의 포매 공정의 6가지 주요 단계를 안내합니다.
- 조직 채취
살아있는 포유류와 조직 배양에서 생검을 하는 것은 모두 FFPE 시료 준비를 위한 신선한 조직을 얻기 위한 실행 가능한 소스입니다.
무균 기술을 사용하는 것이 중요합니다: 오염을 방지하기 위해 멸균 기구와 장갑을 사용하십시오. 이상적으로는 수술실이나 층류 후드와 같은 멸균 환경에서 조직을 수집하십시오.
검체는 매우 깨지기 쉬우므로 민감한 취급이 필수적입니다: 처리 지연을 최소화하고 절제 후 즉시 조직 처리를 시작하십시오. 이는 자가분해 및 성능 저하를 방지하는 데 매우 중요합니다. 조직을 실온에 보관하십시오. 얼음 결정이 형성되고 조직이 손상될 수 있으므로 결빙을 피하십시오. - 조직 고정
먼저, 조직을 고정 용액으로 처리합니다: 물에 포함된 4% 포름알데히드에 해당하는 10% 중성 완충 포르말린(NBF)을 사용하고 중성 pH로 완충합니다.
조직을 포르말린에 완전히 담그십시오. 최소 10:1의 고정제 대 조직 부피 비율을 보장합니다. 고정 시간은 일반적으로 조직의 유형과 크기에 따라 6시간에서 24시간 사이입니다. 정착제가 조직에 완전히 침투할 수 있는 것이 중요합니다. 그러나 과도하게 고정하면 항원 회수를 복잡하게 만드는 가교(cross-linking)가 발생할 수 있으며, 과소 고정은 조직 보존을 불량하게 만들 수 있습니다. - 조직 트리밍
둘째, 정착액이 적절하게 침투할 수 있도록 조직을 약 3-5mm 두께로 자릅니다. 관련 조직학적 구조를 포착하기 위해 조직의 올바른 방향을 확인합니다. 이렇게 하면 조직이 나중에 분석에 사용될 때 추출 과정이 용이해집니다. - 고정된 시료 처리
이제, 고정 조직은 탈수되어야 합니다: 고정 후, 조직은 파라핀 왁스가 완전히 침투할 수 있도록 탈수되어야 합니다. 조직을 등급이 매겨진 일련의 에탄올(70%, 80%, 90% 및 100%)에 통과시켜 수분을 제거합니다.
크실렌으로 청소: 파라핀 왁스는 물에 녹지 않지만 크실렌에는 용해됩니다. 따라서 조직의 수분은 크실렌으로 교체해야 합니다. 그러나 크실렌 자체는 물에는 녹지 않지만 알코올에는 용해되므로 먼저 물을 알코올로 대체하는 중간 단계가 필요합니다. 조직을 크실렌 또는 크실렌 대체품에 담그어 에탄올을 제거하고 파라핀 침투를 위해 조직을 준비합니다.
파라핀을 사용한 침투: 용융된 파라핀 왁스에 조직을 삽입하여 완전한 침투를 보장합니다. 이 단계에는 일반적으로 철저한 함침을 보장하기 위해 파라핀을 여러 번 변경하는 작업이 포함됩니다. - 조직 삽입
이 단계에서 조직을 조직 블록으로 성형합니다: 원하는 방향으로 조직을 금형에 넣고 그 위에 용융 파라핀을 붓습니다. 파라핀이 실온이나 냉각판에서 냉각되어 응고되도록 합니다. - 단면화 및 장착
마이크로토미(Microtomy): 내장된 조직을 절단하려면 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록에서 얇은 부분(일반적으로 4-5마이크로미터)을 절단합니다. 그런 다음 샘플을 장착하고 후속 염색 및 현미경 분석을 위해 유리 슬라이드에 섹션을 배치합니다.
마지막으로, 조직학의 품질을 확인하십시오: 적절한 고정 및 처리를 보장하기 위해 현미경으로 첫 번째 섹션을 평가합니다. 조직 유형과 관찰된 품질에 따라 필요에 따라 프로토콜을 조정합니다.
FFPE 조직은 RNA, DNA 및 단백질을 복구하고 암 또는 기타 질병의 징후를 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 수년 동안 보관할 수 있으며 연구원과 의사가 진단 및 연구를 위해 조직 샘플을 활용하는 방법의 필수적인 부분입니다.
FFPE 조직의 일반적인 문제와 과제는 무엇입니까?
FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) 조직 샘플은 연구 및 진단에 널리 사용되지만 다음과 같은 몇 가지 과제와 일반적인 문제를 제시합니다.
- 생체 분자의 분해: 장기간 고정하면 DNA, RNA 및 단백질이 분해되어 다운스트림 응용 분야를 위한 고품질 핵산 또는 단백질을 추출하기 어려울 수 있습니다. 올바른 고정(과소 고정 및 과잉 고정을 피하는 것)은 조직 보존에 필수적입니다.
- 항원 마스킹: 고정 과정은 항원 부위를 마스킹하여 면역조직화학 및 기타 면역학적 분석에서 항체 결합의 효과를 감소시킬 수 있습니다. 이를 위해서는 종종 항원 회수가 필요하며, 이를 통해 에피토프의 마스킹이 역전되고 에피토프-항체 결합이 복원됩니다. 그러나 완전한 항원성이 항상 복원되는 것은 아닙니다.
- 변하기 쉬운 정착 질: 고정 시간 및 조건의 차이로 인해 시료 품질이 일관되지 않아 결과의 재현성과 비교 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 고정 프로토콜을 사용하고 과소 고정 및 과잉 고정을 피하십시오.
- DNA 손상 및 단편화: FFPE 샘플의 포르말린 고정은 사이토신 탈아민화(C에서 T로의 돌연변이), 산화적 손상(예: G에서 T로의 돌연변이로 이어지는 8-옥소-구아닌) 및 DNA 중합효소 활성을 방해하는 흠집, 틈 및 비염기성 부위와 같은 물리적 중단을 포함한 다양한 유형의 DNA 손상을 유발할 수 있습니다. 포르말린 고정 과정은 DNA의 단편화를 일으켜 PCR 및 염기서열 분석과 같은 유전자 및 게놈 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다.
- RNA 품질: FFPE 조직에서 추출한 RNA는 종종 단편화되고 화학적으로 변형되어 고품질 전사체 분석을 수행하기 어렵습니다.
- 단백질 변형: 포르말린은 단백질의 화학적 변형을 유도하여 단백질의 구조와 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 단백질체 분석을 방해할 수 있습니다.
- 샘플 처리 아티팩트: 매립 및 절편 과정에서 기계적 응력과 열로 인해 아티팩트가 발생하고 조직에 추가 손상이 발생할 수 있습니다.
- 배치 간 변동성: 서로 다른 배치 간의 고정 및 임베딩 프로토콜의 차이는 결과에 상당한 변동을 초래할 수 있으며, 이는 연구 간 비교를 복잡하게 만들 수 있습니다.
- 스토리지 문제: FFPE 블록을 장기간 보관하면 시간이 지남에 따라 핵산 무결성이 추가로 저하되고 손실될 수 있으며, 이는 후향적 연구를 위한 보관 샘플의 실행 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
가교: 포르말린 고정은 단백질과 핵산의 가교를 유발하여 분자 분석을 방해하고 면역조직화학 및 기타 분석의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다.
최적화된 프로토콜을 사용하고, 신중한 시료 취급 및 고급 기술을 적용하면 FFPE 조직에서 얻은 데이터의 품질과 신뢰성을 개선하는 데 도움이 됩니다.
FFPE와 냉동 티슈의 차이점은 무엇입니까?
FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) 조직은 포르말린을 사용하여 조직을 고정한 다음 파라핀 왁스에 삽입하여 조직 형태를 유지하면서 실온에서 장기간 보관할 수 있습니다. 대조적으로, 동결된 조직은 동결에 의해 빠르게 보존되어 핵산과 단백질의 무결성을 더 잘 유지하지만 매우 낮은 온도에서 보관해야 합니다.
FFPE 임베딩에는 어떤 화학 물질이 사용됩니까?
FFPE 임베딩에 사용되는 화학 물질에는 일반적으로 고정용 포르말린과 임베딩용 파라핀 왁스가 포함됩니다. FFPE 임베딩의 경우 일반적으로 10%(v/v) 중성 완충 포르말린(FA) 또는 파라포름알데히드 분말로 만든 새로 준비된 4%(w/v) 포름알데히드 용액(PFA)을 사용하여 조직을 고정합니다. 물에 함유된 포름알데히드 용액인 포르말린은 조직 형태를 보존하고 과도한 가교를 방지하기 위해 중성 pH로 완충됩니다. 파라포름알데히드 기반 용액은 또한 단백질을 가교하여 효과적인 고정을 제공하여 파라핀 왁스에 후속 포매를 위한 조직 구조를 안정화합니다. 이러한 화학 물질은 고정 및 매립 과정에서 조직의 무결성과 형태를 유지하는 데 필수적입니다.
FFPE 샘플에서 파라핀을 어떻게 제거합니까?
FFPE 샘플에서 파라핀을 제거하기 위해 조직 절편은 일반적으로 일련의 크실렌 세척을 거친 다음 등급이 매겨진 일련의 알코올을 통해 재수화하고 마지막으로 물을 사용합니다. 크실렌은 독성이 강하여 호흡기 문제, 피부 자극 및 반복적인 노출로 인한 잠재적인 장기 영향과 같은 건강 위험을 초래하기 때문에 초음파 파라핀 제거는 많은 실험실에서 유망한 대안으로 부상하고 있습니다. 이 방법은 강렬한 초음파를 사용하여 크실렌과 같은 독성 용제 없이 파라핀을 효율적이고 안전하게 제거함으로써 실험실 직원에 대한 위험을 줄이고 보다 안전한 작업 환경을 조성합니다.
좋은 FFPE 시료 품질을 위해 조직을 얼마나 오래 고정해야 합니까?
고정 기간에 대한 일반적인 권장 사항은 일반적으로 조직 샘플을 포르말린에 24-48시간 동안 고정하는 것을 제안합니다. 이 기간은 일반적으로 조직 형태 및 세포 구조를 보존하면서 핵산 및 단백질의 과도한 교차 결합 및 분해를 유발할 수 있는 과잉 고정을 최소화하기에 충분합니다. 그러나 최적의 고정 시간은 조직의 크기와 유형에 따라 달라질 수 있으며, 더 작거나 더 섬세한 샘플은 더 짧은 고정 시간이 필요합니다. 조직 자가분해 및 분해를 방지하기 위해 적절한 고정의 균형을 맞추는 동시에 다운스트림 분자 분석을 복잡하게 만들 수 있는 장기간의 고정을 피하는 것이 중요합니다.