포도상구균 생물막 배양 및 분리 프로토콜

신뢰할 수 있는 연구 결과를 위해서는 표준화된 방법이 필수적입니다. 여기에서 포도상구균 생물막에 대한 배양 및 분리 프로토콜을 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 효율적인 고스루UIP400MTP 바이오필름 분리를 위해 멀티웰 플레이트 초음파 발생기를 사용하여 간소화된 고처리량 시료 전처리에 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 또한 변동성을 최소화하고 재현성을 보장하는 데 중점을 두고 생물막 배양, 세척 및 시각화를 위한 핵심 단계를 포함하고 있습니다.

포도상구균 생물막 및 항생제 연구

포도상구균 생물막은 항생제와 면역 반응에 대한 내성으로 인해 지속적인 감염에 중요한 역할을 합니다. 생물막 형성은 박테리아를 보호하는 환경을 제공하여 감염을 치료하기 어렵게 만듭니다. 생물막에 대한 연구는 종종 생물막의 형성, 거동 및 항균제에 대한 감수성을 이해하는 데 중점을 두며, 실험 워크플로우를 간소화하기 위한 고처리량 방법에 중점을 둡니다.
UIP400MTP 멀티 웰 플레이트 초음파 발생기는 96 웰 플레이트에서 생물막을 빠르고 효율적으로 분리 할 수 있도록함으로써 생물막 연구에서 상당한 이점을 제공합니다. 이 장치는 모든 웰에 균일한 초음파 에너지를 제공하여 변동성을 최소화하면서 일관된 결과를 보장합니다.

포도상구균 생물막 배양 및 분리를 위한 프로토콜

아래에서는 포도상구균 생물막을 배양하고 분리하는 과정을 단계별로 안내합니다. 예시적인 분석 단계로, 결정 보라색 염색을 통해 배양된 바이오매스를 분광광도계로 정량화하는 방법을 보여줍니다.

포도상구균 생물막의 배양

필요한 재료:

• 멸균, 바닥이 평평한 96웰 폴리스티렌 조직 배양 처리된 마이크로타이터 플레이트(뚜껑 포함)
• 포도당이 0.25% 함유된 트립틱 대두 육수(TSB)
• 생물 안전 작업대

단계:

1. 오염을 최소화하기 위해 생물 안전 작업대에 멸균 작업 환경을 준비하십시오.
2. 0.25% 포도당을 함유한 TSB를 마이크로타이터 플레이트 웰에 추가합니다. 포도당이 없는 TSB는 일반적으로 생물막 형성을 지원하지 않으며 필요한 경우에만 대조군으로 사용해야 합니다.
3. 아래 설명 된대로 준비된 박테리아 균주를 우물에 접종하십시오.
4. 초음파 처리를 사용하여 현탁액을 균질화하거나 23 게이지 바늘과 짧은 와류로 군집을 분해하여 기존 세포 군집이 없는지 확인하고 박테리아 현탁액을 준비합니다.
5. 플레이트를 뚜껑으로 밀봉하고 생물막 형성에 최적의 조건(예: 37°C에서 24시간 동안 배양)에서 배양합니다.
6. 신뢰성을 보장하기 위해 각 박테리아 균주(균주당 3개의 웰)에 대해 3배로 실험을 수행합니다.
7. 네거티브 컨트롤을 위해 플레이트당 6개의 웰을 할당합니다. 96웰 플레이트당 최대 30개의 균주를 테스트할 수 있습니다.

Biofilm 시각화 및 세척

1. 배양 후에는 생물막을 방해하지 않도록 배지를 조심스럽게 폐기하십시오.
2. 플랑크톤 박테리아를 제거하기 위해 생리식염수로 각 우물을 4번 씻으십시오.
3. 웰 바닥에서 생물막이 존재함을 나타내는 흰색 반점이 있는지 검사합니다.

Multi-Well Plate Sonicator UIP400MTP를 사용한 생물막 박리

장치 설정 및 매개변수:

• UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 발생기
• 작동 설정: 60% 진폭, 60초 ON / 30초 OFF의 사이클 모드

단계:

1. 세척된 마이크로타이터 플레이트를 UIP400MTP 플랫폼에 놓습니다.
2. 권장 설정(60% 진폭, 60초 ON, 30초 OFF)에서 샘플을 초음파 처리합니다. 박테리아 균주에 맞게 설정을 조정합니다.
3. 생물막을 분리하기 위해 초음파 처리 과정을 시작합니다. 초음파는 생물막 매트릭스를 파괴하여 부착 박테리아를 방출합니다.
4. 이 UIP400MTP는 일관된 박리 결과를 위해 모든 웰에 걸쳐 균일한 노출을 보장합니다.

분석 단계: Crystal Violet(CV)을 사용한 분리된 포도상구균 생물막 바이오매스의 정량화

필요한 재료:

• 0.1% 크리스탈 바이올렛(CV) 용액
• 95% 에탄올 또는 30% 아세트산(가용화용)
• 570nm에서 판독할 수 있는 마이크로플레이트 리더
• 염색을 위한 멸균 마이크로타이터 플레이트

단계:

1. 염색 플레이트의 준비 : 초음파 처리 된 플레이트의 각 웰에서 분리 된 생물막 현탁액 100 μL를 깨끗하고 멸균 된 96 웰 마이크로 타이터 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 이를 통해 염색을 위한 명확하고 균일한 환경이 보장됩니다.
2. 분리된 생물막 염색: 분리된 생물막 현탁액이 포함된 각 웰에 0.1% 결정 보라색 용액 150μL를 추가합니다. 생물막 현탁액과 크리스탈 바이올렛이 고르게 섞일 수 있도록 부드럽게 피펫팅합니다.
3. 배양: 크리스탈 바이올렛이 바이오매스를 효과적으로 염색할 수 있도록 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양하도록 합니다.
4. 세척: 배양 후에는 바이오매스를 방해하지 않고 우물에서 크리스탈 바이올렛 용액을 조심스럽게 버리십시오. 멸균 생리식염수로 각 우물을 세 번 씻어 결합되지 않은 얼룩을 제거합니다.
5. 건조: 플레이트를 실온 또는 멸균 공기 흐름 후드 아래에서 공기 건조시키십시오. 결과가 변경될 수 있으므로 가열하지 마십시오.
6. 용해: 200μL의 95% 에탄올(또는 표준 실험실 관행에 따라 30% 아세트산)을 각 웰에 추가하여 결합된 결정 보라색을 용해시킵니다. 피펫팅하거나 플레이트를 실온에서 10분 동안 흔들어 부드럽게 섞습니다.
7. 측정: 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 용해된 결정 보라색 용액의 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
8. 데이터 분석: 배경 염색을 설명하기 위해 실험 웰에서 음성 대조군(TSB가 있지만 박테리아 접종물이 없는 웰)의 평균 OD570 값을 뺍니다. 데이터를 기록하고 분석합니다.

참고: 재현성을 보장하기 위해 각 조건에 대해 세 번에 걸쳐 실험을 수행합니다. 크리스탈 바이올과 에탄올의 적절한 취급을 보장하고 안전 및 폐기 프로토콜을 준수하십시오.
 

UIP400MTP의 주요 이점 한 눈에 보기:

• 고처리량 처리: 멀티웰 플레이트를 위해 특별히 설계되어 여러 시료를 동시에 처리할 수 있습니다.
• 균일한 초음파 분포: 웰 전체에서 동일한 초음파 강도를 보장하여 모든 샘플에서 일관된 결과를 제공합니다.
• 표준 플레이트를 사용하십시오. UIP400MTP는 모든 표준 멀티웰 플레이트, 페트리 접시 및 튜브 랙을 처리할 수 있습니다. 고가의 독점 플레이트가 필요하지 않습니다!
• 사용자 친화적 인 인터페이스 : 설정 및 제어가 쉬워 실험실 생산성을 높일 수 있는 탁월한 도구입니다. 프로그래밍 가능한 설정 및 자동화는 프로세스 표준화를 용이하게 합니다!