포도상구균 생물막 배양 및 분리 프로토콜

신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻으려면 표준화된 방법이 필수적입니다. 여기에서는 포도상구균 생물막의 배양 및 분리 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 UIP400MTP 다중 웰 플레이트 초음파 처리기를 사용하여 96웰 플레이트에서 생물막을 효율적으로 대량 분리하기 위한 간소화된 고처리량 시료 준비에 중점을 둡니다. 또한 변동성을 최소화하고 재현성을 확보하는 데 초점을 맞춘 생물막 배양, 세척 및 시각화의 주요 단계도 포함합니다.

포도상구균 생물막 및 항생제 연구

포도상구균 생물막은 항생제와 면역 반응에 대한 내성으로 인해 지속성 감염에서 핵심적인 역할을 합니다. 생물막 형성은 세균에 보호 환경을 제공하여 감염 치료를 어렵게 합니다. 생물막 연구는 실험 작업 흐름을 간소화하는 고처리량 방법에 중점을 두면서 생물막의 형성, 거동 및 항균제 감수성을 이해하는 데 초점을 맞추는 경우가 많습니다.
UIP400MTP 다중 웰 플레이트 초음파 처리기는 96웰 플레이트에서 생물막을 빠르고 효율적으로 분리할 수 있어 생물막 연구에 상당한 이점을 제공합니다. 이 장치는 모든 웰에 균일한 초음파 에너지를 제공하여 변동성을 최소화하면서 일관된 결과를 보장합니다.

포도상구균 생물막 배양 및 분리 프로토콜

아래에서는 포도상구균 생물막을 배양하고 분리하는 과정을 단계별로 안내합니다. 분석 단계의 예로, 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 배양된 생물량을 분광광도법으로 정량하는 방법을 보여드립니다.

포도상구균 생물막 배양

필요한 재료:

• 뚜껑이 있으며 조직 배양용 표면 처리를 한 멸균 평저형 96웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트
• 0.25% 포도당이 함유된 트립틱 소이 액체배지(TSB)
• 생물안전작업대

단계:

1. 오염을 최소화하기 위해 생물안전작업대 안에 멸균 작업 환경을 준비합니다.
2. 마이크로타이터 플레이트의 웰에 0.25% 포도당이 함유된 TSB를 첨가합니다. 포도당이 없는 TSB는 일반적으로 생물막 형성을 지원하지 않으므로 필요한 경우에만 대조군으로 사용해야 합니다.
3. 아래에 설명된 방법으로 준비한 세균 균주를 웰에 접종합니다:
4. 초음파 처리로 현탁액을 균질화하거나 23게이지 바늘과 짧은 볼텍싱으로 응집체를 분산시켜 기존 세포 응집체가 없도록 세균 현탁액을 준비합니다.
5. 플레이트를 뚜껑으로 밀봉하고 생물막 형성에 최적인 조건에서 배양합니다(예: 37°C에서 24시간).
6. 신뢰성을 확보하기 위해 각 세균 균주에 대해 실험을 세 번 반복합니다(균주당 세 개의 웰).
7. 플레이트당 여섯 개의 웰을 음성 대조군으로 배정합니다. 96웰 플레이트당 최대 30개 균주를 시험할 수 있습니다.

생물막 시각화 및 세척

1. 배양 후 생물막이 흐트러지지 않도록 배지를 조심스럽게 버립니다.
2. 부유 세균을 제거하기 위해 각 웰을 생리식염수로 네 번 세척합니다.
3. 웰 바닥에 생물막의 존재를 나타내는 흰색 반점이 있는지 확인합니다.

다중 웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP를 이용한 생물막 분리

장치 설정 및 매개변수:

• UIP400MTP 다중 웰 플레이트 초음파 처리기
• 작동 설정: 진폭 60%, 60초 켜짐 / 30초 꺼짐의 주기 모드

단계:

1. 세척한 마이크로타이터 플레이트를 UIP400MTP 플랫폼 위에 놓습니다.
2. 권장 설정(진폭 60%, 60초 켜짐, 30초 꺼짐)으로 시료를 초음파 처리합니다. 세균 균주에 맞게 설정을 조정합니다.
3. 생물막을 분리하기 위해 초음파 처리를 시작합니다. 초음파는 생물막 기질을 파괴하여 부착된 세균을 방출합니다.
4. UIP400MTP는 모든 웰에 걸쳐 균일한 초음파 노출을 보장하여 일관된 분리 결과를 제공합니다.

분석 단계: 크리스탈 바이올렛(CV)을 이용한 분리된 포도상구균 생물막 생물량의 정량

필요한 재료:

• 0.1% 크리스탈 바이올렛(CV) 용액
• 95% 에탄올 또는 30% 아세트산(가용화용)
• 570 nm에서 측정할 수 있는 마이크로플레이트 리더
• 염색용 멸균 마이크로타이터 플레이트

절차:

1. 염색용 플레이트 준비: 초음파 처리한 플레이트의 각 웰에서 박리된 바이오필름 현탁액 100 µL를 취하여 깨끗한 멸균 96웰 마이크로타이터 플레이트의 대응하는 웰로 옮깁니다. 이렇게 하면 깨끗하고 균일한 염색 환경을 확보할 수 있습니다.
2. 박리된 바이오필름 염색: 박리된 바이오필름 현탁액이 들어 있는 각 웰에 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액 150 µL를 첨가합니다. 바이오필름 현탁액과 크리스탈 바이올렛이 고르게 혼합되도록 부드럽게 피펫팅합니다.
3. 반응: 크리스탈 바이올렛이 바이오매스를 효과적으로 염색할 수 있도록 플레이트를 실온에서 15분 동안 반응시킵니다.
4. 세척: 반응 후 바이오매스가 흐트러지지 않도록 각 웰의 크리스탈 바이올렛 용액을 조심스럽게 버립니다. 결합하지 않은 염료를 제거하기 위해 각 웰을 멸균 생리식염수로 세 번 세척합니다.
5. 건조: 플레이트를 실온이나 무균 기류 후드 안에서 자연 건조합니다. 가열하면 결과가 달라질 수 있으므로 가열을 피합니다.
6. 가용화: 결합된 크리스탈 바이올렛을 가용화하기 위해 각 웰에 95% 에탄올(또는 실험실의 표준 관행에 따라 30% 아세트산) 200 µL를 첨가합니다. 실온에서 10분 동안 피펫팅하거나 플레이트를 흔들어 부드럽게 혼합합니다.
7. 측정: 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가용화된 크리스탈 바이올렛 용액의 광학 밀도(OD)를 570 nm에서 측정합니다.
8. 데이터 분석: 배경 염색을 보정하기 위해 실험 웰의 측정값에서 음성 대조군(TSB는 들어 있지만 세균 접종물은 없는 웰)의 평균 OD570 값을 뺍니다. 데이터를 기록하고 분석합니다.

참고: 재현성을 확보하기 위해 각 조건에서 실험을 세 번씩 수행합니다. 안전 및 폐기 지침을 준수하여 크리스탈 바이올렛과 에탄올을 적절하게 취급합니다.
 

UIP400MTP의 주요 장점 한눈에 보기:

• 고처리량 처리: 멀티웰 플레이트용으로 특별히 설계되어 여러 시료를 동시에 처리할 수 있습니다.
• 균일한 초음파 분포: 모든 웰에 동일한 초음파 강도를 제공하여 모든 시료에서 일관된 결과를 보장합니다.
• 모든 표준 플레이트 사용 가능: UIP400MTP는 모든 표준 멀티웰 플레이트, 페트리 접시 및 튜브 랙을 처리할 수 있습니다. 고가의 전용 플레이트가 필요하지 않습니다!
• 사용자 친화적인 인터페이스: 설정과 제어가 간편하여 실험실 생산성을 높이는 데 탁월한 도구입니다. 프로그래밍 가능한 설정과 자동화로 공정 표준화가 용이합니다!