최소 억제 농도(MIC) 분석 프로토콜
Biofilm-Based Minimum Inhibitory Concentration (MIC) 분석은 보호적인 세포외 기질로 인해 높은 내성을 보이는 생물막 관련 미생물에 대한 항균제의 효과를 평가하기 위한 필수 방법입니다. 이 분석에서 중요한 단계는 정확한 생존력 평가를 위해 내장된 세포를 방출하기 위해 생물막 구조를 파괴하는 것입니다. UIP400MTP 멀티 웰 플레이트 초음파 발생기는 집속 초음파를 사용하여 제어 된 캐비테이션을 생성하고 생물막 세포를 효율적으로 분리하여 균일 한 현탁액으로 분산시킴으로써이 과정을 용이하게합니다. 이 정밀하고 재현 가능한 생물막 파괴는 MIC 분석의 신뢰성과 처리량을 향상시켜 UIP400MTP 생물막 연구를 발전시키는 데 필수적인 도구로 만듭니다.
Biofilm Detachment에 대한 초음파 처리
Biofilm-Based MIC Assay는 일반적으로 도금, 콜로니 카운팅 또는 광학 밀도 측정과 같은 방법을 사용하여 박테리아 생존력 또는 성장 억제를 측정합니다. 초음파 처리는 생물막 관련 미생물의 항균 감수성을 평가할 때 생물막 기반 MIC 분석에서 중요한 단계입니다. 주요 기능은 정확한 분석을 위해 생물막 매트릭스에 매립된 세포를 균일한 현탁액으로 분리 및 분산시키는 것입니다.
생물막은 플랑크톤 세포에 비해 항균제에 대한 내성이 훨씬 더 강하여 정확한 분석을 위해 적절한 분리가 중요합니다. 이 과정에서 초음파는 제어된 캐비테이션을 생성하여 생물막 매트릭스를 분해하고 내장된 세포를 회수 매체 내의 균일한 현탁액으로 방출합니다. 이 단계를 통해 도금, 희석 및 콜로니 계수와 같은 방법을 통해 생물막에 분산된 세포의 정확한 생존력 평가를 가능하게 합니다. 초음파 처리를 통한 적절한 생물막 파괴는 잔류 매트릭스 구성 요소가 세포를 차폐하는 것을 방지하며, 그렇지 않으면 항균 활성을 과소 평가할 수 있습니다. 다중 웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP는 이러한 목적에 특히 적합하며, 정확하고 재현 가능한 초음파 처리 조건을 제공하여 분석 플레이트의 신뢰할 수 있고 처리량이 높은 준비를 보장합니다.
UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 발생기 MIC 및 MBEC 분석에서 정밀하게 제어 가능한 생물막 분리용.
Biofilm-Based Minimum Inhibitrory Concentration Assay에서 초음파 처리가 필요한 이유
생존도 측정 및 세포 계수를 위해서는 단일 세포의 완전하고 신뢰할 수 있는 분리 및 분산이 필요합니다. 이 UIP400MTP는 균일하고 손상되지 않는 생물막 분리 및 세포 분산을 촉진하여 강력한 분석 결과를 제공합니다.
- 생물막 복잡성: 생물막은 세포외 고분자 물질(EPS) 매트릭스에 둘러싸인 구조화된 미생물 군집으로, 미생물을 보호하고 항균제에 대한 내성을 높입니다.
- 균일한 분산: 생물막에 포매된 세포의 생존력 또는 항균제에 대한 감수성을 정확하게 측정하려면 먼저 생물막을 제거하고 균질한 현탁액으로 분해해야 합니다.
생물막 기반 최소 억제 농도 분석 프로토콜
MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 분석은 미생물의 가시적 성장을 억제하는 데 필요한 항균제의 최저 농도를 측정합니다. 이 프로토콜은 생물막 관련 미생물을 위해 설계되었으며, 생물막 파괴를 위해 멀티웰 플레이트 초음파 발생기를 사용합니다UIP400MTP.
1단계: 세균 접종물의 준비
- 박테리아 현탁액을 준비합니다.
적절한 매체에서 박테리아를 중간 로그 단계까지 성장시킵니다.
표준화된 세포 밀도(예: 0.5 McFarland 표준 또는 OD600 ~0.1)를 얻기 위해 배양을 희석합니다. - 항균 용액 준비:
항균제를 적절한 매체에 희석하여 농도 범위를 생성합니다(예: 2중 연속 희석). - 96well 플레이트에 분주:
항균 용액을 표준 96웰 플레이트의 웰에 추가하고 최종 웰 부피는 ~150–200 μL입니다.
성장 조절(항균제 없음) 및 멸균 조절(박테리아 접종 없음)을 포함합니다.
2단계: 페그 뚜껑에 생물막 형성
- 페그 뚜껑을 부착합니다.
특수 페그 뚜껑을 접종된 웰에 놓고 페그가 박테리아 현탁액에 완전히 잠기도록 합니다. - 플레이트를 배양합니다.
적절한 온도(예: 37°C)에서 지정된 기간(예: 24시간) 동안 정적 조건에서 배양하여 페그에 생물막을 형성할 수 있도록 합니다. - 못을 헹굽니다.
박테리아 현탁액에서 페그 뚜껑을 제거하고 멸균 식염수 또는 PBS로 부드럽게 헹구어 느슨하게 부착된 플랑크톤 세포를 제거합니다. - 항생제에 노출:
페그 뚜껑을 이전에 준비한 항균 희석액이 들어 있는 새 96웰 플레이트로 옮깁니다.
항균제가 생물막에 작용할 수 있도록 정적 조건에서 정의된 기간(예: 24시간) 동안 배양합니다.
3단계: 항생제 노출
멀티웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP 고처리량 시료 전처리용
4 단계 : Microplate Sonicator UIP400MTP로 초음파 처리
초음파 처리 단계는 생존 가능성을 평가하기 위해 페그 뚜껑에서 생물막을 분리하는 데 중요합니다. UIP400MTP 초음파 발생기에 대해 다음 단계를 따르십시오.
- 설정을 준비합니다.
새 96웰 플레이트에 각 웰에서 회수 배지(예: 중화액 또는 멸균 성장 배지)를 채웁니다. - 페그 뚜껑을 옮깁니다.
항균 처리판에서 못 뚜껑을 제거합니다.
페그 뚜껑을 멸균 식염수 또는 PBS로 헹구어 잔류 항균제를 제거합니다. - 초음파 발생기에 플레이트를 배치합니다.
페그 뚜껑을 회수 매체 플레이트에 부착합니다.
회수 매체 플레이트를 UIP400MTP 초음파 발생기에 넣고 설명 된 설명서와 같이 플레이트가 중앙에 안정적으로 놓이도록합니다. - 초음파 처리 매개 변수 조정 :
UIP400MTP에서 초음파 처리 매개 변수를 설정합니다 (설정은 생물막에 맞게 조정 될 수 있음).
진폭: 70–100%.
초음파 처리 시간 : 사이클 모드에서 1-3 분 (생물막 구조에 따라 조정). - 초음파 처리:
초음파 처리 과정을 시작하십시오. 초음파는 생물막 매트릭스를 파괴하고 세포를 회수 매체로 제거합니다. - 프로세스를 모니터링합니다.
플러그형 온도 센서를 사용하여 웰의 샘플 온도를 모니터링합니다. UIP400MTP는 냉각을 위해 실험실 냉각기에 연결할 수 있습니다. - 초음파 처리 후 :
후속 분석을 위해 분리된 생물막이 포함된 회수 배지를 새로운 멸균 플레이트로 즉시 옮깁니다.
(A) 생물막 형성, 세포 회수 및 MIC 및 MBEC의 측정에 사용되는 2% 포도당이 포함된 TSB를 포함하는 플레이트; (B) 포도상 구균 생물막 형성을 위한 핀이 있는 뚜껑.
핀에 형성된 생물막 세포는 세포 회수를 위한 신선한 배양 배지를 포함하는 96웰 플레이트에서 5분 동안 초음파 처리(Hielscher 초음파 기술)에 의해 제거되었습니다.
(사진 및 연구: ©de Oliveira et al., 2016)
4단계: 실행 가능성 평가
플레이트 및 배양 분리 생물막:
- 회수 매체를 연속으로 희석하고 한천에 플레이트하여 콜로니 형성 단위(CFU)를 열거합니다.
- MIC 평가:
MIC를 회수 매체에서 눈에 보이는 미생물 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 항균 농도로 결정합니다.
MIC Minimum Inhibitory Concentration: 마이크로타이터 플레이트의 예와 미세희석 결과의 해석.
(연구 및 이미지: ©Jaskiewicz et al. 2019)
설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질
Hielscher 초음파는 최고의 품질과 디자인 표준으로 잘 알려져 있습니다. 견고 함과 쉬운 작동으로 초음파기를 산업 시설에 원활하게 통합 할 수 있습니다. 거친 조건과 까다로운 환경은 Hielscher 초음파 발생기로 쉽게 처리 할 수 있습니다.
Hielscher 초음파는 ISO 인증 회사이며 최첨단 기술과 사용자 친화성을 갖춘 고성능 초음파에 특히 중점을 둡니다. 물론, Hielscher 초음파는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.
ASTM E2799 프로토콜에서 UIP400MTP이 생물막 분리에 어떻게 사용되는지 여기에서 읽어보십시오. – MBEC 분석을 사용하여 녹농균 생물막에 대한 소독 효능 테스트.
96웰 플레이트(96-well plate) 및 어세이 플레이트(assay plate)에서 시료 전처리 간소화 멀티웰 플레이트 초음파 발생기 사용 UIP400MTP
문헌 / 참고문헌
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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자주 묻는 질문
MIC 분석이란 무엇입니까?
최소 억제 농도(MIC) 분석은 미생물의 가시적 성장을 억제하는 데 필요한 항균제의 최저 농도를 결정하는 데 사용되는 표준화된 테스트입니다. 일반적으로 육수 미세 희석 또는 한천 희석 방법을 사용하여 수행되며, 미생물은 항균제의 연속 희석에 노출됩니다. MIC 분석은 항균 효능을 평가하고, 임상 치료를 안내하고, 플랑크톤 및 생물막 관련 미생물 모두의 내성 수준을 평가하는 데 중요합니다.
Biofilm-Based Minimum Inhibitory Concentration Assay와 MBIC Assay의 차이점은 무엇입니까?
생물막 기반 최소 억제 농도(MIC) 분석과 최소 생물막 억제 농도(MBIC) 분석은 관련이 있지만 목적과 방법론이 다릅니다.
생물막 기반 MIC 분석은 플랑크톤 박테리아가 아닌 생물막 관련 세포에 초점을 맞춰 눈에 보이는 생물막 성장 또는 생존력을 억제하는 데 필요한 항균제의 최저 농도를 평가합니다. 대조적으로, MBIC 분석은 미리 형성된 생물막을 처리하는 것이 아니라 생물막 형성을 방지하는 항균제의 능력을 구체적으로 측정합니다. 두 분석 모두 생물막 관련 박테리아를 다루지만, 생물막 기반 MIC 분석은 치료를 다루고 MBIC 분석은 예방을 강조하여 생물막에 대한 항균 효능을 연구하기 위한 보완 도구입니다.
MIC 분석에는 어떤 생물막이 사용됩니까?
미생물 생물막과 플랑크톤 세포는 모두 다양한 조건에서 항균 효능을 연구하기 위해 최소 억제 농도(MIC) 분석에 사용됩니다.
- 플랑크톤 세포:
플랑크톤 세포는 자유 부유 단일 미생물 세포로, 기존 MIC 분석의 표준 모델 역할을 합니다. 일반적인 미생물로는 대장균, 녹농균, 황색포도상구균, 칸디다 알비칸스 등이 있습니다. 이러한 분석은 자유 생체 세포의 성장을 억제하는 데 필요한 MIC를 측정하며 초기 항균 스크리닝에 중요합니다. - 생물막 관련 세포:
생물막 세포는 세포외 기질에 내장된 미생물로, 항균제에 대한 내성을 크게 증가시킵니다. 생물막 MIC 분석에는 종종 다음이 포함됩니다.- 그람 음성 박테리아: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae는 감염 및 산업 환경에서 생물막 형성으로 알려져 있습니다.
- 그람 양성 박테리아: 황색포도상구균(MRSA 포함), 표피포도상구균 및 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)는 일반적으로 기기 관련 감염과 관련이 있습니다.
- 곰팡이: 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 관련 종, 생물막 관련 곰팡이 감염에 중요합니다.
- 혼합 종 생물막: 이들은 때때로 만성 상처 또는 산업 생물 오염에서 발견되는 것과 같은 천연 다생물 생물막을 복제하는 데 사용됩니다.
플랑크톤 세포와 생물막 관련 세포에 대한 MIC 값을 비교함으로써 연구자들은 생물막의 향상된 저항성을 평가하고 이러한 보다 탄력적인 미생물 군집에 효과적인 물질을 식별할 수 있습니다.
MIC와 MBEC의 차이점은 무엇입니까?
최소 억제 농도(MIC)는 생물막 형성을 방지하는 데 필요한 항균제의 가장 낮은 농도인 반면, 최소 생물막 박멸 농도(MBEC)는 확립된 생물막을 근절하는 데 필요한 가장 낮은 농도입니다. MIC는 생물막 예방에 중점을 두는 반면 MBEC는 성숙한 생물막에 대한 치료 효능을 평가합니다.
MBEC 어세이에 일반적으로 사용되는 플레이트는 무엇입니까?
MBEC 분석에 일반적으로 사용되는 마이크로타이터 플레이트는 일반적으로 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌으로 만든 96웰 플레이트입니다. 이러한 물질은 생물막 형성에 적합한 표면을 제공하며 분석 중에 테스트한 항균제에 화학적으로 내성이 있습니다. 폴리스티렌 플레이트는 광학 투명도 때문에 널리 선호되며, 이는 분광 광도계 또는 형광 기반 측정과 같은 다운스트림 분석에 유리합니다. 이 플레이트의 설계에는 분리 가능한 페그 뚜껑이 포함되어 있으며, 이는 성장 매체가 포함된 웰에 잠긴 페그에 생물막이 형성되기 때문에 분석에 필수적입니다. MBEC 분석 프로토콜을 준수하는 플레이트와 같은 표준화된 플레이트는 UIP400MTP 초음파 발생기 또는 기타 처리 장비와의 재현성 및 호환성을 보장하도록 특별히 설계되었습니다.
PEG-뚜껑 플레이트란 무엇입니까?
PEG-lid 플레이트는 뚜껑에 각 웰로 확장되는 작은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 페그 또는 핀이 장착된 특수 멀티 웰 플레이트 시스템입니다. 이 못은 통제된 조건에서 미생물 생물막 형성을 위한 표면을 제공하여 실제 생물막 성장을 모방합니다. 이 설계는 웰에 성장 매체 또는 항균제가 포함되어 있는 동안 페그에서 생물막이 발달할 수 있도록 하여 MBEC, MBIC 및 MIC 분석과 같은 치료에 대한 생물막 감수성의 고처리량 테스트를 가능하게 합니다.
세포 스크래핑과 비교하여 초음파 생물막 박리의 장점은 무엇입니까?
초음파 생물막 제거는 표면에서 생물막을 제거하기 위한 비침습적이고 균일하며 매우 효율적인 방법을 제공하여 세포 긁기에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 일관성이 없고 기본 표면이나 세포를 손상시킬 수 있는 스크래핑과 달리 초음파는 생물막 매트릭스를 관통하여 인접한 구조의 무결성을 손상시키지 않고 분리합니다. 이 방법은 재현성을 보장하고 오염 위험을 최소화하며 미생물 연구 또는 의료 기기 테스트와 같이 정밀한 생물막 제거가 필요한 응용 분야에 특히 효과적입니다. UIP400MTP Sonicator가 셀 스크래핑을 능가하는 방법에 대해 자세히 알아보십시오!
