Isolamento delle cellule staminali con ultrasuoni
La sonicazione è un metodo meccanico altamente efficiente per isolare le cellule staminali dal tessuto adiposo umano. La frazione vascolare stromale (SVF) isolata con gli ultrasuoni dimostra un significativo potenziale rigenerativo per applicazioni mediche. Hielscher Ultrasonics offre una gamma di opzioni di sonicazione diretta e indiretta per la raccolta di cellule staminali. Trovate il sonicatore ideale per il vostro processo di isolamento delle cellule staminali!
Isolamento a ultrasuoni di cellule staminali
Il tessuto adiposo estratto dal corpo umano (tramite liposuzione) viene trattato con ultrasuoni per rimuovere il tessuto dalle cellule staminali e da altre cellule di crescita. Questa porzione di cellule separate è nota come cellule della frazione vascolare stromale (SVF).
La tecnica di isolamento a ultrasuoni delle cellule staminali dal tessuto adiposo si basa esclusivamente sul principio di funzionamento della cavitazione derivata dagli ultrasuoni, che è un taglio puramente meccanico. Queste forze di taglio cavitazionali disgregano il tessuto adiposo, in modo che le cellule staminali vengano rilasciate dalla struttura del tessuto adiposo. L'isolamento delle cellule staminali mediante ultrasuoni è una procedura priva di enzimi, che evita l'uso di collagenasi, tripsina o dispasi.
Per separare le cellule staminali estratte, le cellule staminali mesenchimali, i precursori endoteliali e altri tipi di cellule di crescita, il tessuto adiposo sonicato viene centrifugato.
Le cellule staminali separate vengono raccolte e analizzate per verificarne la qualità, tra cui la conta delle cellule, la vitalità, l'endotossina e la colorazione di Gram, prima di essere utilizzate immediatamente per il trapianto autologo o conservate in crioconservazione.
Perché evitare gli enzimi?
Poiché la digestione enzimatica per l'isolamento delle cellule staminali è accompagnata da costi elevati e possibili rischi per la sicurezza, oltre che da una scarsa efficacia [Oberbauer et al. 2015], si preferiscono metodi di isolamento non enzimatici come la cavitazione a ultrasuoni. La fase di isolamento a ultrasuoni sostituisce la digestione enzimatica separando meccanicamente le cellule e gli aggregati cellulari dal tessuto adiposo.
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Cellule staminali di derivazione adiposa
Resa delle cellule staminali ottenuta con la soniazione
Il metodo di isolamento della frazione vascolare stromale pubblicato, che utilizza la cavitazione ad ultrasuoni, produce una resa di 1,67-2,24 × 107 con una vitalità del 97,1-98,9% [Victor, S., 2014]. Rese cellulari di circa 2-4 milioni di cellule/grammo di tessuto adiposo sono state ottenute dalla lisi ultrasonica di adipociti maturi in tessuto adiposo dissociato [Bright et al., 2014].
Le cellule preparate con gli ultrasuoni possiedono un potenziale di differenziazione adipogenico e osteogenico altrettanto elevato rispetto a un metodo di isolamento enzimatico standard [Oberbauer et al. 2015].
Sistemi a ultrasuoni per l'isolamento delle cellule staminali
Per garantire la massima sicurezza e la migliore qualità, un'apparecchiatura a ultrasuoni affidabile, che consenta un controllo preciso del trattamento con cellule staminali, è un fattore chiave per il successo del trattamento dei pazienti. Hielscher Ultrasonics offre diverse opzioni per un processo di separazione autologa mediante cavitazione a ultrasuoni per isolare e raccogliere cellule staminali e precursori endoteliali.
Sonica diretta per l'isolamento delle cellule staminali
Per il processo di isolamento delle cellule staminali tramite sonicazione diretta, il corno a ultrasuoni (sonotrodo, punta/sonda a ultrasuoni) viene immerso nel tessuto adiposo. Attraverso il sonotrodo, le onde ultrasonore vengono accoppiate direttamente nel grasso autologo in modo che la cavitazione ultrasonica rilasci le cellule staminali e stromali dal tessuto residuo. Sonicatori Hielscher UP200Ht e UP200St con sonotrodo S26d14 sono sistemi comunemente utilizzati per il trattamento delle cellule staminali autologhe. L'isolamento della frazione vascolare stromale mediante sonicazione diretta è per lo più adatto all'uso in camere bianche.
Sonicazione indiretta per l'isolamento delle cellule staminali
Poiché le cellule staminali vengono utilizzate per applicazioni autologhe, la sterilità del processo è molto importante. Pertanto, Hielscher ha sviluppato diverse opzioni di sonicazione indiretta, come ad esempio GDmini2, VialTweeter e altri sistemi personalizzati. Con la sonicazione indiretta, le onde ultrasonore vengono accoppiate attraverso la parete del contenitore al tessuto adiposo. La frazione vascolare stromale (SVF) viene dissociata dal tessuto adiposo mediante cavitazione ultrasonica, come avviene durante la sonicazione diretta.
Un processo di sonicazione indiretta offre il vantaggio di processare le cellule in un recipiente chiuso sotto condizioni di assenza di contaminazione poiché viene eliminato il rischio di contaminazione incrociata dovuto all'inserimento del corno a ultrasuoni (sonotrodo). L'isolamento delle cellule avviene in un sistema chiuso che garantisce condizioni di processo sterili.
Per saperne di più sui Sonicatori sterili Hielscher!
I sonicatori digitali Hielscher possono essere controllati con precisione tramite display touch o browser. Le procedure di sonicazione possono essere preimpostate tramite un menu intuitivo. I dispositivi a ultrasuoni sono dotati di una registrazione automatica dei dati (tutti i dati del processo di sonicazione sono memorizzati su una scheda SD integrata). La potenza degli ultrasuoni può essere regolata esattamente in base al protocollo di isolamento cellulare.
Il sonicatore VialTweeter è un omogeneizzatore sterile per la preparazione uniforme e rapida di campioni sterili.
Letteratura/riferimenti
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration (2015) 4:7.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Haghjoo M., Azarbayjani M.A., Peeri M., Hosseini S.A. (2019): Effect of Training, Hyaluronic Acid, and Mesenchymal Stem Cell Therapies on Osteocalcin Gene Expression in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis. Gene Cell Tissue 6, 2019.
- Zhu M., Kong D., Tian R., Pang M. , Mo M., Cheng, Y., Yang G., Cheng H.L., Lei X., Fang K., Cheng B., Wu Y. (2020): Platelet sonicates activate hair follicle stem cells and mediate enhanced hair follicle regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24, 2020. 1786–1794.
Particolarità / Cose da sapere
Cosa sono le cellule staminali?
Le cellule staminali sono cellule indifferenziate di un organismo multicellulare che hanno la capacità di produrre indefinitamente altre cellule dello stesso tipo. Sono caratterizzate dal notevole potenziale di svilupparsi in molti tipi di cellule diverse nell'organismo durante lo stato iniziale della vita e della crescita. Le caratteristiche più distintive delle cellule staminali sono la capacità di rinnovarsi mediante divisione cellulare e la capacità di trasformarsi in cellule specifiche di un tessuto o di un organo con funzioni particolari. Le cellule staminali pluripotenti hanno il potenziale per differenziarsi in una qualsiasi delle tre cellule germinali: endoderma (rivestimento interno dello stomaco, tratto gastrointestinale, polmoni), mesoderma (muscoli, ossa, sangue, apparato urogenitale) o ectoderma (tessuti epidermici e sistema nervoso).
In alcuni organi, come l'intestino e il midollo osseo, le cellule staminali si dividono regolarmente per riparare e sostituire i tessuti usurati o danneggiati. In altri organi, come il pancreas e il cuore, le cellule staminali si dividono solo in condizioni particolari.
Le cellule stromali/staminali mesenchimali (MSC), che offrono un elevato potenziale per molteplici applicazioni terapeutiche nella medicina rigenerativa ed estetica, si trovano principalmente nel midollo osseo, ma possono essere isolate anche da altri tessuti (ad esempio cartilagine, grasso, cellule muscolari). Le cellule staminali mesenchimali sono considerate cellule staminali adulte prototipiche, caratterizzate dalla capacità di auto-rinnovamento.
La ricerca e i trattamenti sulle cellule staminali sono utilizzati per coltivare tessuti e organi a scopo di trapianto (ingegneria tissutale). Altri campi di applicazione medica delle cellule staminali sono il trattamento delle malattie cerebrali (ad esempio, il morbo di Parkinson e di Alzheimer), la terapia delle carenze cellulari, le malattie del sangue (ad esempio, la leucemia), la degenerazione delle articolazioni e della cartilagine (ad esempio, l'osteoartrite) e i trattamenti cosmetici (ad esempio, i trattamenti anti-invecchiamento). In generale, le cellule staminali hanno una dimensione di circa 15-25 micron di diametro.
cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule stromali multipotenti che hanno la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui osteoblasti (cellule ossee), condrociti (cellule cartilaginee), miociti (cellule muscolari) e adipociti (cellule grasse).
Che cos'è la frazione vascolare stromale (SVF)?
La frazione vascolare stromale (SVF) è un componente del lipoaspirato che può essere estratto tramite liposuzione dal tessuto adiposo del corpo umano. Il lipoaspirato consiste in una miscela eterogenea di cellule e presenta un elevato contenuto di cellule staminali, note come cellule staminali di derivazione adiposa (ASC o ADSC), che presentano analogie con le cellule staminali del midollo osseo, come la capacità di differenziarsi in cellule multilineari.
La popolazione eterogenea della frazione vascolare stromale comprende, tra gli altri, cellule endoteliali, eritrociti, fibroblasti, linfociti, monociti/macrofagi e periciti, oltre a una frazione importante di cellule staminali di derivazione adiposa.
Cosa sono le cellule stromali/staminali di derivazione adiposa (ASC)?
Le cellule stromali/staminali di derivazione adiposa (ASC / ADSC) rilasciano alti livelli di fattori di crescita bioattivi come il fattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), fattore di crescita dei cheratinociti (KGF), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), fattore di crescita degli epatociti (HGF), fattore di crescita trasformante-beta (TGF-β), fattore di crescita dell'insulina (IGF) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF). Le ACS non rilasciano solo fattori di crescita, ma secernono anche citochine, tra cui il ligando della tirosin-chinasi 3 legata al fms (Flt-3), il fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF), il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF), fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), interleuchine (IL) come IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 e IL-12, fattore inibitore della leucemia (LIF) e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α).
Come si estraggono le cellule staminali?
Le cellule staminali adulte autologhe dell'uomo possono essere estratte dalle seguenti fonti:
- Il midollo osseo, che richiede l'estrazione tramite prelievo, cioè la perforazione dell'osso.
- Tessuto adiposo (cellule lipidiche), che richiede l'estrazione mediante liposuzione.
- Sangue, che richiede l'estrazione attraverso l'aferesi, in cui il sangue del donatore passa attraverso una “dialisi” dove vengono estratte le cellule staminali, mentre gli altri componenti del sangue vengono restituiti al donatore.