Isolamento delle cellule staminali mediante ultrasuoni
La sonicazione è un metodo meccanico altamente efficiente per isolare le cellule staminali dal tessuto adiposo umano. La frazione stromale vascolare (SVF) isolata mediante ultrasuoni dimostra un significativo potenziale rigenerativo per le applicazioni mediche. Hielscher Ultrasonics offre una gamma di opzioni di sonicazione diretta e indiretta per il prelievo delle cellule staminali. Trova il sonicatore ideale per il tuo processo di isolamento delle cellule staminali!
Isolamento delle cellule staminali mediante ultrasuoni
Il tessuto adiposo estratto dal corpo umano mediante liposuzione viene trattato con ultrasuoni per separare il tessuto dalle cellule staminali e da altre cellule coinvolte nella crescita. Questa porzione di cellule separata è nota come cellule della frazione stromale vascolare (SVF).
La tecnica di isolamento delle cellule staminali dal tessuto adiposo mediante ultrasuoni si basa esclusivamente sul principio di funzionamento della cavitazione generata dagli ultrasuoni, che esercita un’azione di taglio puramente meccanica. Queste forze di taglio dovute alla cavitazione disgregano il tessuto adiposo, liberando le cellule staminali dalla sua struttura. L’isolamento delle cellule staminali mediante ultrasuoni è una procedura priva di enzimi, che evita l’uso di collagenasi, tripsina o dispasi.
Per separare le cellule staminali estratte, le cellule staminali mesenchimali, i precursori endoteliali e altri tipi di cellule coinvolte nella crescita, il tessuto adiposo sottoposto a sonicazione viene centrifugato.
Le cellule staminali separate vengono raccolte e analizzate per valutarne la qualità, verificando la conta cellulare, la vitalità, le endotossine e la colorazione di Gram, prima di essere utilizzate immediatamente per il trapianto autologo oppure conservate mediante crioconservazione.
Perché evitare gli enzimi?
Poiché la digestione enzimatica per l’isolamento delle cellule staminali comporta costi elevati e possibili rischi per la sicurezza, oltre a una scarsa efficacia [Oberbauer et al. 2015], si preferiscono metodi di isolamento non enzimatici, come la cavitazione ultrasonica. La fase di isolamento mediante ultrasuoni sostituisce la digestione enzimatica separando meccanicamente le cellule e gli aggregati cellulari dal tessuto adiposo.
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Cellule staminali derivate dal tessuto adiposo
Resa di cellule staminali ottenuta mediante sonicazione
Il metodo pubblicato per l’isolamento della frazione stromale vascolare mediante cavitazione ultrasonica consente di ottenere 1,67–2,24 × 107 cellule con una vitalità del 97,1–98,9% [Victor, S., 2014]. Rese cellulari di circa 2–4 milioni di cellule/grammo di tessuto adiposo sono state ottenute mediante lisi ultrasonica degli adipociti maturi nel tessuto adiposo dissociato [Bright et al., 2014].
Le cellule preparate mediante ultrasuoni possiedono un potenziale di differenziazione adipogenica e osteogenica altrettanto elevato rispetto a quello ottenuto con un metodo standard di isolamento enzimatico [Oberbauer et al. 2015].
Sistemi a ultrasuoni per l’isolamento delle cellule staminali
Per garantire la massima sicurezza e la migliore qualità, un’apparecchiatura a ultrasuoni affidabile, che consenta un controllo preciso del trattamento delle cellule staminali, è un fattore fondamentale per il successo del trattamento dei pazienti. Hielscher Ultrasonics offre diverse opzioni per un processo autologo di separazione mediante cavitazione ultrasonica, finalizzato all’isolamento e al prelievo di cellule staminali e precursori endoteliali.
Sonicazione diretta per l’isolamento delle cellule staminali
Nel processo di isolamento delle cellule staminali mediante sonicazione diretta, il corno ultrasonico (sonotrodo, punta / sonda a ultrasuoni) viene immerso nel tessuto adiposo. Attraverso il sonotrodo, le onde ultrasoniche vengono accoppiate direttamente al grasso autologo, in modo che la cavitazione ultrasonica liberi le cellule staminali e le cellule stromali dal tessuto residuo. I sonicatori Hielscher UP200Ht e UP200St con sonotrodo S26d14 sono sistemi comunemente utilizzati per il trattamento autologo delle cellule staminali. L’isolamento della frazione stromale vascolare mediante sonicazione diretta è particolarmente adatto all’impiego in strutture dotate di camere bianche.
Sonicazione indiretta per l’isolamento delle cellule staminali
Poiché le cellule staminali vengono utilizzate per applicazioni autologhe, la sterilità del processo è molto importante. Per questo motivo, Hielscher ha sviluppato diverse opzioni di sonicazione indiretta, come GDmini2, VialTweeter e altri sistemi personalizzati. Nella sonicazione indiretta, le onde ultrasoniche vengono accoppiate al tessuto adiposo attraverso la parete del contenitore. La frazione stromale vascolare (SVF) viene dissociata dal tessuto adiposo mediante cavitazione ultrasonica, come avviene nella sonicazione diretta.
Un processo di sonicazione indiretta offre il vantaggio di trattare le cellule in un recipiente chiuso in condizioni prive di contaminazione , poiché viene eliminato il rischio di contaminazione crociata dovuto all’inserimento del corno ultrasonico (sonotrodo). L’isolamento cellulare viene eseguito in un sistema chiuso che garantisce condizioni di processo sterili.
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I sonicatori digitali Hielscher possono essere controllati con precisione tramite display touch o browser. Le procedure di sonicazione possono essere preimpostate tramite il menu intuitivo. I dispositivi a ultrasuoni sono dotati di registrazione automatica dei dati (tutti i dati del processo di sonicazione vengono memorizzati su una scheda SD integrata). La potenza ultrasonica immessa può essere regolata con precisione in base al protocollo di isolamento cellulare.
Il sonicatore VialTweeter è un omogeneizzatore sterile per la preparazione sterile, uniforme e rapida dei campioni.
Bibliografia/Riferimenti
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration (2015) 4:7.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Haghjoo M., Azarbayjani M.A., Peeri M., Hosseini S.A. (2019): Effect of Training, Hyaluronic Acid, and Mesenchymal Stem Cell Therapies on Osteocalcin Gene Expression in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis. Gene Cell Tissue 6, 2019.
- Zhu M., Kong D., Tian R., Pang M. , Mo M., Cheng, Y., Yang G., Cheng H.L., Lei X., Fang K., Cheng B., Wu Y. (2020): Platelet sonicates activate hair follicle stem cells and mediate enhanced hair follicle regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24, 2020. 1786–1794.
Informazioni utili
Che cosa sono le cellule staminali?
Le cellule staminali sono cellule indifferenziate di un organismo pluricellulare, capaci di produrre indefinitamente altre cellule dello stesso tipo. Sono caratterizzate dal notevole potenziale di svilupparsi in molti tipi cellulari diversi nel corpo durante le prime fasi della vita e della crescita. Le caratteristiche più distintive delle cellule staminali sono la capacità di autorinnovarsi mediante divisione cellulare e la capacità di trasformarsi in cellule specifiche di un tessuto o di un organo, dotate di funzioni particolari. Le cellule staminali pluripotenti possono differenziarsi in ciascuno dei tre foglietti embrionali: endoderma (rivestimento interno dello stomaco, tratto gastrointestinale, polmoni), mesoderma (muscoli, ossa, sangue, apparato urogenitale) o ectoderma (tessuti epidermici e sistema nervoso).
In alcuni organi, come l’intestino e il midollo osseo, le cellule staminali si dividono regolarmente per riparare e sostituire i tessuti usurati o danneggiati. In altri organi, come il pancreas e il cuore, le cellule staminali si dividono soltanto in condizioni particolari.
Le cellule stromali/staminali mesenchimali (MSC), che offrono un elevato potenziale per molteplici applicazioni terapeutiche nella medicina rigenerativa ed estetica, si trovano principalmente nel midollo osseo, ma possono essere isolate anche da altri tessuti (ad esempio cartilagine, grasso e cellule muscolari). Le cellule staminali mesenchimali sono considerate cellule staminali adulte prototipiche, caratterizzate dalla capacità di autorinnovamento.
La ricerca e i trattamenti con cellule staminali vengono utilizzati per coltivare tessuti e organi destinati al trapianto (ingegneria tissutale). Altri ambiti medici di applicazione delle cellule staminali comprendono il trattamento delle malattie cerebrali (ad esempio il morbo di Parkinson e la malattia di Alzheimer), la terapia delle carenze cellulari, le malattie del sangue (ad esempio la leucemia), la degenerazione delle articolazioni e della cartilagine (ad esempio l’osteoartrosi), nonché i trattamenti estetici (ad esempio i trattamenti antietà). In generale, le cellule staminali hanno un diametro di circa 15–25 micron.
Cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule stromali multipotenti, capaci di differenziarsi in vari tipi cellulari, tra cui osteoblasti (cellule ossee), condrociti (cellule cartilaginee), miociti (cellule muscolari) e adipociti (cellule adipose).
Che cos’è la frazione stromale vascolare (SVF)?
La frazione stromale vascolare (SVF) è un componente del lipoaspirato, che può essere estratto mediante liposuzione dal tessuto adiposo del corpo umano. Il lipoaspirato è costituito da una miscela eterogenea di cellule e presenta un elevato contenuto di cellule staminali, note come cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC o ADSC), che mostrano somiglianze con le cellule staminali del midollo osseo, come la capacità di differenziarsi in cellule di diverse linee cellulari.
La popolazione eterogenea della frazione stromale vascolare comprende, tra le altre, cellule endoteliali, eritrociti, fibroblasti, linfociti, monociti/macrofagi e periciti, oltre a una frazione importante di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo.
Che cosa sono le cellule stromali/staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC)?
Le cellule stromali/staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC / ADSC) rilasciano livelli elevati di fattori di crescita bioattivi, come il fattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), il fattore di crescita dei fibroblasti basico (bFGF), il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF), il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), il fattore di crescita degli epatociti (HGF), il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β), il fattore di crescita insulinico (IGF) e il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF). Le ACS non rilasciano soltanto fattori di crescita, ma secernono anche citochine, tra cui il ligando della tirosin-chinasi 3 correlata a fms (Flt-3), il fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF), il fattore stimolante le colonie di granulociti e macrofagi (GM-CSF), il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), interleuchine (IL) come IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 e IL-12, il fattore inibitorio della leucemia (LIF) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α).
Come vengono estratte le cellule staminali?
Le cellule staminali adulte autologhe umane possono essere estratte dalle seguenti fonti:
- Midollo osseo, che richiede l’estrazione mediante prelievo, ossia perforando l’osso.
- Tessuto adiposo (cellule lipidiche), che richiede l’estrazione mediante liposuzione.
- Sangue, che richiede l’estrazione mediante aferesi: il sangue del donatore passa attraverso una macchina per la “dialisi”, nella quale vengono estratte le cellule staminali, mentre gli altri componenti del sangue vengono restituiti al donatore.