Sonicazione in micropiastra nella proteomica shotgun – Nota applicativa

La proteomica shotgun dipende da una preparazione dei campioni efficiente e riproducibile per convertire materiale biologico complesso in peptidi pronti per l’analisi LC-MS/MS. Il sonicatore per micropiastre UIP400MTP supporta questo processo consentendo la sonicazione standardizzata e parallela di campioni di piccolo volume, aiutando i laboratori a migliorare la disgregazione, l’estrazione e la risolubilizzazione nei flussi di lavoro basati su micropiastre. Questa nota applicativa descrive come UIP400MTP possa essere integrato nella preparazione dei campioni per la proteomica, utilizzando come esempio verificato in laboratorio un flusso di lavoro pubblicato sulle vescicole extracellulari tratto da studi su PLA2G12A/Th17.

Sonicazione in micropiastra per una proteomica shotgun più riproducibile

Per i ricercatori nel campo della proteomica, una preparazione riproducibile dei campioni è fondamentale per ottenere dati LC-MS/MS di alta qualità. Il sonicatore per micropiastre UIP400MTP supporta la sonicazione standardizzata e parallela nei flussi di lavoro basati su piastre e in quelli con piccoli volumi ed elevata capacità di trattamento dei campioni.

È particolarmente utile per i laboratori che lavorano con:

• Grandi serie di campioni che richiedono un trattamento uniforme in numerosi pozzetti
• Materiale disponibile in quantità limitata, per il quale occorre ridurre al minimo la perdita di campione e la variabilità
• Campioni ricchi di lipidi, come le vescicole extracellulari
• Preparazioni biologiche complesse che richiedono una disgregazione, un’estrazione o una risolubilizzazione efficienti
• Proteomica shotgun comparativa, per la quale è essenziale la riproducibilità tra condizioni e replicati

Integrando la sonicazione in micropiastra prima della digestione, i ricercatori possono migliorare la preparazione dei campioni per:

• Estrazione e risolubilizzazione delle proteine
• Digestione con tripsina/Lys-C
• Acquisizione nano-LC/MS/MS
• Analisi proteomica quantitativa a valle

La sonicazione in micropiastra può offrire vantaggi a:

• Strutture centralizzate di servizi per la proteomica
• Laboratori di ricerca sulle EV
• Laboratori di immunologia e biologia cellulare
• Gruppi di ricerca traslazionale
• Gruppi di scienze della vita che passano dalla preparazione di singoli campioni a flussi di lavoro con una maggiore capacità di trattamento dei campioni

Preparazione dei campioni con elevata capacità di trattamento per l’analisi del proteoma delle vescicole extracellulari

Che cos’è la proteomica shotgun?

La proteomica shotgun è diventata una strategia analitica centrale per caratterizzare campioni biologici complessi, dai lisati cellulari totali e dagli estratti tissutali agli organelli purificati, alle vescicole extracellulari e ai campioni clinici disponibili in quantità ridotta. Il suo principale punto di forza risiede nell’abbinamento della digestione proteica, della cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione e dell’inferenza computazionale delle proteine a partire dai peptidi. Tuttavia, la qualità dell’insieme finale di dati sul proteoma viene determinata molto prima che il campione raggiunga lo spettrometro di massa. Una disgregazione efficiente del campione, la solubilizzazione delle proteine, la rimozione delle sostanze interferenti, una digestione enzimatica riproducibile e un recupero affidabile dei peptidi sono tutti fattori decisivi per la profondità di copertura e l’affidabilità quantitativa.
Per i ricercatori nel campo della proteomica e i laboratori di scienze della vita che lavorano con campioni limitati o preziosi, la preparazione dei campioni rappresenta spesso il collo di bottiglia.

La sfida delle vescicole extracellulari nella proteomica

Le vescicole extracellulari (EV), ad esempio, rappresentano una classe di campioni particolarmente impegnativa. Sono particelle di dimensioni nanometriche delimitate da una membrana e ricche di lipidi, con una resa proteica relativamente bassa e un’elevata possibilità di trascinamento di lipidi, sali, detergenti, proteine sieriche e altri componenti della matrice. Queste caratteristiche possono interferire con l’efficienza della digestione, le prestazioni cromatografiche, la stabilità dell’elettrospray e l’identificazione dei peptidi. Un flusso di lavoro di preparazione per la proteomica delle EV deve quindi essere sufficientemente efficace da disgregare le strutture vescicolari e solubilizzare il contenuto proteico, mantenendo al contempo la compatibilità con la successiva digestione enzimatica e l’analisi LC-MS/MS.
In questo contesto, il trattamento a ultrasuoni compatibile con le micropiastre offre un approccio pratico per trattare i campioni in modo riproducibile e parallelo. I modelli di sonicatore per micropiastre Hielscher UIP400MTP (400 W) e UIP550MTP (550 W) sono progettati per la sonicazione di campioni in piastre multipozzetto e recipienti di piccolo volume, supportando flussi di lavoro con una maggiore capacità di trattamento dei campioni rispetto ai sonicatori convenzionali a sonda singola. Per i laboratori di proteomica, questo formato è interessante perché può ridurre la variabilità dovuta alle operazioni manuali, migliorare il trattamento parallelo di più campioni e integrarsi più naturalmente nei flussi di preparazione dei campioni basati su piastre.

Esempio di flusso di lavoro

Un recente flusso di lavoro di proteomica delle vescicole extracellulari nell’ambito della biologia delle cellule Th17 regolata da PLA2G12A offre un utile esempio, verificato in laboratorio, di come il sonicatore per micropiastre UIP400MTP possa essere incorporato nella preparazione dei campioni per la proteomica shotgun. In quella serie di studi, i campioni di EV sono stati trattati per l’analisi del proteoma mediante trattamento con metanolo, sonicazione con UIP400MTP, centrifugazione, essiccazione, digestione con tripsina/Lys-C e LC a nano-flusso accoppiata a MS tandem ad alta risoluzione. Il lavoro biologico è stato pubblicato nel 2026 da Mochizuki-Ono e colleghi; l’analisi proteomica ha contribuito a caratterizzare il modo in cui PLA2G12A altera le proteine contenute nelle EV nel contesto delle risposte patogene delle cellule T.

Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP

Perché la sonicazione in micropiastra?
L’UIP400MTP consente la sonicazione standardizzata e parallela di campioni di piccolo volume. Questo è utile quando sono importanti la riproducibilità, la ridotta quantità iniziale di campione e la capacità di trattamento di più campioni.


Lista di controllo per il controllo qualità

• Verificare che la quantità iniziale di EV equivalente in proteine sia uguale per tutti i campioni.
• Utilizzare disposizioni randomizzate o bilanciate per il trattamento dei campioni.
• Mantenere uniformi il volume di metanolo, il tempo di sonicazione, il tempo di essiccazione e il volume di digestione.
• Monitorare la resa peptidica e il numero totale di proteine identificate.
• Controllare il tasso di siti di taglio mancati e la distribuzione della lunghezza dei peptidi.
• Esaminare la forma dei picchi cromatografici e la riproducibilità dei tempi di ritenzione.
• Includere campioni bianchi per monitorare il trascinamento.
• Utilizzare campioni QC ottenuti riunendo aliquote dei campioni per gli studi più ampi.
• Valutare il coefficiente di variazione dei replicati.
• Utilizzare la PCA o metodi analoghi per identificare effetti di lotto o campioni anomali.

Raccomandazioni per la registrazione dei dati

Quando si pubblica o si documenta questo flusso di lavoro, riportare la quantità iniziale di EV, il formato della piastra, il volume di metanolo, l’ampiezza e il tempo di sonicazione dell’UIP400MTP, le condizioni di centrifugazione, il metodo di essiccazione, il tampone di digestione, la concentrazione enzimatica, il tempo di digestione, le condizioni di acidificazione, la piattaforma LC-MS/MS, la modalità di acquisizione, la versione del software, la banca dati, la soglia FDR, il metodo di normalizzazione e il flusso di lavoro statistico.
Tutti i sonicatori per micropiastre Hielscher registrano automaticamente importanti parametri di processo, quali ampiezza, durata della sonicazione e temperatura, con indicazione di data e ora, sotto forma di file CVS sulla scheda SD integrata. La registrazione dei dati per la riproducibilità e il controllo qualità non è mai stata così facile!

Lo studio nel dettaglio: proteomica shotgun delle EV nello studio su PLA2G12A

Lo studio su PLA2G12A fornisce un esempio concreto dell’utilizzo dell’UIP400MTP in un flusso di lavoro di proteomica shotgun. La domanda biologica riguardava il modo in cui la fosfolipasi secreta PLA2G12A modifica le vescicole extracellulari derivate dalle cellule Th17 e influenza così la differenziazione delle cellule T patogene. Gli autori hanno dimostrato che PLA2G12A agisce sulle membrane delle EV producendo lisofosfolipidi, tra cui la 1-oleoil-lisofosfatidiletanolammina, e che la segnalazione a valle dell’acido lisofosfatidico tramite LPA2 contribuisce alla differenziazione Th17. Oltre alla segnalazione lipidica, gli studi hanno esaminato anche il contenuto delle EV, inclusi RNA e proteine, rendendo la proteomica shotgun una componente importante della strategia di caratterizzazione.
Nel flusso di lavoro di preparazione delle EV, le cellule Th17 sono state coltivate in un terreno contenente siero fetale bovino depleto di esosomi. I surnatanti di coltura sono stati dapprima centrifugati per rimuovere le cellule, filtrati attraverso un filtro da 0,22 µm, concentrati mediante ultrafiltrazione/ultracentrifugazione, lavati, risospesi in PBS e quantificati mediante saggio proteico BCA. Questa preparazione delle EV a monte ha garantito che una quantità definita di materiale di EV equivalente in proteine potesse essere introdotta nel flusso di lavoro proteomico.
Per l’analisi proteomica shotgun, gli autori hanno utilizzato campioni di EV corrispondenti a 5 µg di equivalenti proteici. Questi campioni sono stati essiccati in provette PCR ed è stato aggiunto metanolo per un volume di 25 µL. I campioni sono stati quindi sottoposti a sonicazione per 3 minuti utilizzando il sonicatore per micropiastre UIP400MTP. Dopo la sonicazione, i campioni sono stati centrifugati a 4°C per 20 minuti a 19.000 × g. Dopo la rimozione di 20 µL di surnatante, i campioni sono stati centrifugati fino a completa essiccazione. Le proteine sono state quindi sciolte mediante sonicazione in 4 µL di soluzione di tripsina/Lys-C a 100 ng/µL in bicarbonato di ammonio 50 mM. La digestione è stata eseguita per 2 ore a 37°C con agitazione a 300 rpm. Il digestato è stato acidificato con 1 µL di acido trifluoroacetico all’1,25% e sottoposto a LC a nano-flusso accoppiata alla spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione.
Questo flusso di lavoro evidenzia diversi principi utili per la proteomica delle EV disponibili in quantità ridotta. In primo luogo, la quantità iniziale è stata normalizzata in base all’equivalente proteico, un aspetto importante quando si confrontano EV provenienti da genotipi o trattamenti diversi. In secondo luogo, il metanolo è stato utilizzato prima della sonicazione, favorendo la disgregazione e l’estrazione ed evitando sistemi a base di detergenti che potrebbero complicare l’analisi LC-MS/MS. In terzo luogo, la fase di sonicazione è stata breve e standardizzata, quindi compatibile con il trattamento parallelo dei campioni. In quarto luogo, la digestione con tripsina/Lys-C è stata eseguita in un volume molto piccolo, riducendo la diluizione e favorendo il recupero dei peptidi da quantità iniziali ridotte. Infine, il passaggio diretto dalla digestione all’acidificazione e all’analisi LC-MS/MS ha ridotto al minimo le manipolazioni non necessarie.
Il metodo LC-MS/MS a valle ha utilizzato una separazione a fase inversa e nano-flusso accoppiata a uno spettrometro di massa Q-Exactive HF Orbitrap. I campioni sono stati intrappolati su una precolonna C18, quindi separati su una colonna analitica con diametro interno di 50 µm a 200 nL/min e 40°C. Il gradiente è passato da un basso contenuto di solvente organico al 35% di solvente B nell’arco di 60 minuti, seguito da un lavaggio ad alto contenuto organico e dalla riequilibrazione. L’acquisizione MS è stata eseguita in modalità a ioni positivi mediante acquisizione indipendente dai dati con dissociazione collisionale ad alta energia. I file grezzi DIA sono stati analizzati utilizzando DIA-NN 1.8 con una libreria spettrale predetta in silico.