Sonificazione su micropiastra nella proteomica shotgun – Nota applicativa

La proteomica Shotgun si basa su una preparazione dei campioni efficiente e riproducibile, volta a convertire materiale biologico complesso in peptidi pronti per l’analisi LC-MS/MS. Il sonicatore per micropiastre UIP400MTP supporta questo processo consentendo la sonicazione standardizzata e parallela di campioni di piccolo volume, aiutando i laboratori a migliorare la disgregazione, l’estrazione e la risolubilizzazione nei flussi di lavoro basati su micropiastre. La presente nota applicativa descrive come l’UIP400MTP possa essere integrato nella preparazione dei campioni proteomici, utilizzando come esempio testato in laboratorio un flusso di lavoro relativo alle vescicole extracellulari, già pubblicato nell’ambito degli studi su PLA2G12A/Th17.

Sonificazione su micropiastra per una proteomica shotgun più riproducibile

Per i ricercatori nel campo della proteomica, una preparazione dei campioni riproducibile è fondamentale per ottenere dati LC-MS/MS di alta qualità. Il sonicatore per micropiastre UIP400MTP consente una sonicazione standardizzata e parallela in flussi di lavoro basati su piastre e a piccolo volume/alta produttività.

È particolarmente utile per i laboratori che si occupano di:

• Insiemi di campioni di grandi dimensioni che richiedono un trattamento uniforme in numerosi pozzetti
• Materiale con quantità limitata, in cui è necessario ridurre al minimo la perdita di campione e la variabilità
• Campioni ricchi di lipidi, come le vescicole extracellulari
• Preparati biologici complessi che richiedono un’efficace disgregazione, estrazione o risolubilizzazione
• Proteomica comparativa di tipo “shotgun”, in cui la riproducibilità tra le diverse condizioni e le repliche è fondamentale

Integrando la sonicazione delle micropiastre prima della digestione, i ricercatori possono migliorare la preparazione dei campioni per:

• Estrazione e risolubilizzazione delle proteine
• Digestione con tripsina/Lys-C
• Acquisizione Nano-LC/MS/MS
• Analisi proteomica quantitativa a valle

 

Adatta la preparazione dei campioni per la proteomica in tutta sicurezza!
Scopri come la sonicazione su micropiastra contribuisca a ridurre la variabilità legata alle operazioni manuali, a migliorare la disgregazione dei campioni e a preparare campioni biologici complessi per analisi LC-MS/MS affidabili.

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La sonicazione su micropiastra può offrire i seguenti vantaggi:

• Strutture centrali di proteomica
• Laboratori di ricerca sui veicoli elettrici
• Laboratori di immunologia e biologia cellulare
• Gruppi di ricerca traslazionale
• Team del settore delle scienze della vita che passano dalla preparazione di singoli campioni a flussi di lavoro ad alta produttività

Preparazione di campioni ad alta produttività per l'analisi del proteoma delle vescicole extracellulari

Che cos’è la proteomica Shotgun?

La proteomica shotgun è diventata una strategia analitica fondamentale per la caratterizzazione di campioni biologici complessi, dai lisati cellulari totali e dagli estratti tissutali agli organelli purificati, alle vescicole extracellulari e ai campioni clinici a basso contenuto. Il suo punto di forza principale risiede nell’integrazione tra digestione proteica, cromatografia liquida ad alta risoluzione accoppiata alla spettrometria di massa tandem e inferenza computazionale da peptidi a proteine. Tuttavia, la qualità del set di dati proteomici finale viene determinata molto prima che il campione raggiunga lo spettrometro di massa. La disgregazione efficiente del campione, la solubilizzazione delle proteine, la rimozione delle sostanze interferenti, la digestione enzimatica riproducibile e il recupero robusto dei peptidi sono tutti fattori decisivi per la profondità di copertura e l’affidabilità quantitativa.
Per i ricercatori nel campo della proteomica e per i laboratori di scienze della vita che lavorano con campioni limitati o preziosi, la preparazione dei campioni rappresenta spesso il collo di bottiglia.

La sfida delle vescicole extracellulari nella proteomica

Le vescicole extracellulari (EV), ad esempio, rappresentano una classe di campioni particolarmente complessa. Si tratta di particelle su scala nanometrica, circondate da una membrana e ricche di lipidi, caratterizzate da una resa proteica relativamente bassa e da un elevato potenziale di contaminazione da lipidi, sali, detergenti, proteine sieriche e altri componenti della matrice. Queste caratteristiche possono interferire con l’efficienza della digestione, le prestazioni cromatografiche, la stabilità nell’elettrospray e l’identificazione dei peptidi. Un flusso di lavoro di preparazione per la proteomica delle EV deve quindi essere sufficientemente efficace da rompere le strutture delle vescicole e solubilizzare il carico proteico, pur rimanendo compatibile con la digestione enzimatica a valle e l’analisi LC-MS/MS.
In questo contesto, la sonicazione compatibile con le micropiastre offre un approccio pratico per il trattamento riproducibile e parallelizzato dei campioni. I modelli di sonicatori per micropiastre Hielscher UIP400MTP (400 W) e UIP550MTP (550 W) sono progettati per la sonicazione di campioni in piastre multipozzetto e recipienti di piccolo volume, supportando flussi di lavoro a più alta produttività rispetto ai sonicatori convenzionali a sonda singola. Per i laboratori di proteomica, questo formato è interessante perché consente di ridurre la variabilità dovuta all’intervento manuale, migliorare il trattamento in parallelo di più campioni e integrarsi in modo più naturale nelle linee di preparazione dei campioni basate su piastre.

Flusso di lavoro esemplare

Un recente flusso di lavoro di proteomica delle vescicole extracellulari nell’ambito della biologia delle cellule Th17 indotte da PLA2G12A fornisce un esempio utile e verificato in laboratorio di come il sonicatore per micropiastre UIP400MTP possa essere integrato nella preparazione dei campioni per la proteomica shotgun. In quella serie di studi, i campioni di EV sono stati trattati per l’analisi del proteoma mediante trattamento con metanolo, sonicazione con UIP400MTP, centrifugazione, essiccazione, digestione con tripsina/Lys-C e LC a nanoflusso con MS tandem ad alta risoluzione. Lo stesso lavoro biologico è stato inizialmente riportato come preprint su bioRxiv e successivamente pubblicato su *Cell Reports*, dove l’analisi proteomica ha contribuito a caratterizzare il modo in cui PLA2G12A altera le proteine del carico delle EV nel contesto delle risposte patogene delle cellule T.

Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP

Perché la sonicazione su micropiastra?
L'UIP400MTP consente la sonicazione standardizzata e parallela di campioni di piccolo volume. Ciò risulta utile quando sono fondamentali la riproducibilità, l'utilizzo di piccole quantità di campione e l'elaborazione di più campioni contemporaneamente.

Lista di controllo per il controllo qualità

• Verificare che la quantità di proteina EV equivalente sia la stessa in tutti i campioni.
• Utilizzare schemi di elaborazione dei campioni randomizzati o bilanciati.
• Mantenere costanti il volume di metanolo, il tempo di sonicazione, il tempo di essiccazione e il volume di digestione.
• Monitorare la resa dei peptidi e il numero totale di proteine identificate.
• Verificare il tasso di scissione mancata e la distribuzione della lunghezza dei peptidi.
• Verificare la forma dei picchi cromatografici e la riproducibilità dei tempi di ritenzione.
• Inserire spazi vuoti per monitorare il trascinamento.
• Per studi su larga scala, utilizzare campioni di controllo qualità raggruppati.
• Valutare il coefficiente di variazione delle repliche.
• Utilizzare la PCA o metodi affini per individuare effetti di lotto o campioni anomali.

Raccomandazioni relative alla redazione dei verbali

Quando si pubblica o si documenta questo flusso di lavoro, indicare la quantità di EV in ingresso, il formato della piastra, il volume di metanolo, l’ampiezza e il tempo di sonicazione dell’UIP400MTP, le condizioni di centrifugazione, il metodo di essiccazione, il tampone di digestione, la concentrazione enzimatica, il tempo di digestione, le condizioni di acidificazione, piattaforma LC-MS/MS, la modalità di acquisizione, la versione del software, il database, la soglia FDR, il metodo di normalizzazione e il flusso di lavoro statistico.
Tutti i sonicatori per micropiastre Hielscher registrano automaticamente i parametri di processo più importanti, quali l'ampiezza, la durata della sonicazione e la temperatura, con indicazione di data e ora, in un file CSV salvato sulla scheda SD integrata. La registrazione dei dati ai fini della riproducibilità e del controllo di qualità non è mai stata così semplice!

L'analisi approfondita: proteomica EV Shotgun nello studio su PLA2G12A

Lo studio su PLA2G12A fornisce un esempio concreto dell’utilizzo di UIP400MTP in un flusso di lavoro di proteomica shotgun. La domanda biologica era: in che modo la fosfolipasi secreta PLA2G12A modifica le vescicole extracellulari derivate dalle cellule Th17 e, di conseguenza, influenza la differenziazione delle cellule T patogene? Gli autori hanno dimostrato che la PLA2G12A agisce sulle membrane delle vescicole extracellulari (EV) producendo lisofosfolipidi, tra cui l’1-oleoil-lisofosfatidiletanolamina, e che la segnalazione a valle dell’acido lisofosfatidico tramite LPA2 contribuisce alla differenziazione delle cellule Th17. Oltre alla segnalazione lipidica, gli studi hanno esaminato anche il carico delle EV, compreso il contenuto di RNA e proteine, rendendo la proteomica shotgun una componente importante della strategia di caratterizzazione.
Nel flusso di lavoro per la preparazione degli EV, le cellule Th17 sono state coltivate in un terreno di coltura contenente siero fetale bovino privo di esosomi. I supernatanti di coltura sono stati prima centrifugati per rimuovere le cellule, filtrati attraverso un filtro da 0,22 µm, concentrati mediante ultrafiltrazione/ultracentrifugazione, lavati, risospesi in PBS e quantificati mediante saggio proteico BCA. Questa preparazione preliminare delle EV ha garantito che una quantità definita, equivalente in termini proteici, di materiale EV potesse essere trasferita nel flusso di lavoro proteomico.
Per l’analisi proteomica shotgun, gli autori hanno utilizzato campioni di EV corrispondenti a 5 µg di proteine equivalenti. Questi campioni sono stati essiccati in provette da PCR, alle quali sono stati aggiunti 25 µL di metanolo. I campioni sono stati quindi sottoposti a sonicazione per 3 minuti utilizzando il sonicatore per micropiastre UIP400MTP. Dopo la sonicazione, i campioni sono stati centrifugati a 4 °C per 20 minuti a 19.000 × g. Dopo aver rimosso 20 µL di surnatante, i campioni sono stati centrifugati fino a completa essiccazione. Le proteine sono state quindi disciolte mediante sonicazione in 4 µL di soluzione di tripsina/Lys-C a 100 ng/µL in bicarbonato di ammonio 50 mM. La digestione è stata effettuata per 2 ore a 37 °C con agitazione a 300 rpm. Il prodotto della digestione è stato acidificato con 1 µL di acido trifluoroacetico all’1,25% e sottoposto a LC a nanoflusso con spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione.
Questo flusso di lavoro mette in evidenza diversi principi utili per la proteomica delle EV con basso input. Innanzitutto, l’input è stato normalizzato in base all’equivalente proteico, aspetto importante quando si confrontano EV provenienti da genotipi o trattamenti diversi. In secondo luogo, è stato utilizzato il metanolo prima della sonicazione, favorendo la disgregazione e l’estrazione ed evitando al contempo l’uso di sistemi detergenti che potrebbero complicare l’analisi LC-MS/MS. In terzo luogo, la fase di sonicazione è stata breve e standardizzata, il che è compatibile con l’elaborazione parallela dei campioni. In quarto luogo, la digestione con tripsina/Lys-C è stata eseguita in un volume molto ridotto, riducendo la diluizione e favorendo il recupero dei peptidi a basso input. Infine, il passaggio diretto dalla digestione all’acidificazione e all’LC-MS/MS ha ridotto al minimo le fasi di manipolazione non necessarie.
Il metodo LC-MS/MS a valle ha utilizzato una separazione in fase inversa a nanoflusso accoppiata a uno spettrometro di massa Q-Exactive HF Orbitrap. I campioni sono stati intrappolati su una precolonna C18, quindi separati su una colonna analitica con diametro interno di 50 µm a 200 nL/min e 40 °C. Il gradiente è passato da un basso contenuto di solvente organico al 35% di solvente B nell’arco di 60 minuti, seguito da un lavaggio con alto contenuto di solvente organico e da un riequilibrio. L’acquisizione MS è stata eseguita in modalità a ioni positivi utilizzando l’acquisizione indipendente dai dati con dissociazione collisiva ad alta energia. I file grezzi DIA sono stati analizzati utilizzando DIA-NN 1.8 con una libreria spettrale predetta in silico.