La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) è un metodo efficiente per infettare le cellule vegetali con geni estranei utilizzando Agrobacterium come trasportatore. La cavitazione a ultrasuoni provoca la sonoporazione, che può essere descritta come una microferita mirata del tessuto vegetale. Attraverso queste microferite create dagli ultrasuoni, il DNA e i vettori di DNA possono essere trasportati in modo efficiente nella matrice cellulare.

sonoporazione – Trasformazione cellulare potenziata dagli ultrasuoni

Quando gli ultrasuoni a bassa frequenza (circa 20kHz) vengono applicati alle sospensioni cellulari, gli effetti della cavitazione acustica provocano una permeabilizzazione transitoria della membrana sui tessuti cellulari. Questo effetto ultrasonico è noto come sonoporazione e viene utilizzato per il trasferimento di geni in cellule o tessuti.
I vantaggi dell'ultrasonorizzazione si basano sul suo principio di funzionamento meccanico non termico, che rende la sonicazione spesso più versatile e meno dipendente dai tipi di cellule. L'applicazione versatile della sonicazione apre la possibilità di utilizzare piante transgeniche, che hanno un potenziale significativo nella bioproduzione di proteine terapeutiche umane complesse. Questi bioreattori a base vegetale possono essere facilmente manipolati geneticamente, evitano la potenziale contaminazione con agenti patogeni umani, non danneggiano i batteri che mediano la trasformazione (ad esempio Agrobacterium) e rappresentano un metodo di biosintesi economico ed efficace.

Trasformazione cellulare assistita dagli ultrasuoni

La sonicazione è una tecnica che applica onde ultrasoniche a bassa frequenza per agitare le particelle in soluzione, per mescolare le soluzioni, aumentando così la velocità di trasferimento di massa e di dissoluzione. Contemporaneamente, la sonicazione può rimuovere i gas disciolti dai liquidi. Nella trasformazione delle piante, la sonicazione provoca la formazione di microferite sui tessuti vegetali e favorisce l'invio di DNA nudo nel protoplasto della pianta.

Per la trasformazione genetica, la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) è il metodo preferito e ha un'efficienza significativamente superiore rispetto alla sonicazione utilizzata per trasferire DNA nudo e vettori di DNA direttamente nel protoplasto. Numerosi studi hanno dimostrato che la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) può essere utilizzata per indurre la rottura meccanica e la formazione di ferite sulle cellule vegetali mediante onde ultrasoniche e la conseguente cavitazione acustica. Un breve trattamento a ultrasuoni crea microferite sulla superficie degli espianti. Le cellule ferite permetteranno la penetrazione dell'Agrobacterium nella parte più profonda dei tessuti vegetali, aumentando così la probabilità di infettare le cellule vegetali. Inoltre, i composti fenolici secreti migliorano la trasformazione. Le microferite generate dagli ultrasuoni rendono anche più fattibile la penetrazione dell'espianto da parte dei batteri. Il SAAT è stato utilizzato con successo per la trasformazione genetica di specie vegetali considerate particolarmente resistenti all'Agrobacterium.
La semplicità e l'economicità del metodo e il significativo miglioramento del trasferimento genico mediato da Agrobacterium sono i principali vantaggi del SAAT. Oltre all'applicazione di successo del SAAT nella trasformazione di Chenopodium rubrum L. e Beta vulgaris L., questo approccio è stato applicato anche nella produzione di olotossina ricombinante di Escherichia coli wild-type termolabile e di adiuvanti vaccinali LT mutanti di Escherichia coli in Nicotiana tabacum, in cui sono stati rilevati i più alti titoli sistemici di IgG specifiche per LT-B negli uccelli.
(cfr. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka e R. Baranski, 2014)

Procedura generale per il trasferimento genico tramite sonoporazione in cellule vegetali

1. Preparazione del materiale genetico: Iniziate a preparare il materiale genetico che volete introdurre nelle cellule vegetali. Potrebbe trattarsi di DNA plasmidico, RNA o altri acidi nucleici.
2. Isolamento di cellule vegetali: Isolare le cellule vegetali che si desidera colpire. A seconda dell'esperimento, queste cellule possono essere isolate da tessuti o colture vegetali.
3. Sospensione cellulare: Sospendere le cellule vegetali in un mezzo o in un tampone adatto. Questa operazione è essenziale per garantire che le cellule siano sane e in uno stato favorevole all'assorbimento del gene.
4. Impostare il Sonicator: Preparare il sonicatore a sonda impostando i parametri di sonicazione come ampiezza, tempo, energia e temperatura. Immergere la sonda a ultrasuoni nella sospensione cellulare.
5. Sonicazione: Avviare la procedura di sonicazione. La rapida oscillazione della punta della sonda genera bolle di cavitazione nel liquido. Queste bolle si espandono e collassano a causa delle onde ultrasoniche, creando forze meccaniche e microflussi nella sospensione.
6. Sonorizzazione: Le forze meccaniche e i microflussi generati dalla cavitazione creano temporaneamente pori e fori nelle membrane delle cellule vegetali. Il materiale genetico presente nella sospensione può entrare nelle cellule vegetali attraverso questi pori.
7. Incubazione: Dopo il trattamento di sonoporazione, incubare le cellule vegetali per consentire loro di recuperare e stabilizzare le membrane. Questa è una fase cruciale per garantire la sopravvivenza delle cellule e il successo del trasferimento genico.

Trasferimento genico tramite Agrobacterium o liposomi

Esistono due forme comuni per trasfettare le cellule vegetali. Esse utilizzano l'agrobacterium, un genere di batteri Gram-negativi, o i liposomi come vettore del materiale genetico.

• Sonorizzazione mediata da Agrobacterium: L'Agrobacterium tumefaciens è un batterio comunemente utilizzato nell'ingegneria genetica delle piante. In questo metodo, il DNA plasmidico contenente il gene desiderato viene introdotto nell'Agrobacterium, che viene poi mescolato con le cellule vegetali. La sospensione cellulare viene sottoposta a sonoporazione con un sonicatore a sonda. L'energia ultrasonica favorisce il trasferimento del materiale genetico dall'Agrobacterium alle cellule vegetali. Questo metodo è ampiamente utilizzato per la modificazione genetica delle piante.
• Sonorizzazione mediata da liposomi: I liposomi sono vescicole a base di lipidi che possono trasportare materiale genetico. In questo metodo, i liposomi caricati con DNA plasmidico o altri acidi nucleici vengono mescolati con le cellule vegetali. Per facilitare l'assorbimento dei liposomi da parte delle cellule vegetali, si ricorre alla sonorizzazione con un sonicatore a sonda. Gli ultrasuoni rompono i bilayer lipidici dei liposomi, rilasciando il materiale genetico nelle cellule vegetali. Questo approccio è utile per gli studi di espressione genica transitoria nelle cellule vegetali.

Vantaggi scientificamente provati della trasformazione mediata da agrobatterio assistita da sonicazione (SAAT)

La trasformazione mediata da agrobatterio assistita da sonicazione (SAAT) è stata applicata a numerose specie vegetali. Un breve e relativamente blando trattamento a ultrasuoni delle colture cellulari vegetali provoca la sonorizzazione, che successivamente consente una penetrazione profonda di Agrobacterium come trasportatore di geni. Di seguito sono riportati alcuni studi esemplari che dimostrano gli effetti benefici della SAAT.

Trasformazione assistita da ultrasuoni dell'Ashwagandha

Per migliorare l'efficienza di trasformazione in W. somnifera (nota come ashwagandha o ciliegia invernale), Dehdashti e colleghi (2016) hanno studiato l'uso di acetosiringone (AS) e sonicazione.
L'acetosiringone (AS) è stato aggiunto in tre fasi: Coltura liquida di Agrobacterium, infezione di Agrobacterium e co-coltura di espianti con Agrobacterium. L'aggiunta di 75 μM di AS alla coltura liquida di Agrobacterium è risultata ottimale per l'induzione dei geni vir.
L'applicazione aggiuntiva della sonicazione (SAAT) ha prodotto la massima espressione genica. L'espressione del gene gusA nelle radici pelose è risultata migliore quando le foglie e gli apici dei germogli sono stati sonicati rispettivamente per 10 e 20 secondi. L'efficienza di trasformazione del protocollo migliorato è stata registrata al 66,5 e al 59,5% nel caso di espianti di foglie e di punte di germogli, rispettivamente. Rispetto ad altri protocolli, l'efficienza di trasformazione di questo protocollo migliorato è risultata di 2,5 volte superiore per le foglie e di 3,7 volte superiore per i germogli. Le analisi del Southern blot hanno confermato 1-2 copie del transgene gusA nelle linee W1-W4, mentre 1-4 copie del transgene sono state rilevate nella linea W5 generata dal protocollo migliorato.

Effetto della durata della trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) sulla frequenza di trasformazione di espianti di foglie (a) e di germogli (b) di W. somnifera
(studio e grafico: © Dehdashti et al., 2016)

Trasformazione del cotone assistita da ultrasuoni

Hussain et al. (2007) dimostrano gli effetti benefici della trasformazione del cotone assistita da sonicazione. La cavitazione acustica causata dagli ultrasuoni a bassa frequenza crea microferite sulla superficie e al di sotto del tessuto vegetale (sonoporazione) e consente all'Agrobacterium di viaggiare in profondità e completamente nel tessuto vegetale. Questa modalità di ferita aumenta la probabilità di infettare le cellule vegetali che si trovano più in profondità nel tessuto. Per valutare l'efficienza di trasformazione di SAAT, è stata misurata l'espressione del gene GUS. Il sistema reporter GUS è un gene reporter particolarmente utile in biologia molecolare vegetale e microbiologia. Regolando vari parametri di SAAT, l'espressione transitoria di GUS nel cotone utilizzando embrioni maturi come espianto è stata significativamente aumentata. Il GUS è stato rilevato per la prima volta 24 ore dopo l'incubazione degli espianti e a 48 ore l'espressione del GUS era molto intensa, il che è servito come utile indicatore del successo della trasformazione dell'espianto di cotone in seguito alla trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT). Nel confronto tra le varie tecniche di trasformazione (biolistica, Agro, BAAT, SAAT), la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) ha mostrato di gran lunga i migliori risultati di trasformazione.

Scelta della procedura di trasformazione in base all'espressione transitoria di GUS. La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) mostra un'espressione transitoria significativamente più elevata.
(studio e grafico: © Hussain et al., 2007)

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