Trasformazione genetica delle cellule vegetali con gli ultrasuoni

La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) è un metodo efficiente per infettare le cellule vegetali con geni estranei utilizzando Agrobacterium come trasportatore. La cavitazione a ultrasuoni provoca la sonoporazione, che può essere descritta come una microferita mirata del tessuto vegetale. Attraverso queste microferite create dagli ultrasuoni, il DNA e i vettori di DNA possono essere trasportati in modo efficiente nella matrice cellulare.

sonoporazione – Trasformazione cellulare potenziata dagli ultrasuoni

L'Ultrasuonatore UP100H è un omogeneizzatore da laboratorio spesso utilizzato per la preparazione dei campioni delle piastre di coltura cellulare.Quando gli ultrasuoni a bassa frequenza (circa 20kHz) vengono applicati alle sospensioni cellulari, gli effetti della cavitazione acustica provocano una permeabilizzazione transitoria della membrana sui tessuti cellulari. Questo effetto ultrasonico è noto come sonoporazione e viene utilizzato per il trasferimento di geni in cellule o tessuti.
I vantaggi dell'ultrasonorizzazione si basano sul suo principio di funzionamento meccanico non termico, che rende la sonicazione spesso più versatile e meno dipendente dai tipi di cellule. L'applicazione versatile della sonicazione apre la possibilità di utilizzare piante transgeniche, che hanno un potenziale significativo nella bioproduzione di proteine terapeutiche umane complesse. Questi bioreattori a base vegetale possono essere facilmente manipolati geneticamente, evitano la potenziale contaminazione con agenti patogeni umani, non danneggiano i batteri che mediano la trasformazione (ad esempio Agrobacterium) e rappresentano un metodo di biosintesi economico ed efficace.

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Il video mostra il sistema di preparazione del campione ad ultrasuoni UIP400MTP, che permette la preparazione affidabile del campione di qualsiasi piastra standard a più pozzetti utilizzando ultrasuoni ad alta intensità. Le applicazioni tipiche dell'UIP400MTP comprendono la lisi delle cellule, il taglio di DNA, RNA e cromatina e l'estrazione delle proteine.

Ultrasuonatore UIP400MTP per la sonicazione di piastre a più pozzetti

Trasformazione cellulare assistita dagli ultrasuoni

Gli ultrasuonatori a sonda, come l'UP200St, sono omogeneizzatori di tessuti affidabili e ampiamente utilizzati per la preparazione dei campioni in genetica, ad esempio per la trasformazione mediata da agrobatterio assistita da sonicazione (SAAT).La sonicazione è una tecnica che applica onde ultrasoniche a bassa frequenza per agitare le particelle in soluzione, per mescolare le soluzioni, aumentando così la velocità di trasferimento di massa e di dissoluzione. Contemporaneamente, la sonicazione può rimuovere i gas disciolti dai liquidi. Nella trasformazione delle piante, la sonicazione provoca la formazione di microferite sui tessuti vegetali e favorisce l'invio di DNA nudo nel protoplasto della pianta.

Per la trasformazione genetica, la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) è il metodo preferito e ha un'efficienza significativamente superiore rispetto alla sonicazione utilizzata per trasferire DNA nudo e vettori di DNA direttamente nel protoplasto. Numerosi studi hanno dimostrato che la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) può essere utilizzata per indurre la rottura meccanica e la formazione di ferite sulle cellule vegetali mediante onde ultrasoniche e la conseguente cavitazione acustica. Un breve trattamento a ultrasuoni crea microferite sulla superficie degli espianti. Le cellule ferite permetteranno la penetrazione dell'Agrobacterium nella parte più profonda dei tessuti vegetali, aumentando così la probabilità di infettare le cellule vegetali. Inoltre, i composti fenolici secreti migliorano la trasformazione. Le microferite generate dagli ultrasuoni rendono anche più fattibile la penetrazione dell'espianto da parte dei batteri. Il SAAT è stato utilizzato con successo per la trasformazione genetica di specie vegetali considerate particolarmente resistenti all'Agrobacterium.
La semplicità e l'economicità del metodo e il significativo miglioramento del trasferimento genico mediato da Agrobacterium sono i principali vantaggi del SAAT. Oltre all'applicazione di successo del SAAT nella trasformazione di Chenopodium rubrum L. e Beta vulgaris L., questo approccio è stato applicato anche nella produzione di olotossina ricombinante di Escherichia coli wild-type termolabile e di adiuvanti vaccinali LT mutanti di Escherichia coli in Nicotiana tabacum, in cui sono stati rilevati i più alti titoli sistemici di IgG specifiche per LT-B negli uccelli.
(cfr. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka e R. Baranski, 2014)

Il VialTweeter può essere utilizzato per l'infezione del DNA di cellule vegetali, ad esempio utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT).

VialTweeter per la sonicazione simultanea di più provette di campione, ad esempio per la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT)

Vantaggi scientificamente provati della trasformazione mediata da agrobatterio assistita da sonicazione (SAAT)

La trasformazione mediata da agrobatterio assistita da sonicazione (SAAT) è stata applicata a numerose specie vegetali. Un breve e relativamente blando trattamento a ultrasuoni delle colture cellulari vegetali provoca la sonorizzazione, che successivamente consente una penetrazione profonda di Agrobacterium come trasportatore di geni. Di seguito sono riportati alcuni studi esemplari che dimostrano gli effetti benefici della SAAT.

Trasformazione assistita da ultrasuoni dell'Ashwagandha

Per migliorare l'efficienza di trasformazione in W. somnifera (nota come ashwagandha o ciliegia invernale), Dehdashti e colleghi (2016) hanno studiato l'uso di acetosiringone (AS) e sonicazione.
L'acetosiringone (AS) è stato aggiunto in tre fasi: Coltura liquida di Agrobacterium, infezione di Agrobacterium e co-coltura di espianti con Agrobacterium. L'aggiunta di 75 μM di AS alla coltura liquida di Agrobacterium è risultata ottimale per l'induzione dei geni vir.
L'applicazione aggiuntiva della sonicazione (SAAT) ha prodotto la massima espressione genica. L'espressione del gene gusA nelle radici pelose è risultata migliore quando le foglie e gli apici dei germogli sono stati sonicati rispettivamente per 10 e 20 secondi. L'efficienza di trasformazione del protocollo migliorato è stata registrata al 66,5 e al 59,5% nel caso di espianti di foglie e di punte di germogli, rispettivamente. Rispetto ad altri protocolli, l'efficienza di trasformazione di questo protocollo migliorato è risultata di 2,5 volte superiore per le foglie e di 3,7 volte superiore per i germogli. Le analisi del Southern blot hanno confermato 1-2 copie del transgene gusA nelle linee W1-W4, mentre 1-4 copie del transgene sono state rilevate nella linea W5 generata dal protocollo migliorato.

La durata della sonicazione (tempo di esposizione agli ultrasuoni) influenza la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) sulla trasformazione in W. somnifera

Effetto della durata della trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) sulla frequenza di trasformazione di espianti di foglie (a) e di germogli (b) di W. somnifera
(studio e grafico: © Dehdashti et al., 2016)

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Trasformazione del cotone assistita da ultrasuoni

Hussain et al. (2007) dimostrano gli effetti benefici della trasformazione del cotone assistita da sonicazione. La cavitazione acustica causata dagli ultrasuoni a bassa frequenza crea microferite sulla superficie e al di sotto del tessuto vegetale (sonoporazione) e consente all'Agrobacterium di viaggiare in profondità e completamente nel tessuto vegetale. Questa modalità di ferita aumenta la probabilità di infettare le cellule vegetali che si trovano più in profondità nel tessuto. Per valutare l'efficienza di trasformazione di SAAT, è stata misurata l'espressione del gene GUS. Il sistema reporter GUS è un gene reporter particolarmente utile in biologia molecolare vegetale e microbiologia. Regolando vari parametri di SAAT, l'espressione transitoria di GUS nel cotone utilizzando embrioni maturi come espianto è stata significativamente aumentata. Il GUS è stato rilevato per la prima volta 24 ore dopo l'incubazione degli espianti e a 48 ore l'espressione del GUS era molto intensa, il che è servito come utile indicatore del successo della trasformazione dell'espianto di cotone in seguito alla trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT). Nel confronto tra le varie tecniche di trasformazione (biolistica, Agro, BAAT, SAAT), la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) ha mostrato di gran lunga i migliori risultati di trasformazione.

La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) mostra un'espressione transitoria significativamente più elevata rispetto ai metodi di infezione alternativi.

Scelta della procedura di trasformazione in base all'espressione transitoria di GUS. La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) mostra un'espressione transitoria significativamente più elevata.
(studio e grafico: © Hussain et al., 2007)

Soluzioni a ultrasuoni ad alte prestazioni per la sonorizzazione e il SAAT

Hielscher Ultrasonics vanta una lunga esperienza nello sviluppo e nella produzione di ultrasuonatori ad alte prestazioni per laboratori, strutture di ricerca e produzioni industriali ad altissima produttività. Per la microbiologia e le scienze biologiche, Hielscher offre varie soluzioni per soddisfare i diversi requisiti necessari per tessuti specifici e i loro trattamenti. Per l'ultrasonicazione simultanea di numerosi campioni, Hielscher offre l'UIP400MTP per piastre multipozzetto, il VialTweeter per la sonicazione di un massimo di 10 fiale (ad esempio, provette Eppendorf) o il CupHorn a ultrasuoni. Gli ultrasuonatori a sonda sono disponibili da 50 a 400 watt come omogeneizzatori da laboratorio, mentre i sistemi industriali coprono una gamma di potenza da 500 watt a 16kW.
Mettetevi in contatto con noi e comunicateci i requisiti della vostra applicazione e del vostro processo. Il nostro personale esperto sarà lieto di consigliarvi l'ultrasuonatore più adatto al vostro processo biologico.
La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasuoni:

Volume di batch Portata Dispositivi raccomandati
piastre multiwell / microtiter n.a. UIP400MTP
fino a 10 fiale n.a. VialTweeter
fino a 5 fiale/tubi o 1 contenitore più grande n.a. Cuphorn
1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
0,1 - 20L 0,2 - 4L/min UIP2000hdT
10 - 100L 2 - 10L/min UIP4000hdT
n.a. 10 - 100L/min UIP16000
n.a. più grande cluster di UIP16000

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Gli omogeneizzatori a ultrasuoni ad alto potere di taglio sono utilizzati in laboratorio, su banco, in processi pilota e industriali.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori ad ultrasuoni ad alte prestazioni per applicazioni di miscelazione, dispersione, emulsificazione ed estrazione in laboratorio, pilota e su scala industriale.



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Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro, dagli ultrasuoni da laboratorio compatti alle unità da banco fino ai sistemi a ultrasuoni industriali completi.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensione industriale.