Trasformazione genetica nelle cellule vegetali mediante ultrasuoni

La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) è un metodo efficiente per infettare le cellule vegetali con geni estranei utilizzando Agrobacterium come trasportatore. La cavitazione ultrasonica provoca la sonoporazione, che può essere descritta come la formazione mirata di microlesioni nel tessuto vegetale. Attraverso queste microlesioni create dagli ultrasuoni, il DNA e i vettori di DNA possono essere trasportati efficacemente nella matrice cellulare.

Sonoporazione – Trasformazione cellulare potenziata dagli ultrasuoni

Quando si applicano ultrasuoni a bassa frequenza (circa 20kHz) alle sospensioni cellulari, gli effetti della cavitazione acustica provocano una permeabilizzazione transitoria delle membrane nei tessuti cellulari. Questo effetto degli ultrasuoni è noto come sonoporazione e viene utilizzato per il trasferimento genico nelle cellule o nei tessuti.
I vantaggi del trattamento a ultrasuoni si basano sul suo principio di funzionamento meccanico non termico, che rende la sonicazione spesso più versatile e meno dipendente dai tipi cellulari. La versatilità applicativa della sonoporazione apre la possibilità di utilizzare piante transgeniche, che hanno un notevole potenziale nella bioproduzione di proteine terapeutiche umane complesse. Questi bioreattori vegetali possono essere facilmente manipolati geneticamente, prevengono la potenziale contaminazione da patogeni umani, non danneggiano i batteri che mediano la trasformazione (ad esempio Agrobacterium) e costituiscono un metodo economico ed efficace di biosintesi.

Trasformazione cellulare assistita da ultrasuoni

La sonicazione è una tecnica che applica onde ultrasoniche a bassa frequenza per agitare particelle in soluzione e miscelare soluzioni, aumentando così la velocità di trasferimento di massa e di dissoluzione. Contemporaneamente, la sonicazione può rimuovere i gas disciolti dai liquidi. Nella trasformazione delle piante, la sonicazione provoca la formazione di microlesioni nel tessuto vegetale e favorisce l’introduzione di DNA nudo nel protoplasto vegetale.

Per la trasformazione genetica, la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) è il metodo preferito e presenta un’efficienza significativamente superiore rispetto alla sonicazione utilizzata per trasferire DNA nudo e vettori di DNA direttamente nel protoplasto. Numerosi studi hanno dimostrato che la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) può essere utilizzata per indurre la disgregazione meccanica e la formazione di lesioni nelle cellule vegetali mediante onde ultrasoniche e la conseguente cavitazione acustica. Un breve trattamento a ultrasuoni crea microlesioni sulla superficie degli espianti. Le cellule lesionate consentono la penetrazione di Agrobacterium nelle parti più profonde dei tessuti vegetali, aumentando così la probabilità di infezione delle cellule vegetali. Inoltre, i composti fenolici secreti favoriscono la trasformazione. Le microlesioni generate dagli ultrasuoni facilitano anche la penetrazione dei batteri negli espianti. La SAAT è stata utilizzata con successo per la trasformazione genetica di specie vegetali considerate particolarmente resistenti ad Agrobacterium.
La semplicità e il basso costo del metodo, insieme al significativo potenziamento del trasferimento genico mediato da Agrobacterium, sono i principali vantaggi della SAAT. Oltre alla sua applicazione riuscita nella trasformazione di Chenopodium rubrum L. e Beta vulgaris L., questo approccio è stato applicato anche alla produzione, in Nicotiana tabacum, dell’olotossina termolabile ricombinante di Escherichia coli di tipo selvatico e di adiuvanti vaccinali LT mutanti di Escherichia coli, con i quali sono stati rilevati negli uccelli i titoli sistemici più elevati di IgG specifiche per LT-B.
(cfr. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Procedura generale per il trasferimento genico mediante sonoporazione nelle cellule vegetali

1. Preparazione del materiale genetico: Iniziate preparando il materiale genetico che desiderate introdurre nelle cellule vegetali. Può trattarsi di DNA plasmidico, RNA o altri acidi nucleici.
2. Isolamento delle cellule vegetali: Isolate le cellule vegetali su cui desiderate intervenire. A seconda dell’esperimento, queste cellule possono essere isolate da tessuti o colture vegetali.
3. Sospensione cellulare: Sospendete le cellule vegetali in un terreno o in una soluzione tampone adatti. Questo è essenziale per garantire che le cellule siano sane e in condizioni favorevoli all’assorbimento dei geni.
4. Configurazione del sonicatore: Preparate il sonicatore a sonda impostando preventivamente i parametri di sonicazione, quali ampiezza, tempo, energia e temperatura. Immergete la sonda a ultrasuoni nella sospensione cellulare.
5. Sonicazione: Avviate la procedura di sonicazione. La rapida oscillazione della punta della sonda genera bolle di cavitazione nel liquido. Queste bolle si espandono e collassano per effetto delle onde ultrasoniche, creando forze meccaniche e microflussi nella sospensione.
6. Sonoporazione: Le forze meccaniche e i microflussi generati dalla cavitazione creano temporaneamente pori e aperture nelle membrane delle cellule vegetali. Il materiale genetico presente nella sospensione può entrare nelle cellule vegetali attraverso questi pori.
7. Incubazione: Dopo il trattamento di sonoporazione, incubate le cellule vegetali per consentire loro di recuperare e stabilizzare le membrane. Questo passaggio è fondamentale per garantire la sopravvivenza cellulare e il successo del trasferimento genico.

Trasferimento genico mediante Agrobacterium o liposomi

Esistono due modalità comuni per trasfettare le cellule vegetali. Utilizzano Agrobacterium, un genere di batteri Gram-negativi, oppure liposomi come trasportatori del materiale genetico.

• Sonoporazione mediata da Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens è un batterio comunemente utilizzato nell’ingegneria genetica vegetale. In questo metodo, il DNA plasmidico contenente il gene desiderato viene introdotto in Agrobacterium, che viene poi miscelato con le cellule vegetali. La sospensione cellulare viene sottoposta a sonoporazione utilizzando un sonicatore a sonda. L’energia ultrasonica favorisce il trasferimento del materiale genetico da Agrobacterium alle cellule vegetali. Questo metodo è ampiamente utilizzato per la modificazione genetica delle piante.
• Sonoporazione mediata da liposomi: I liposomi sono vescicole lipidiche che possono trasportare materiale genetico. In questo metodo, i liposomi contenenti DNA plasmidico o altri acidi nucleici vengono miscelati con le cellule vegetali. La sonoporazione mediante un sonicatore a sonda viene impiegata per facilitare l’assorbimento dei liposomi da parte delle cellule vegetali. Gli ultrasuoni disgregano i doppi strati lipidici dei liposomi, rilasciando il materiale genetico nelle cellule vegetali. Questo approccio è utile per gli studi sull’espressione genica transitoria nelle cellule vegetali.

Benefici scientificamente dimostrati della trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT)

La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) è stata applicata a numerose specie vegetali. Un trattamento a ultrasuoni breve e relativamente delicato delle colture di cellule vegetali provoca la sonoporazione, che consente successivamente una penetrazione profonda di Agrobacterium come trasportatore di geni. Di seguito potete leggere alcuni studi esemplificativi che dimostrano gli effetti benefici della SAAT.

Trasformazione dell’ashwagandha assistita da ultrasuoni

Per migliorare l’efficienza di trasformazione in W. somnifera (nota come ashwagandha o ciliegia d’inverno), Dehdashti e colleghi (2016) hanno studiato l’impiego di acetosiringone (AS) e della sonicazione.
L’acetosiringone (AS) è stato aggiunto in tre fasi: coltura liquida di Agrobacterium, infezione con Agrobacterium e co-coltura degli espianti con Agrobacterium. L’aggiunta di 75 μM di AS alla coltura liquida di Agrobacterium è risultata ottimale per l’induzione dei geni vir.
L’applicazione aggiuntiva della sonicazione (SAAT) ha prodotto la massima espressione genica. L’espressione del gene gusA nelle radici capillari è risultata migliore quando le foglie e gli apici dei germogli sono stati sonicati rispettivamente per 10 e 20s. L’efficienza di trasformazione del protocollo migliorato è stata pari a 66,5 e 59,5% rispettivamente per gli espianti fogliari e degli apici dei germogli. Rispetto ad altri protocolli, l’efficienza di trasformazione di questo protocollo migliorato è risultata 2,5 volte superiore per le foglie e 3,7 volte superiore per gli apici dei germogli. Le analisi Southern blot hanno confermato 1–2 copie del transgene gusA nelle linee W1-W4, mentre nella linea W5 generata con il protocollo migliorato sono state rilevate 1–4 copie del transgene.

Effetto della durata della trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) sulla frequenza di trasformazione degli espianti fogliari (a) e degli apici dei germogli (b) di W. somnifera
(studio e grafico: © Dehdashti et al., 2016)

Trasformazione del cotone assistita da ultrasuoni

Hussain et al. (2007) dimostrano gli effetti benefici della trasformazione del cotone assistita da sonicazione. La cavitazione acustica provocata dagli ultrasuoni a bassa frequenza crea microlesioni sulla superficie del tessuto vegetale e al di sotto di essa (sonoporazione) e consente ad Agrobacterium di penetrare più in profondità e attraversare l’intero tessuto vegetale. Questa modalità di formazione delle lesioni aumenta la probabilità di infettare le cellule vegetali situate più in profondità nel tessuto. Per valutare l’efficienza di trasformazione della SAAT, è stata misurata l’espressione del gene GUS. Il sistema reporter GUS è un sistema basato su un gene reporter, particolarmente utile nella biologia molecolare vegetale e nella microbiologia. Regolando diversi parametri della SAAT, l’espressione transitoria di GUS nel cotone, utilizzando embrioni maturi come espianti, è stata significativamente aumentata. GUS è stato rilevato per la prima volta 24h dopo l’incubazione degli espianti e, a 48h, l’espressione di GUS era molto intensa, fornendo un utile indicatore dell’avvenuta trasformazione dell’espianto di cotone dopo la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT). Nel confronto tra diverse tecniche di trasformazione (ossia biolistica, Agro, BAAT, SAAT), la trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) ha mostrato risultati di trasformazione di gran lunga migliori.

Scelta della procedura di trasformazione sulla base dell’espressione transitoria di GUS. La trasformazione mediata da Agrobacterium assistita da sonicazione (SAAT) mostra un’espressione transitoria significativamente superiore.
(studio e grafico: © Hussain et al., 2007)

Soluzioni a ultrasuoni ad alte prestazioni per la sonoporazione e la SAAT

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