जीवाणु नमूनों में अल्ट्रासोनिक कोशिका समुच्चय-वियोजन

जीवाणु नमूने वास्तविक एकल-कोशिका निलंबन के रूप में विरले ही प्राप्त होते हैं। संवर्धन शृंखलाओं और फ्लॉक्स के रूप में बढ़ते हैं, पर्यावरण से पृथक किए गए जीवाणु बाह्यकोशिकीय बहुलकीय पदार्थों से बंधे समुच्चय बनाते हैं, और अपकेंद्रण से बने पेलेट अक्सर अच्छी तरह वॉर्टेक्स करने के बावजूद पुनः निलंबित नहीं होते। जीवित कोशिकाओं की गणना, प्रकाशिक घनत्व, प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोबायोम प्रोफाइलिंग सभी यह मानकर चलते हैं कि एक कण एक कोशिका के बराबर है। अल्ट्रासोनिक कोशिका समुच्चय-वियोजन इस विरोधाभास को दूर करता है: सोनिकेशन के छोटे, नियंत्रित स्पंद समुच्चयों को कोशिकाओं का लयन किए बिना अलग-अलग कोशिकाओं में विभाजित कर देते हैं।

कोशिका समुच्चयन आपके परिणामों को क्यों प्रभावित करता है

समुच्चयन एक जैविक विशेषता है, तैयारी की त्रुटि नहीं। Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces और पर्यावरण में पाई जाने वाली कई प्रजातियाँ शृंखलाओं, गुच्छों या बायोफिल्म के खंडों के रूप में बढ़ती हैं, और बाह्यकोशिकीय DNA तथा पॉलीसैकेराइड पेलेट और स्वैब एल्यूएट में कोशिकाओं को आपस में चिपकाए रखते हैं। इससे विश्लेषण के परिणामों में व्यवस्थित विकृतियाँ आती हैं:

• कॉलोनियों की संख्या वास्तविक संख्या से कम आंकी जाती है, क्योंकि एक गुच्छे से एक ही कॉलोनी बनती है, चाहे उसमें कितनी भी कोशिकाएँ हों।
• प्रकाशिक घनत्व मापन और कण गणक कोशिकाओं के बजाय समुच्चयों को दर्ज करते हैं, जिससे वृद्धि वक्रों में पक्षपात आता है।
• प्रवाह साइटोमेट्री और कोशिका छँटाई में गुच्छों से संबंधित घटनाओं की गणना गलत होती है और उन्हें विश्लेषण से बाहर कर दिया जाता है।
• DNA और प्रोटीन निष्कर्षण केवल समुच्चय की सतह पर मौजूद कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिससे माइक्रोबायोम और ओमिक्स डेटा विकृत होते हैं।

पारंपरिक उपाय धीमे होते हैं, अधूरे रहते हैं या रासायनिक परिवर्तन करते हैं। जोरदार पिपेटिंग और वॉर्टेक्सिंग के बाद भी सूक्ष्म समुच्चय शेष रह जाते हैं। एंजाइम या कीलेटर पर आधारित परिक्षेपण उस कोशिका सतह को बदल देता है जिसका आप संभवतः विश्लेषण करना चाहते हों। नियंत्रित कैविटेशन द्वारा यांत्रिक समुच्चय-वियोजन कुछ ही सेकंड में प्रभाव दिखाता है और इसके लिए किसी योजक की आवश्यकता नहीं होती।

सोनिकेशन कोशिकाओं का लयन किए बिना उनके समुच्चयों को कैसे अलग करता है

अल्ट्रासोनिक कोशिका समुच्चय-वियोजन यांत्रिक मजबूती के अंतर का उपयोग करता है। जीवाणु समुच्चय अपेक्षाकृत कमजोर अंतरकोशिकीय बंधों और एक बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स द्वारा जुड़े रहते हैं, जबकि अक्षत कोशिका आवरण काफी अधिक अपरूपण सहन कर सकता है। जब अंशांकित अल्ट्रासाउंड निलंबन में प्रवेश करता है, तो ध्वनिक कैविटेशन सूक्ष्म प्रवाह, दाब स्पंद और अपरूपण बल उत्पन्न करता है, जो सबसे पहले समुच्चयों के अंतरापृष्ठों पर कार्य करते हैं। झिल्लियों के फटने (लयन) के ऊर्जा स्तर तक पहुँचने से पहले ही गुच्छे, शृंखलाएँ और बायोफिल्म के खंड अपरूपण से अलग हो जाते हैं (विसमुच्चयन)।

जीवाणु कोशिकाओं के गुच्छों का अल्ट्रासोनिक समुच्चय-वियोजन

समुच्चय-वियोजन या लयन – सोनिकेशन प्राचल कैसे प्रभाव डालते हैं

इसका व्यावहारिक परिणाम यह है कि एक ही उपकरण को अलग-अलग प्राचलों पर चलाकर समुच्चय-वियोजन और लयन किया जाता है। मध्यम आयाम, छोटे स्पंदित चक्रों और नियंत्रित तापमान पर आपको जीवित कोशिकाओं का एकल-कोशिका निलंबन मिलता है। आयाम, उद्भासन समय या नमूने का तापमान बढ़ाने से प्रक्रिया अंतःकोशिकीय लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए पूर्ण कोशिका विघटन की ओर बढ़ती है। Hielscher जनरेटर आपको आयाम, शक्ति, स्पंद और ऊर्जा निवेश को सटीक रूप से निर्धारित करने तथा विधि को सहेजने देते हैं, जिससे विभिन्न नमूनों, संचालकों और रन में समुच्चय-वियोजन चरण को पुनरुत्पादित किया जा सकता है।

कुशल संपर्क-रहित सोनिकेशन

बाथ सोनिकेशन इस स्तर का नियंत्रण प्रदान नहीं कर सकता। अल्ट्रासोनिक सफाई बाथ और टैंक केवल कम अल्ट्रासोनिक ऊर्जा प्रदान करते हैं, जिससे नमूना तैयारी अधूरी रहती है, और कैविटेशन असमान रूप से होता है, इसलिए प्रत्येक ट्यूब का उपचार बाथ में उसकी स्थिति के अनुसार होता है। VialTweeter तीव्र, केंद्रित अल्ट्रासोनिक बलों को पात्र की दीवार के माध्यम से सीधे एक साथ 10 तक सीलबंद नमूनों में संचारित करता है। जिन उपचारों के लिए बाथ में लंबे और परिवर्तनशील समय तक सोनिकेशन की आवश्यकता होती है, वे एक मानकीकृत पल्स पैटर्न में पूरे हो जाते हैं।
Hielscher के संपर्क-रहित सोनिकेटर बंद वायल की दीवारों के माध्यम से तीव्र, केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रविष्ट कराते हैं। VialTweeter एक साथ 10 तक वायल को समान तीव्रता पर संसाधित करता है, जिसमें नमूने में कोई प्रोब नहीं होता, कोई पार-संदूषण नहीं होता और कोई एरोसोल मुक्त नहीं होता। जहाँ नमूना प्रसंस्करण क्षमता की आवश्यकता अधिक होती है, वहाँ UIP400MTP और UIP550MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर इसी नियंत्रित ऊर्जा अंतरण को मल्टी-वेल प्लेटों तक विस्तारित करते हैं।

कोशिका समूहों के संपर्क-रहित अल्ट्रासोनिक पृथक्करण के लाभ

• शून्य पार-संदूषण: चूँकि वायल लगातार बंद रहते हैं और नमूने में कोई प्रोब नहीं डुबोया जाता, इसलिए पार-संदूषण और नमूने की हानि पूरी तरह टल जाते हैं। नमूनों के बीच किसी भी वस्तु को निर्जीवाणुकृत करने की आवश्यकता नहीं होती, और एक प्रसंस्करण चक्र अगले चक्र को प्रभावित नहीं कर सकता।
• एरोसोल से सुरक्षा: खुले पात्र में प्रोब सोनिकेशन संक्रामक एरोसोल उत्पन्न करता है और उपकरण की सतहों को संदूषित करता है। सीलबंद वायल में सोनिकेशन नमूने को उसकी अपनी ट्यूब के अंदर सीमित रखता है, जो Mycobacterium tuberculosis जैसे रोगजनक जीवाणुओं और अन्य BSL-2 या BSL-3 कारकों को संभालते समय महत्वपूर्ण है।
• प्रोब के सिरे का क्षरण नहीं: संचालन के दौरान टाइटेनियम प्रोब से थोड़ी मात्रा में सूक्ष्म कण नमूने में निकल सकते हैं। ये कण बाद के चरणों में प्रकाशिक घनत्व और कणों की गणना को बदल देते हैं। पात्र की दीवार के माध्यम से अप्रत्यक्ष सोनिकेशन ठोस कणों के इस स्रोत को पूरी तरह समाप्त कर देता है।
• एकसमान नमूना प्रसंस्करण क्षमता: VialTweeter अधिकतम 10 वायल में से प्रत्येक को समान अल्ट्रासाउंड तीव्रता प्रदान करता है, इसलिए सोनिकेशन के परिणाम एकसमान और पुनरुत्पाद्य होते हैं। बाथ और एकल नमूने में प्रोब के उपयोग को प्रभावित करने वाले स्थिति-संबंधी प्रभाव समाप्त हो जाते हैं, और दोहराए गए नमूनों में आपके आधारभूत मान तुलनीय बने रहते हैं।
• नमूने की अखंडता: पूरी प्रसंस्करण अवधि में ट्यूब बंद रहती हैं, इसलिए नमूना संदूषित, खराब या वाष्पीकृत नहीं हो सकता। छोटी मात्राओं को बिना तनुकरण के संसाधित किया जा सकता है, जिनमें वे बहुमूल्य नैदानिक पेलेट भी शामिल हैं जिनके लिए स्थानांतरण का एक अतिरिक्त चरण भी स्वीकार्य नहीं होता।
• प्रक्रिया नियंत्रण: आयाम को 20 से 100% तक और पल्स मोड को 0 से 100% तक समायोजित किया जा सकता है, और ये प्रणालियाँ तापमान की निगरानी का समर्थन करती हैं, जिससे ताप-संवेदनशील प्रभेद और प्रोटीन क्षतिकारक तापमान सीमाओं से नीचे बने रहते हैं।

सामान्य अनुप्रयोग

• माइक्रोबायोम और आंत्र-सामग्री का विश्लेषण: प्लेटिंग या अनुक्रमण से पहले Lactobacillus, Bifidobacterium और मल के नमूनों को परिक्षेपित करना, ताकि समूहों के कारण गणना कम न हो।
• खाद्य और जल सूक्ष्मजीवविज्ञान: कॉलोनी और जीवितता के सटीक निर्धारण के लिए स्वैब, धुलाई द्रवों और संवर्धन ब्रॉथ में फ्लॉक को अलग करना।
• बायोफिल्म अनुसंधान: ऐसे एंजाइमी उपचार के बिना, जो सतही प्रोटीन हटा दे, वाहकों और सतहों से कोशिकाओं को एकल-कोशिका निलंबन के रूप में प्राप्त करना।
• नैदानिक परीक्षण: जैविक परिरोधन की स्थितियों में थूक, मवाद और स्वैब एल्यूएट को पुनः निलंबित करना।
• कोशिका संवर्धन: गणना और पैसेजिंग से पहले स्तनधारी, कीट और CHO कोशिकाओं के गुच्छेदार समूहों को अलग करना।
• पूरी कार्यप्रक्रिया के लिए तैयारी: जो उपकरण कम आयाम पर कोशिका समूहों को अलग करता है, वही उच्च सेटिंग पर पूर्ण कोशिका विघटन करता है, इसलिए उसके बाद लयन, प्रोटीन निष्कर्षण और DNA खंडन ट्यूबों के बीच स्थानांतरण के बिना किए जा सकते हैं।

साहित्य / संदर्भ

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.