96-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP का उपयोग करके MBEC परीक्षण का प्रोटोकॉल

MBEC परीक्षण का उपयोग पेग वाले ढक्कनों पर बने बायोफिल्म को समाप्त करने के लिए आवश्यक रोगाणुरोधी एजेंटों की सांद्रता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। बायोफिल्म की जीवित रहने की क्षमता का आकलन करने के लिए, पहले बायोफिल्म को 96-वेल प्लेट के पेग वाले ढक्कनों से अलग करना आवश्यक है। इस पृथक्करण के लिए सोनिकेशन सबसे विश्वसनीय और कुशल विधि है। मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP को विशेष रूप से अधिकतम दक्षता और सुविधा के साथ परीक्षण प्लेटों को संसाधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले MBEC परीक्षण सुव्यवस्थित और तेज़ होते हैं।

बायोफिल्म को अलग करने के लिए सोनिकेशन

न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन सांद्रता (MBEC) परीक्षणों में सोनिकेशन एक महत्वपूर्ण चरण है, जो बायोफिल्म कोशिकाओं को उस सतह से प्रभावी रूप से अलग करता है जिससे वे जुड़ी होती हैं। बायोफिल्म स्वभावतः सूक्ष्मजीवों के संरचित समुदाय होते हैं, जो एक बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स से घिरे होते हैं। यह मैट्रिक्स उन्हें प्लवकीय कोशिकाओं की तुलना में रोगाणुरोधी एजेंटों के प्रति काफी अधिक प्रतिरोधी बनाता है। MBEC परीक्षणों के दौरान, सोनिकेशन में अल्ट्रासोनिक तरंगों से नियंत्रित कैविटेशन उत्पन्न किया जाता है, जो बायोफिल्म मैट्रिक्स को विघटित करके उसमें समाहित कोशिकाओं को निलंबन में मुक्त करता है। यह चरण सुनिश्चित करता है कि बायोफिल्म कोशिकाएँ पुनर्प्राप्ति माध्यम में समान रूप से वितरित हों, जिससे प्लेटिंग, तनुकरण या स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधियों के माध्यम से उनकी जीवित रहने की क्षमता का सटीक आकलन किया जा सके। बायोफिल्म को ठीक से अलग किए बिना, मैट्रिक्स के अवशिष्ट घटक कोशिकाओं को सुरक्षा दे सकते हैं, जिससे रोगाणुरोधी प्रभावकारिता का कम आकलन हो सकता है। इसलिए, विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय MBEC मान प्राप्त करने के लिए सोनिकेशन अपरिहार्य है। ये मान परीक्षण किए गए एजेंटों की वास्तविक उन्मूलन क्षमता को दर्शाते हैं। मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP परीक्षण प्लेटों में उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता के साथ आसानी से नमूना तैयार करने की सुविधा देता है।

न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन सांद्रता (MBEC) परीक्षण का प्रोटोकॉल

चरण 1: बायोफिल्म निर्माण

1. जीवाणु निलंबन तैयार करें:
   जीवाणुओं को उपयुक्त माध्यम में लघुगणकीय वृद्धि चरण तक उगाएँ।
   जीवाणु संवर्धन को एक निर्धारित प्रकाशीय घनत्व (जैसे, OD600 ~0.1) तक तनु करें।
2. 96-वेल प्लेट में संरोपण करें:
   एक मानक 96-वेल माइक्रोटाइटर प्लेट के प्रत्येक वेल में जीवाणु निलंबन (जैसे, 150–200 µL) डालें।
3. पेग वाला ढक्कन लगाएँ:
   संरोपित प्लेट पर पेग वाला ढक्कन रखें, ताकि पेग की सतहों पर बायोफिल्म बन सके।
4. प्लेट को इन्क्यूबेट करें:
   बायोफिल्म की वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए इस व्यवस्था को उपयुक्त तापमान (जैसे, 37°C) पर 24–48 घंटे तक बिना हिलाए इन्क्यूबेट करें।

चरण 2: रोगाणुरोधी एजेंटों से उपचार

• रोगाणुरोधी घोल तैयार करें:
  ताज़े माध्यम में रोगाणुरोधी एजेंटों की विभिन्न सांद्रताओं वाले घोल तैयार करें।
  बायोफिल्म को रोगाणुरोधी एजेंटों के संपर्क में लाएँ:
  जीवाणु संवर्धन से पेग वाला ढक्कन हटाएँ और प्लवकीय कोशिकाओं को हटाने के लिए उसे निर्जीवाणु सलाइन या PBS से धोएँ।
  पेग वाले ढक्कन को रोगाणुरोधी घोलों वाली एक नई 96-वेल प्लेट में रखें।
• प्लेट को इन्क्यूबेट करें:
  रोगाणुरोधी एजेंटों के संपर्क में रखने के लिए एक निर्धारित अवधि (जैसे, 24 घंटे) तक इन्क्यूबेट करें।

चरण 3: 96-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP से सोनिकेशन

जीवित रहने की क्षमता का आकलन करने के लिए पेग वाले ढक्कनों से बायोफिल्म को अलग करने में सोनिकेशन का चरण अत्यंत महत्वपूर्ण है। UIP400MTP सोनिकेटर के लिए इन चरणों का पालन करें:

1. व्यवस्था तैयार करें:
   एक नई 96-वेल प्लेट के प्रत्येक वेल में पुनर्प्राप्ति माध्यम (जैसे, निष्प्रभावीकरण ब्रोथ या ताज़ा वृद्धि माध्यम) भरें।
2. पेग वाला ढक्कन स्थानांतरित करें:
   रोगाणुरोधी उपचार वाली प्लेट से पेग वाला ढक्कन हटाएँ।
   अवशिष्ट रोगाणुरोधी एजेंटों को हटाने के लिए पेग वाले ढक्कन को निर्जीवाणु सलाइन या PBS से धोएँ।
3. प्लेट और सोनिकेटर को सही स्थान पर रखें:
   पुनर्प्राप्ति माध्यम वाली प्लेट पर पेग वाला ढक्कन लगाएँ।
   पुनर्प्राप्ति माध्यम वाली प्लेट को UIP400MTP सोनिकेटर के प्लेटफ़ॉर्म पर रखें और सुनिश्चित करें कि प्लेट केंद्र में तथा स्थिर हो।
4. सोनिकेशन के मापदंड समायोजित करें:
   UIP400MTP पर सोनिकेशन के मापदंड निर्धारित करें (सेटिंग्स को बायोफिल्म के अनुसार समायोजित किया जा सकता है):
   आयाम: 70–100%.
   सोनिकेशन का समय: चक्र मोड में 1–3 मिनट (बायोफिल्म की दृढ़ता के आधार पर समायोजित करें)।
5. सोनिकेशन करें:
   सोनिकेशन प्रक्रिया शुरू करें। अल्ट्रासोनिक कंपन बायोफिल्म को पेग की सतहों से अलग करके पुनर्प्राप्ति माध्यम में पहुँचा देगा।
6. प्रक्रिया की निगरानी करें:
   वेल में नमूने के तापमान की निगरानी के लिए प्लग से जोड़े जा सकने वाले तापमान सेंसर का उपयोग करें। शीतलन के लिए UIP400MTP को प्रयोगशाला चिलर से जोड़ा जा सकता है।
7. सोनिकेशन के बाद की प्रक्रिया:
   आगे के विश्लेषण के लिए पुनर्प्राप्ति माध्यम को तुरंत एक नई निर्जीवाणु प्लेट में स्थानांतरित करें (इस माध्यम में अब अलग किए गए बायोफिल्म हैं)।

(A) 2% ग्लूकोज़ युक्त TSB वाली प्लेट, जिसका उपयोग बायोफिल्म निर्माण, कोशिकाओं की पुनर्प्राप्ति और
MIC तथा MBCB के निर्धारण के लिए किया गया; (B) स्टैफिलोकोकल बायोफिल्म के निर्माण के लिए पिन वाला ढक्कन। MIC तथा MBCB का निर्धारण; (B) स्टैफिलोकोकल बायोफिल्म के निर्माण के लिए पिन वाला ढक्कन।
पिन पर बनी बायोफिल्म कोशिकाओं को, कोशिकाओं की पुनर्प्राप्ति के लिए ताज़ा संवर्धन माध्यम वाली 96-वेल प्लेटों में 5 min तक सोनिकेशन (Hielscher Ultrasound Technology) द्वारा अलग किया गया।
(चित्र और अध्ययन: ©de Oliveira et al., 2016)

चरण 4: जीवित रहने की क्षमता का आकलन

अलग किए गए बायोफिल्म की प्लेटिंग और संवर्धन करें:

1. कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (CFU) की गणना करने के लिए पुनर्प्राप्ति माध्यम का क्रमिक तनुकरण करें और अगर पर प्लेटिंग करें।
   वैकल्पिक रूप से, जीवित रहने की क्षमता का आकलन करने के लिए वर्णमितीय या प्रतिदीप्ति-आधारित परीक्षण का उपयोग करें।
2. परिणाम दर्ज करें:
   MBEC को रोगाणुरोधी एजेंट की उस न्यूनतम सांद्रता के रूप में निर्धारित करें, जिसने बायोफिल्म की पता लगाई जा सकने वाली जीवित रहने की क्षमता को समाप्त कर दिया हो।

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यहाँ पढ़ें कि MBEC परीक्षण का उपयोग करके Pseudomonas aeruginosa बायोफिल्म के विरुद्ध विसंक्रामक की प्रभावकारिता जाँचने के ASTM E2799 प्रोटोकॉल के दौरान, नमूना तैयारी के चरण के रूप में बायोफिल्म को अलग करने के लिए UIP400MTP का उपयोग कैसे किया जाता है।