बायोफिल्म और प्रोटिओमिक विश्लेषण में Hielscher मल्टी-सैंपल सोनिकेटरों के उपयोग का प्रोटोकॉल

VialTweeter Multi-Tube Sonicator और UIP400MTP Microplate Sonicator जैसे मल्टी-सैंपल सोनिकेटरों का उपयोग उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले अनुप्रयोगों के लिए प्रयोगशाला कार्यप्रवाहों को सुव्यवस्थित करता है। दोनों उपकरण कई नमूनों में सटीक और एकसमान अल्ट्रासोनिक प्रसंस्करण की सुविधा देते हैं, जिससे परिवर्तनशीलता न्यूनतम होती है और पुनरुत्पादकता बढ़ती है। यह उन प्रयोगों में विशेष रूप से लाभदायक है जिनमें नमूनों का सुसंगत लयन, बायोफिल्म को अलग करना, प्रोटीन निष्कर्षण या प्रोटिओलिटिक पाचन आवश्यक होता है और जहाँ मैन्युअल या एकल-नमूना विधियाँ कम कुशल होती हैं तथा उनमें असंगति की संभावना रहती है।

मल्टी-सैंपल सोनिकेटरों से कार्यप्रवाह सुव्यवस्थित करें

उदाहरण के लिए, UIP400MTP माइक्रोप्लेट के वेलों में एक साथ अल्ट्रासोनिक उपचार की सुविधा देता है, जिससे बायोफिल्म या कोशिकीय सामग्री का एकसमान पृथक्करण सुनिश्चित होता है। वहीं, VialTweeter कई ट्यूबों में मौजूद नमूनों का पार-संदूषण के बिना सटीक लयन और समांगीकरण प्रदान करता है। ये सोनिकेटर प्रसंस्करण समय को काफी कम करते हैं, प्रयोगों की पुनरुत्पादकता सुधारते हैं और नमूनों की अखंडता का उच्च स्तर बनाए रखते हैं, जिससे ये सूक्ष्मजीवविज्ञान, प्रोटिओमिक्स और आणविक जीवविज्ञान अनुसंधान के लिए अपरिहार्य उपकरण बन जाते हैं।
नीचे एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिया गया है, जो E. coli बायोफिल्म निर्माण और उसके बाद प्रोटिओमिक विश्लेषण से संबंधित एक अध्ययन में Hielscher मल्टी-सैंपल सोनिकेटर मॉडलों, VialTweeter Multi-Tube Sonicator और Microplate Sonicator UIP400MTP, के उपयोग का उदाहरण प्रस्तुत करता है।

प्रोटोकॉल: Hielscher मल्टी-सैंपल सोनिकेटरों का उपयोग करके बायोफिल्म निर्माण, पृथक्करण और प्रोटिओमिक विश्लेषण

1. जीवाणु संवर्धन की तैयारी

• E. coli जीवाणुओं (स्ट्रेन W3110) को 30°C पर संवर्धित करें, जो E. coli बायोफिल्म निर्माण के लिए अनुकूल तापमान है। ट्रिप्टोन ब्रॉथ (TB) माध्यम का उपयोग करें जिसमें निम्नलिखित हों:
  – 10 g/L ट्रिप्टोन
  – 5 g/L NaCl
• प्लाज़्मिड का बने रहना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यकतानुसार एंटीबायोटिक्स मिलाएँ।
• सूक्ष्मदर्शी अध्ययन और प्रमोटर सक्रियता के अध्ययन के लिए, rplL प्रमोटर के नियंत्रण में जीनोम में स्थित एन्हांस्ड GFP (eGFP) रिपोर्टर वाले W3110 E. coli स्ट्रेन का उपयोग करें।
• विभिन्न प्रमोटरों (जैसे, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) की सक्रियता मापने के लिए उनके GFP रिपोर्टर प्लाज़्मिडों का उपयोग करें।

2. बायोफिल्म संवर्धन और पृथक्करण

• 12-वेल प्लेट (CellStar 12-वेल प्लेटें, Greiner Bio-One) के प्रत्येक वेल में 1.5 mL तनुकृत जीवाणु संवर्धन डालें।
• बायोफिल्म बनने देने के लिए इनक्यूबेट करें।
• प्लवकीय (गैर-आसंजी) संवर्धन को सावधानीपूर्वक हटाएँ।

– प्रत्येक वेल को 500 µL PBS से धोएँ।
– UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर में 12-वेल प्लेट का सोनिकेशन करके चिपकी हुई कोशिकाओं को अलग करें। UIP400MTP सभी वेलों में सुसंगत अल्ट्रासोनिक ऊर्जा पहुँचाकर एकसमान पृथक्करण सुनिश्चित करता है।
– सोनिकेशन सेटिंग्स: 60% आयाम, चक्र मोड: 60 sec चालू / 30 sec बंद।

3. कोशिका संग्रह और लयन

• अलग की गई बायोफिल्म कोशिकाओं को 4,500 g पर 5 मिनट तक अपकेंद्रित करें।
• पेलेट के रूप में एकत्र कोशिकाओं को PBS से धोएँ।
• कोशिकाओं को 2% सोडियम लॉरॉयल सार्कोसिनेट (SLS) के 100 µL में पुनः निलंबित करें और 95°C पर 15 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
• पूर्ण कोशिका लयन सुनिश्चित करने के लिए VialTweeter Multi-Tube Sonicator का उपयोग करके सोनिकेशन करें।
  – सोनिकेशन सेटिंग्स: 100% आयाम, कुल 10 min संचालन समय के लिए 50 s चालू / 10 s बंद; नमूनों को बर्फ पर रखें।

4. अपचयन और ऐल्किलीकरण

• डाइसल्फ़ाइड बंधों का अपचयन करने के लिए 5 mM ट्रिस(2-कार्बोक्सीएथिल)फॉस्फीन (TCEP) मिलाएँ और 95°C पर 15 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
• प्रोटीनों का 10 mM आयोडोऐसीटामाइड से 25°C पर 30 मिनट तक ऐल्किलीकरण करें।

5. प्रोटीन का मात्रात्मक निर्धारण और पाचन

• कोशिकीय मलबा हटाने के लिए लाइसेटों को अपकेंद्रित करें।
• Pierce BCA Protein Assay Kit का उपयोग करके कुल प्रोटीन मात्रा का निर्धारण करें।
• 2% SLS और 100 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट युक्त विलयन में 50 µg कुल प्रोटीन का 1 µg ट्रिप्सिन से पाचन करें।
• पाचन अभिक्रिया को 30°C पर रात भर इनक्यूबेट करें।

6. पेप्टाइड शुद्धिकरण

• 1.5% ट्राइफ्लुओरोऐसीटिक अम्ल (TFA) मिलाकर SLS का अवक्षेपण करें, फिर अपकेंद्रित करें।
• C18 माइक्रोस्पिन कॉलमों का उपयोग करके पेप्टाइडों को शुद्ध करें।
• शुद्ध किए गए पेप्टाइडों को सुखाएँ और 0.1% TFA में पुनः निलंबित करें।

7. द्रव क्रोमैटोग्राफी–द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS)

• Ultimate 3000 RSLC nano सिस्टम से युग्मित Q-Exactive Plus द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर पेप्टाइडों का विश्लेषण करें।
• C18 रेज़िन (2.4 µm) से भरे रिवर्स-फेज़ HPLC कॉलम (75 µm × 42 cm) का उपयोग करके पेप्टाइडों को अलग करें।
• 140 मिनट में विलायक B (0.15% फॉर्मिक अम्ल युक्त ऐसीटोनाइट्राइल) की सांद्रता 2% से 35% तक बढ़ाने वाला ग्रेडिएंट लागू करें।
• उच्च-विभेदन MS स्कैनों के बाद 10 सर्वाधिक तीव्रता वाले आयनों के टैंडम MS/MS स्कैनों का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें।

8. डेटा विश्लेषण

• Progenesis सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे LC-MS डेटा को संसाधित करें।
• .mgf फ़ाइलें निर्यात करें और MASCOT से उनका विश्लेषण करें।
• गुणवत्ता नियंत्रण और मिथ्या खोजों के समायोजन के लिए SafeQuant का उपयोग करके पेप्टाइडों का मात्रात्मक निर्धारण करें।
• पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयोग दो या तीन प्रतिकृतियों में करें।

उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता के साथ नमूना तैयारी के लिए मल्टी-सैंपल सोनिकेटर

मल्टी-सैंपल सोनिकेटर मॉडल VialTweeter और UIP400MTP प्रयोगात्मक कार्यप्रवाहों की सटीकता और दक्षता को काफी बढ़ाते हैं, विशेष रूप से बायोफिल्म अनुसंधान और प्रोटिओमिक्स में। कई नमूनों को एकसमान रूप से संसाधित करने की उनकी क्षमता डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता सुनिश्चित करती है। ऊपर बताए गए सुव्यवस्थित कार्यप्रवाहों के साथ मिलकर ये लाभ Hielscher मल्टी-सैंपल सोनिकेटरों को आधुनिक जैविक अनुसंधान के लिए आवश्यक उपकरण बनाते हैं।

डिज़ाइन, विनिर्माण और परामर्श – जर्मनी में निर्मित गुणवत्ता

Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अपने उच्चतम गुणवत्ता और डिज़ाइन मानकों के लिए प्रसिद्ध हैं। मजबूती और आसान संचालन हमारे अल्ट्रासोनिकेटरों को औद्योगिक सुविधाओं में सुगमता से एकीकृत करने में सक्षम बनाते हैं। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर कठोर परिस्थितियों और चुनौतीपूर्ण परिवेशों को आसानी से संभालते हैं।

Hielscher Ultrasonics एक ISO प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक तकनीक तथा उपयोग में सुगमता वाले उच्च-प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटरों पर विशेष ज़ोर देती है। निस्संदेह, Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर CE के अनुरूप हैं और UL, CSA तथा RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।