FFPE से पैराफिन हटाना और प्रोटीन निष्कर्षण

VialTweeter मल्टी-ट्यूब अल्ट्रासोनिकेटर के साथ पैराफिन हटाने, विलेयीकरण और सोनिकेशन के अनुकूलित संयोजन का उपयोग करके फॉर्मेलिन में स्थिर किए गए, पैराफिन में अंतःस्थापित (FFPE) ऊतक खंडों से प्रोटीन निष्कर्षण को सुगम बनाएँ। यह प्रोटोकॉल आगे की मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स प्रक्रियाओं में सहायक है और SP3 शुद्धिकरण तथा एंज़ाइमी पाचन कार्यप्रवाहों के अनुकूल है।

यह मानक संचालन प्रक्रिया (SOP) उच्च प्रदर्शन वाले सोनिकेशन का उपयोग करके FFPE ऊतक नमूनों के प्रोटिओमिक विश्लेषण में शामिल प्रयोगशाला कर्मियों के लिए है। इसे VialTweeter Multi-Tube Sonicator का उपयोग करके समानांतर रूप से संसाधित किए जाने वाले अधिकतम दस FFPE नमूनों के लिए अनुकूलित किया गया है।

प्रोटोकॉल: VialTweeter का उपयोग करके FFPE नमूनों से प्रोटीन निष्कर्षण

सामग्री और अभिकर्मक

अभिकर्मक

• ज़ाइलीन (ऊतकविज्ञान ग्रेड)
• एथेनॉल (निरपेक्ष 96%)
• लयन बफर:

6 M ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (ट्रिस(2-कार्बोक्सीएथिल)फॉस्फीन)
40 mM CAA (2-क्लोरोएसीटामाइड)

• प्रोटीएज़ अवरोधक (वैकल्पिक; उदाहरण के लिए, cOmplete™ mini EDTA-free)

उपकरण

• VialTweeter मल्टी-ट्यूब अल्ट्रासोनिकेटर
• 1.5 mL या 2.0 mL की कम बंधन वाली माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबें
• हीट ब्लॉक या इनक्यूबेटर (95°C और 80°C सेटिंग्स)
• माइक्रोसेंट्रीफ्यूज
• थर्मोमिक्सर (वैकल्पिक, लेकिन अनुशंसित)

प्रारंभिक नमूना मात्रा

• प्रति नमूना (अर्थात, प्रति वायल) 10 µm मोटे FFPE ऊतक के 1–2 खंड

या

• प्रति नमूना (अर्थात, प्रति वायल) कुल ~100 µg ऊतक

ध्यान दें: पैराफिन के मलबे से संदूषण को न्यूनतम रखने के लिए माइक्रोटोमी में नए ब्लेड का उपयोग करें।

प्रक्रिया

1. पैराफिन हटाना
   1. FFPE खंडों को कम बंधन वाली माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
   2. 1 mL ज़ाइलीन डालें और थोड़ी देर वॉर्टेक्स करें।
   3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
   4. 14,000 × g पर 2 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें; अधिप्लावी द्रव त्याग दें।
   5. ज़ाइलीन से धुलाई एक बार और दोहराएँ (चरण 2–4)।
   6. पैलेट को 1 mL 96% एथेनॉल से धोएँ, वॉर्टेक्स करें, फिर 14,000 × g पर 2 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें। अधिप्लावी द्रव त्याग दें।
   7. एथेनॉल से धुलाई एक बार और दोहराएँ (एथेनॉल से कुल 2 धुलाई)।
   8. अवशिष्ट एथेनॉल को वाष्पित करने के लिए ढक्कन खुले रखकर पैलेट को कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक हवा में सुखाएँ।
2. प्रोटीन निष्कर्षण और सोनिकेशन
   1. प्रत्येक सूखे पैलेट में 200 µL लयन बफर डालें।

      ध्यान दें: हालाँकि सोनिकेटर में 1 mL तक की मात्रा रखी जा सकती है, आगे के प्रसंस्करण के लिए 200 µL सर्वोत्तम है।

   2. वॉर्टेक्स करके या धीरे-धीरे पिपेटिंग करके मिलाएँ।
3. पहला तापीय इनक्यूबेशन
   1. थर्मोमिक्सर या हीट ब्लॉक का उपयोग करके ट्यूबों को 95 °C पर 30 min तक, 400 rpm पर हिलाते हुए इनक्यूबेट करें।
   2. नमूनों को कमरे के तापमान पर 5 min तक ठंडा होने दें।
4. VialTweeter के साथ पहला सोनिकेशन
   1. ट्यूबों को VialTweeter में रखें।
   2. VialTweeter UP200St को नीचे दिए गए मानों पर सेट करें और सोनिकेशन करें।
सोनिकेटर की सेटिंग्स
• आयाम (A) को 100% पर सेट करें
• स्पंदन मोड (C) को 100% पर सेट करें
• अवधि घड़ी: चालू
• चालू रहने का समय: 60s
• बंद रहने का समय: 30s
• सीमा मान: 15 min (10 चक्रों के अनुरूप)
(गणना संबंधी टिप्पणी: (60 s चालू + 30 s बंद) × 10 चक्र = 900 s = 15 min)
5. दूसरा तापीय इनक्यूबेशन
   ट्यूबों को निकालें और फिर से 95 °C पर 15 min तक, 400 rpm पर इनक्यूबेट करें।
6. दूसरा सोनिकेशन
   उन्हीं सेटिंग्स (ऊपर दी गई) का उपयोग करके VialTweeter पर अतिरिक्त 10 चक्रों (कुल 15 min) के लिए सोनिकेशन दोहराएँ।
7. लाइसेट का स्पष्टीकरण
   1. नमूनों को 23°C (कमरे के तापमान) पर 13,000 × g पर 10 min तक सेंट्रीफ्यूज करें।
   2. अधिप्लावी द्रव को सावधानीपूर्वक एक नई 2.0 mL Safe-lock Eppendorf ट्यूब में एकत्र करें। पैलेट को छेड़ने से बचें।
8. आगे का प्रसंस्करण
   लाइसेट अब SP3 शुद्धिकरण और एंज़ाइमी पाचन के लिए तैयार है।

टिप्पणियाँ और सर्वोत्तम कार्यपद्धतियाँ

1. प्रोग्राम किए गए चालू/बंद चक्रों से सोनिकेशन के दौरान अत्यधिक गर्म होने का जोखिम कम होता है।
2. प्रोटीन समुच्चयन रोकने के लिए सोनिकेशन के बाद वॉर्टेक्स करने से बचें।

अपशिष्ट निपटान और सुरक्षा

नीचे दी गई तालिका हमारे प्रयोगशाला आकार के अल्ट्रासोनिकेटरों की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है: