FFPE से Deparaffinization और प्रोटीन निष्कर्षण

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक वर्गों से प्रोटीन निष्कर्षण की सुविधा प्रदान करें, जिसमें वायलट्वीटर मल्टी-ट्यूब अल्ट्रासोनिकेटर के साथ डिपैराफिनाइजेशन, घुलनशीलता और सोनिकेशन के अनुकूलित संयोजन का उपयोग किया गया है। यह प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स का समर्थन करता है और SP3 क्लीनअप और एंजाइमेटिक पाचन वर्कफ़्लोज़ के साथ संगत है।

यह एसओपी उच्च प्रदर्शन वाले सोनिकेशन का उपयोग करके एफएफपीई ऊतक नमूनों के प्रोटिओमिक विश्लेषण में शामिल प्रयोगशाला कर्मियों के लिए है। यह VialTweeter मल्टी ट्यूब Sonicator का उपयोग कर समानांतर में संसाधित दस FFPE नमूने अप करने के लिए अनुकूलित है.

प्रोटोकॉल: VialTweeter का उपयोग कर FFPE नमूने से प्रोटीन निष्कर्षण

सामग्री और अभिकर्मक

अभिकर्मकों

• Xylene (ऊतक विज्ञान ग्रेड)
• इथेनॉल (पूर्ण 96%)
• लाइसिस बफर:

6 एम गुआनिडाइन हाइड्रोक्लोराइड
50 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.5
10 मिमी टीसीईपी (ट्रिस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन)
40 मिमी सीएए (2-क्लोरोएसिटामाइड)

• प्रोटीज अवरोधक (वैकल्पिक; जैसे, cOmplete™ मिनी EDTA-मुक्त)

साधन

• VialTweeter मल्टी-ट्यूब अल्ट्रासोनिकेटर
• 1.5 एमएल या 2.0 एमएल कम बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब
• हीट ब्लॉक या इनक्यूबेटर (95 डिग्री सेल्सियस और 80 डिग्री सेल्सियस सेटिंग्स)
• माइक्रोसेंट्रीफ्यूज
• थर्मोमिक्सर (वैकल्पिक लेकिन अनुशंसित)

नमूना इनपुट

• नमूना प्रति 10 माइक्रोन मोटी एफएफपीई ऊतक के 1-2 खंड (यानी, प्रति शीशी)

नहीं तो

• नमूना प्रति कुल ~ 100 माइक्रोग्राम ऊतक (यानी, प्रति शीशी)

नोट: पैराफिन मलबे संदूषण को कम करने के लिए माइक्रोटॉमी के लिए ताजा ब्लेड का उपयोग करें।

प्रक्रिया

1. डिपैराफिनाइजेशन
   1. एफएफपीई अनुभागों को कम-बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
   2. जाइलीन, भंवर के 1 एमएल संक्षेप में जोड़ें.
   3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट सेते हैं.
   4. 2 मिनट के लिए 14,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र; सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
   5. ज़ाइलीन वॉश को एक बार और दोहराएं (चरण 2-4)।
   6. 96% इथेनॉल, भंवर के 1 एमएल के साथ गोली धोएं, फिर 2 मिनट के लिए 14,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
   7. एक बार फिर इथेनॉल धोने दोहराएं (कुल 2 इथेनॉल washes)।
   8. अवशिष्ट इथेनॉल को वाष्पित करने के लिए खुले ढक्कन के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एयर-ड्राई पेलेट।
2. प्रोटीन निष्कर्षण और Sonication
   1. प्रत्येक सूखी गोली के लिए 200 माइक्रोन लाइसिस बफर जोड़ें।
      नोट: हालांकि सोनिकेटर 1 एमएल तक समायोजित करता है, 200 माइक्रोन डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए इष्टतम है।

   2. भंवर या कोमल पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
3. पहला थर्मल इनक्यूबेशन
   1. थर्मोमिक्सर या हीट ब्लॉक का उपयोग करके 400 आरपीएम पर आंदोलन के साथ, 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
   2. नमूने 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करते हैं.
4. VialTweeter के साथ पहला Sonication
   1. ट्यूबों को VialTweeter में रखें।
   2. VialTweeter UP200St को नीचे दिए गए मानों पर सेट करें और सोनिकेट करें।
Sonicator सेटिंग्स
• आयाम (ए) को 100% पर सेट करें
• धड़कन मोड (सी) को 100% पर सेट करें
• अवधि घड़ी: चालू
• समय पर: 60 के दशक
• ऑफ टाइम: 30s
• सीमा मूल्य: 15 मिनट (10 चक्रों से मेल खाती है)
(गणना नोट: (60 s चालू + 30 s बंद) × 10 चक्र = 900 s = 15 मिनट)
5. दूसरा थर्मल इनक्यूबेशन
   ट्यूब निकालें और 15 मिनट, 400 आरपीएम के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर फिर से सेते हैं।
6. दूसरा सोनिकेशन
   एक अतिरिक्त 10 चक्र (15 मिनट कुल) के लिए एक ही सेटिंग्स (ऊपर के रूप में) का उपयोग VialTweeter पर sonication दोहराएँ.
7. लाइसेट का स्पष्टीकरण
   1. 23 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान) पर 10 मिनट के लिए 13,000 × ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र।
   2. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला एक नया 2.0 एमएल सुरक्षित ताला Eppendorf ट्यूब में इकट्ठा. गोली को परेशान करने से बचें।
8. डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण
   लाइसेट अब SP3 क्लीनअप और एंजाइमेटिक पाचन के लिए तैयार है।

नोट्स और सर्वोत्तम अभ्यास

1. सोनिकेशन के दौरान ओवरहीटिंग जोखिम को प्रोग्राम किए गए ऑन/ऑफ साइकलिंग द्वारा कम किया जाता है।
2. प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने के लिए पोस्ट-सोनिकेशन भंवर से बचें।

अपशिष्ट निपटान और सुरक्षा

नीचे दी गई तालिका आपको हमारे प्रयोगशाला आकार के अल्ट्रासोनिकेटर की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है: