FFPE नमूनों की उच्च प्रसंस्करण क्षमता वाली तैयारी: प्रोटीन निष्कर्षण और न्यूक्लिक अम्लों की शियरिंग

अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
नीचे हम अक्सर पूछे जाने वाले उन प्रश्नों के उत्तर देते हैं, जो FFPE ऊतक की तैयारी और FFPE नमूनों के अल्ट्रासोनिकेशन से संबंधित हैं।

FFPE ऊतक कैसे तैयार किया जाता है?

FFPE ऊतक की तैयारी के चरण: उच्च गुणवत्ता वाले FFPE नमूने तैयार करने के लिए ताज़े ऊतक को बहुत सावधानी से संभालना और संसाधित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। बाद के सटीक विश्लेषण के लिए कोशिकीय संरचना, न्यूक्लिक अम्लों और प्रोटीनों का संरक्षण सुनिश्चित करना आवश्यक है। प्रत्येक चरण में – संग्रह से लेकर अंतःस्थापन तक – सटीकता आवश्यक है, ताकि ऊतकवैज्ञानिक परीक्षण, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आणविक अध्ययनों सहित विभिन्न विश्लेषणों के लिए नमूने की अखंडता बनी रहे। सही ढंग से किए जाने पर, स्थिरीकरण और अंतःस्थापन की यह प्रक्रिया सुनिश्चित करती है कि संरक्षित ऊतक in vivo अवस्था को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करे, जिससे विश्वसनीय नैदानिक और अनुसंधान परिणाम प्राप्त हो सकें।
हम आपको FFPE ऊतक नमूनों के अंतःस्थापन की प्रक्रिया के 6 प्रमुख चरणों से परिचित कराते हैं।

• ऊतक संग्रह
  जीवित स्तनधारियों से प्राप्त बायोप्सी और ऊतक संवर्धन, दोनों ही FFPE नमूना तैयारी के लिए ताज़ा ऊतक प्राप्त करने के उपयुक्त स्रोत हैं।
  असेप्टिक तकनीक का उपयोग करना महत्वपूर्ण है: संदूषण से बचने के लिए निर्जीवाणुकृत उपकरणों और दस्तानों का उपयोग करें। आदर्श रूप से, ऊतकों का संग्रह किसी निर्जीवाणु वातावरण में करें, जैसे शल्य चिकित्सा कक्ष या लैमिनार फ्लो हुड।
  नमूना बहुत नाज़ुक होता है, इसलिए उसे अत्यंत सावधानी से संभालना आवश्यक है: प्रसंस्करण में देरी कम से कम करें और ऊतक को काटकर निकालने के तुरंत बाद उसका अगला प्रसंस्करण शुरू करें। स्वलयन और अपघटन को रोकने के लिए यह अत्यंत महत्वपूर्ण है। ऊतक को कमरे के तापमान पर रखें; उसे जमाने से बचें, क्योंकि इससे बर्फ के क्रिस्टल बन सकते हैं और ऊतक को क्षति पहुँच सकती है।
• ऊतक स्थिरीकरण
  सबसे पहले, ऊतक को स्थिरीकारक विलयन से उपचारित किया जाता है: 10% उदासीन बफ़रयुक्त फ़ॉर्मेलिन (NBF) का उपयोग करें, जो पानी में 4% फ़ॉर्मेल्डिहाइड के समतुल्य है और जिसे उदासीन pH पर बफ़र किया गया है।
  ऊतक को फ़ॉर्मेलिन में पूरी तरह डुबोएँ। स्थिरीकारक और ऊतक के आयतन का अनुपात कम से कम 10:1 सुनिश्चित करें। ऊतक के प्रकार और आकार के आधार पर स्थिरीकरण का समय आम तौर पर 6 से 24 घंटे होता है। यह महत्वपूर्ण है कि स्थिरीकारक पूरे ऊतक में अच्छी तरह प्रवेश कर सके। हालाँकि, अत्यधिक स्थिरीकरण से क्रॉस-लिंकिंग हो सकती है, जो प्रतिजन पुनर्प्राप्ति को जटिल बनाती है, जबकि अपर्याप्त स्थिरीकरण के परिणामस्वरूप ऊतक का संरक्षण खराब हो सकता है।
• ऊतक की काट-छाँट
  दूसरे, स्थिरीकारक के पर्याप्त प्रवेश के लिए ऊतक को काट-छाँटकर लगभग 3–5 mm मोटा करें। संबंधित ऊतकवैज्ञानिक संरचनाओं को शामिल करने के लिए ऊतक का उचित अभिविन्यास सुनिश्चित करें। इससे बाद में विश्लेषण के लिए ऊतक का उपयोग करते समय निष्कर्षण प्रक्रिया सुगम होती है।
• स्थिर किए गए नमूने का प्रसंस्करण
  अब, स्थिर किए गए ऊतक का निर्जलीकरण करना आवश्यक है: स्थिरीकरण के बाद, पैराफिन मोम का पूरे ऊतक में अच्छी तरह प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए ऊतक का निर्जलीकरण आवश्यक है। पानी निकालने के लिए ऊतक को एथेनॉल की क्रमिक सांद्रताओं (70%, 80%, 90% और 100%) से गुज़ारें।
  ज़ाइलीन से क्लियरिंग: पैराफिन मोम पानी में अघुलनशील है, लेकिन ज़ाइलीन में घुलनशील है। इसलिए, ऊतक में मौजूद पानी को ज़ाइलीन से प्रतिस्थापित करना आवश्यक है। हालाँकि, ज़ाइलीन स्वयं पानी में अघुलनशील है, लेकिन अल्कोहल में घुलनशील है, इसलिए एक मध्यवर्ती चरण आवश्यक है, जिसमें पहले पानी को अल्कोहल से प्रतिस्थापित किया जाता है। एथेनॉल निकालने और ऊतक को पैराफिन के अंतःप्रवेश के लिए तैयार करने हेतु ऊतक को ज़ाइलीन या ज़ाइलीन के किसी विकल्प में डुबोएँ।
  पैराफिन का अंतःप्रवेश: ऊतक को पिघले हुए पैराफिन मोम में अंतःस्थापित करें और पूर्ण अंतःप्रवेश सुनिश्चित करें। इस चरण में आम तौर पर पैराफिन को कई बार बदला जाता है, ताकि वह पूरे ऊतक में अच्छी तरह समा जाए।
• ऊतक का अंतःस्थापन
  इस चरण में, ऊतक को साँचे में रखकर एक ऊतक ब्लॉक बनाया जाता है: ऊतक को वांछित अभिविन्यास में साँचे में रखें और उसके ऊपर पिघला हुआ पैराफिन डालें। कमरे के तापमान पर या ठंडी प्लेट पर ठंडा करके पैराफिन को जमने दें।
• खंड काटना और माउंटिंग
  माइक्रोटोमी: अंतःस्थापित ऊतक को काटने के लिए माइक्रोटोम का उपयोग करके पैराफिन ब्लॉक से पतले खंड (आम तौर पर 4–5 माइक्रोमीटर) काटें। फिर बाद के अभिरंजन और सूक्ष्मदर्शीय विश्लेषण के लिए इन खंडों को काँच की स्लाइडों पर रखकर नमूने की माउंटिंग की जाती है।
  अंत में, ऊतकवैज्ञानिक गुणवत्ता की जाँच करें: उचित स्थिरीकरण और प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए शुरुआती खंडों का सूक्ष्मदर्शी से मूल्यांकन करें। ऊतक के प्रकार और देखी गई गुणवत्ता के आधार पर आवश्यकतानुसार प्रोटोकॉल में समायोजन करें।

 
FFPE ऊतकों का उपयोग RNA, DNA और प्रोटीन प्राप्त करने के साथ-साथ कैंसर या अन्य रोग के संकेतों का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। इन्हें वर्षों तक संग्रहीत किया जा सकता है, और ये शोधकर्ताओं तथा चिकित्सकों द्वारा निदान और अनुसंधान के लिए ऊतक नमूनों के उपयोग का एक आवश्यक हिस्सा हैं।

FFPE ऊतकों से जुड़ी सामान्य समस्याएँ और चुनौतियाँ क्या हैं?

फॉर्मेलिन से स्थिरीकृत, पैराफिन में एम्बेड किए गए (FFPE) ऊतक नमूनों का अनुसंधान और निदान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन इनसे जुड़ी कई चुनौतियाँ और सामान्य समस्याएँ हैं:

• जैव-अणुओं का अपघटन: लंबे समय तक स्थिरीकरण से DNA, RNA और प्रोटीन का अपघटन हो सकता है, जिससे आगे के अनुप्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक अम्ल या प्रोटीन निकालना कठिन हो जाता है। ऊतक संरक्षण के लिए सही स्थिरीकरण (अपर्याप्त और अत्यधिक स्थिरीकरण से बचना) आवश्यक है।

क्रॉस-लिंकिंग: फॉर्मेलिन स्थिरीकरण से प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्लों की क्रॉस-लिंकिंग होती है, जो आणविक विश्लेषण में बाधा डाल सकती है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तथा अन्य परीक्षणों की सटीकता को प्रभावित कर सकती है।

• प्रतिजन स्थलों का ढक जाना: स्थिरीकरण प्रक्रिया प्रतिजन स्थलों को ढक सकती है, जिससे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अन्य प्रतिरक्षाविज्ञानी परीक्षणों में प्रतिरक्षी बंधन की प्रभावशीलता कम हो जाती है। इसके लिए अक्सर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता होती है, जो एक ऐसी प्रक्रिया है जिसके माध्यम से एपिटोप का आवरण हटाया जाता है और एपिटोप-प्रतिरक्षी बंधन बहाल किया जाता है। हालाँकि, पूर्ण प्रतिजनता हमेशा बहाल हो सके, यह आवश्यक नहीं है।
• स्थिरीकरण की गुणवत्ता में भिन्नता: स्थिरीकरण के समय और परिस्थितियों में अंतर से नमूने की गुणवत्ता में असंगति आ सकती है, जिससे परिणामों की पुनरुत्पादकता और तुलनीयता प्रभावित होती है। विश्वसनीय स्थिरीकरण प्रोटोकॉल का उपयोग करें और अपर्याप्त तथा अत्यधिक स्थिरीकरण से बचें।
• DNA की क्षति और विखंडन: FFPE नमूनों का फॉर्मेलिन स्थिरीकरण विभिन्न प्रकार की DNA क्षति का कारण बन सकता है, जिनमें साइटोसिन का विअमीनीकरण (C से T उत्परिवर्तन), ऑक्सीकरण संबंधी क्षति (जैसे, 8-oxo-guanine के कारण G से T उत्परिवर्तन), साथ ही निक्स, अंतराल और क्षारक-विहीन स्थलों जैसे भौतिक व्यवधान शामिल हैं, जो DNA पॉलीमरेज़ की गतिविधि में बाधा डालते हैं। फॉर्मेलिन स्थिरीकरण प्रक्रिया DNA के विखंडन का कारण बन सकती है, जिससे PCR और अनुक्रमण जैसे आनुवंशिक तथा जीनोमिक विश्लेषण जटिल हो जाते हैं।
• RNA की गुणवत्ता: FFPE ऊतकों से निकाला गया RNA अक्सर विखंडित और रासायनिक रूप से संशोधित होता है, जिससे उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है।
• प्रोटीन में संशोधन: फॉर्मेलिन प्रोटीन में रासायनिक संशोधन उत्पन्न कर सकता है, जिससे उनकी संरचना और कार्य प्रभावित होते हैं, और इससे प्रोटीओमिक विश्लेषण में बाधा आ सकती है।
• नमूना प्रसंस्करण से उत्पन्न आर्टिफैक्ट: एम्बेडिंग और ऊतक खंड काटने की प्रक्रिया के दौरान यांत्रिक तनाव और ऊष्मा आर्टिफैक्ट उत्पन्न कर सकते हैं और ऊतक को अतिरिक्त क्षति पहुँचा सकते हैं।
• बैचों के बीच परिवर्तनशीलता: विभिन्न बैचों के बीच स्थिरीकरण और एम्बेडिंग प्रोटोकॉल में अंतर से परिणामों में उल्लेखनीय परिवर्तनशीलता आ सकती है, जिससे अध्ययनों के बीच तुलना जटिल हो जाती है।
• भंडारण संबंधी समस्याएँ: FFPE ब्लॉकों के दीर्घकालिक भंडारण से समय के साथ अतिरिक्त अपघटन और न्यूक्लिक अम्लों की अखंडता में कमी आ सकती है, जिससे पूर्वव्यापी अध्ययनों के लिए संग्रहित नमूनों की उपयोगिता प्रभावित होती है।

अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग, नमूनों का सावधानीपूर्वक प्रबंधन और उन्नत तकनीकों का अनुप्रयोग FFPE ऊतकों से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता और विश्वसनीयता में सुधार करने में सहायता करते हैं।

FFPE और जमे हुए ऊतक में क्या अंतर है?

FFPE (फॉर्मेलिन से स्थिरीकृत, पैराफिन में एम्बेड किए गए) ऊतक को संरक्षित करने के लिए पहले फॉर्मेलिन से स्थिरीकृत किया जाता है और फिर पैराफिन मोम में एम्बेड किया जाता है, जिससे ऊतक की आकारिकी बनाए रखते हुए कमरे के तापमान पर दीर्घकालिक भंडारण संभव होता है। इसके विपरीत, जमे हुए ऊतक को जमाकर तेजी से संरक्षित किया जाता है, जिससे न्यूक्लिक अम्लों और प्रोटीन की अखंडता बेहतर बनी रहती है, लेकिन इसके लिए बहुत कम तापमान पर भंडारण आवश्यक होता है।

FFPE एम्बेडिंग के लिए किन रसायनों का उपयोग किया जाता है?

FFPE अंतःस्थापन में प्रयुक्त रसायनों में सामान्यतः स्थिरीकरण के लिए फॉर्मेलिन और अंतःस्थापन के लिए पैराफिन मोम शामिल होते हैं। FFPE अंतःस्थापन के लिए ऊतकों को आमतौर पर या तो 10% (v/v) उदासीन बफरयुक्त फॉर्मेलिन (FA) या पैराफॉर्मेल्डिहाइड पाउडर से ताज़ा तैयार किए गए 4% (w/v) फॉर्मेल्डिहाइड विलयन (PFA) से स्थिर किया जाता है। फॉर्मेलिन, जो पानी में फॉर्मेल्डिहाइड का विलयन है, को ऊतकों की आकारिकी संरक्षित रखने और अत्यधिक क्रॉस-लिंकिंग रोकने के लिए बफर की सहायता से उदासीन pH पर रखा जाता है। पैराफॉर्मेल्डिहाइड आधारित विलयन भी प्रोटीनों की क्रॉस-लिंकिंग करके प्रभावी स्थिरीकरण प्रदान करता है, जिससे बाद में पैराफिन मोम में अंतःस्थापन के लिए ऊतक संरचना स्थिर हो जाती है। ये रसायन स्थिरीकरण और अंतःस्थापन प्रक्रिया के दौरान ऊतकों की अखंडता और आकारिकी बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं।

FFPE नमूनों से पैराफिन कैसे हटाया जाता है?

FFPE नमूनों से पैराफिन हटाने के लिए ऊतक खंडों को आमतौर पर ज़ाइलीन से कई बार धोया जाता है, जिसके बाद क्रमिक सांद्रताओं वाले अल्कोहल और अंत में पानी से उनका पुनर्जलीकरण किया जाता है। चूँकि ज़ाइलीन अत्यधिक विषैला होता है और इससे श्वसन संबंधी समस्याओं, त्वचा में जलन तथा बार-बार संपर्क में आने पर संभावित दीर्घकालिक प्रभावों जैसे स्वास्थ्य जोखिम उत्पन्न होते हैं, इसलिए कई प्रयोगशालाओं में अल्ट्रासोनिक विधि से पैराफिन हटाना एक आशाजनक विकल्प के रूप में उभर रहा है। यह विधि ज़ाइलीन जैसे विषैले विलायकों की आवश्यकता के बिना पैराफिन को कुशलतापूर्वक और सुरक्षित रूप से हटाने के लिए तीव्र अल्ट्रासोनिक तरंगों का उपयोग करती है, जिससे प्रयोगशाला कर्मियों के लिए जोखिम कम होता है और अधिक सुरक्षित कार्य वातावरण बनता है।

FFPE नमूनों की अच्छी गुणवत्ता के लिए मुझे अपने ऊतकों का स्थिरीकरण कितनी देर तक करना चाहिए?

स्थिरीकरण की अवधि संबंधी सामान्य अनुशंसाएँ आमतौर पर ऊतक नमूनों को फॉर्मेलिन में 24 से 48 घंटे तक स्थिर करने का सुझाव देती हैं। यह अवधि सामान्यतः ऊतकों की आकारिकी और कोशिकीय संरचनाओं को संरक्षित रखने के लिए पर्याप्त होती है और साथ ही अतिस्थिरीकरण को न्यूनतम रखती है, जिससे अत्यधिक क्रॉस-लिंकिंग तथा न्यूक्लिक अम्लों और प्रोटीनों का अपघटन हो सकता है। हालाँकि, स्थिरीकरण का इष्टतम समय ऊतक के आकार और प्रकार के अनुसार बदल सकता है, और छोटे या अधिक नाज़ुक नमूनों के लिए स्थिरीकरण की कम अवधि आवश्यक होती है। ऊतकों के स्वलयन और अपघटन को रोकने के लिए पर्याप्त स्थिरीकरण करने तथा लंबे समय तक स्थिरीकरण से बचने के बीच संतुलन रखना अत्यंत आवश्यक है, क्योंकि लंबे समय तक स्थिरीकरण आगे के आणविक विश्लेषणों को जटिल बना सकता है।