Désagrégation cellulaire par ultrasons d'échantillons bactériens

Les échantillons bactériens se présentent rarement sous la forme de véritables suspensions unicellulaires. Les cultures se développent en chaînes et en flocs, les isolats environnementaux forment des agrégats liés par des substances polymériques extracellulaires, et les culots centrifugés résistent souvent à la remise en suspension malgré un agitation vigoureuse au vortex. Le comptage des cellules viables, la densité optique, la cytométrie en flux et le profilage du microbiome partent tous du principe qu’une particule équivaut à une cellule. La désagrégation cellulaire par ultrasons résout ce problème : de courtes salves de sonication contrôlées séparent les agrégats en cellules individuelles sans les lyser.

Pourquoi l'agrégation cellulaire fausse vos résultats

L'agrégation est un phénomène biologique et non une erreur de préparation. Les staphylocoques, les streptocoques, les lactobacilles, les actinomycètes et de nombreuses espèces environnementales se développent sous forme de chaînes, d'amas ou de fragments de biofilm, et l'ADN extracellulaire ainsi que les polysaccharides lient les cellules entre elles dans les culots et les éluats de prélèvements. Les conséquences analytiques sont systématiques :

• Le nombre de colonies est sous-estimé, car un amas donne lieu à une seule colonie, quel que soit le nombre de cellules qu'il contient.
• La densité optique et les compteurs de particules mesurent les agrégats plutôt que les cellules, ce qui fausse les courbes de croissance.
• La cytométrie en flux et le tri cellulaire comptabilisent de manière erronée les événements agglomérés et les excluent de l'analyse.
• Les extractions d'ADN et de protéines ne concernent que les cellules présentes à la surface de l'agrégat, ce qui fausse les données relatives au microbiome et aux omiques.

Les méthodes traditionnelles sont lentes, incomplètes ou entraînent des altérations chimiques. Les opérations intensives de pipetage et d'agitation au vortex laissent des micro-agrégats. La dispersion enzymatique ou à base de chélateurs modifie la surface cellulaire que vous souhaitez analyser. La désagrégation mécanique par cavitation contrôlée agit en quelques secondes et ne nécessite aucun additif.

Comment la sonication désagrège les cellules sans les lyser

La désagrégation cellulaire par ultrasons exploite une différence de résistance mécanique. Les agrégats bactériens sont maintenus ensemble par des liaisons intercellulaires relativement faibles et une matrice extracellulaire, tandis qu’une enveloppe cellulaire intacte résiste à des contraintes de cisaillement nettement plus élevées. Lorsque des ultrasons calibrés pénètrent dans la suspension, la cavitation acoustique génère des micro-courants, des impulsions de pression et des forces de cisaillement qui agissent d’abord au niveau des interfaces des agrégats. Les amas, les chaînes et les fragments de biofilm sont séparés par cisaillement (désagglomération) avant que le niveau d’énergie à partir duquel les membranes se rompent (lyse) ne soit atteint.

Désagrégation par ultrasons d'agrégats de cellules bactériennes

Désagrégation ou lyse – L'importance des paramètres de sonication

En pratique, cela signifie que la désagrégation et la lyse sont réalisées à l'aide du même appareil, mais avec des paramètres différents. À amplitude modérée, avec des cycles d'impulsion courts et une température contrôlée, on obtient une suspension de cellules individuelles viables. En augmentant l'amplitude, le temps d'exposition ou la température de l'échantillon, le processus évolue vers une rupture cellulaire complète, permettant ainsi d'atteindre des cibles intracellulaires. Les générateurs Hielscher vous permettent de régler avec précision l'amplitude, la puissance, l'impulsion et l'apport d'énergie, puis d'enregistrer la méthode, ce qui garantit la reproductibilité de l'étape de désagrégation d'un échantillon à l'autre, d'un opérateur à l'autre et d'une série d'essais à l'autre.

Sonication sans contact efficace

La sonication en bain ne peut rivaliser avec ce niveau de contrôle. Les bains et cuves de nettoyage par ultrasons ne fournissent qu’une faible énergie ultrasonique, ce qui entraîne une préparation incomplète ; de plus, la cavitation se produit de manière inégale, de sorte que chaque tube est traité en fonction de sa position dans le bain. Le VialTweeter transmet des forces ultrasoniques intenses et focalisées directement à travers la paroi du récipient vers jusqu’à 10 échantillons scellés simultanément. Les traitements qui nécessitent une exposition longue et variable dans un bain sont réalisés selon un schéma d’impulsions standardisé.
Les sonicateurs sans contact Hielscher émettent des ultrasons intenses et focalisés à travers les parois des flacons fermés. Le VialTweeter traite jusqu’à 10 flacons simultanément avec une intensité identique, sans sonde dans l’échantillon, sans contamination croisée et sans libération d’aérosols. Lorsque le débit l'exige, les sonicateurs pour microplaques UIP400MTP et UIP550MTP étendent ce même transfert d'énergie contrôlé aux plaques multipuits.

Avantages de la désagrégation par ultrasons sans contact

• Aucune contamination croisée : Comme les flacons restent hermétiquement fermés et qu’aucune sonde n’est immergée dans l’échantillon, la contamination croisée et la perte d’échantillon sont totalement évitées. Il n’y a rien à stériliser entre deux échantillons, et un cycle ne peut pas affecter le suivant.
• Protection contre les aérosols : La sonication à sonde ouverte génère des aérosols infectieux et contamine les surfaces des instruments. La sonication en flacon hermétique confine l'échantillon à l'intérieur de son propre tube, ce qui est important lors de la manipulation de bactéries pathogènes telles que *Mycobacterium tuberculosis* et d'autres agents de niveau de sécurité biologique 2 (BSL-2) ou 3 (BSL-3).
• Pas d'érosion des pourboires : Les sondes en titane peuvent libérer une petite quantité de microparticules dans l'échantillon pendant leur fonctionnement. Ces particules modifient la densité optique et le nombre de particules en aval. La sonication indirecte à travers la paroi du récipient élimine totalement cette source de particules solides.
• Débit constant : Le VialTweeter délivre la même intensité ultrasonore à chacun des 10 flacons maximum, ce qui garantit des résultats de sonication homogènes et reproductibles. Les effets liés à la position, qui posent problème avec les bains ultrasoniques et les sondes à échantillon unique, disparaissent, et vos valeurs de référence restent comparables d’un essai à l’autre.
• Intégrité de l'échantillon : les tubes restent fermés tout au long du traitement, ce qui empêche toute contamination, altération ou volatilisation de l'échantillon. Les petits volumes peuvent être analysés sans dilution, y compris les sédiments cliniques précieux qui ne supportent pas d'étape de transfert supplémentaire.
• Contrôle des processus : L'amplitude est réglable de 20 à 100 %, le mode pulsé de 0 à 100 %, et les systèmes prennent en charge la surveillance de la température afin que les souches et protéines thermosensibles restent en dessous des seuils susceptibles de les endommager.

Applications typiques

• Analyse du microbiome et du contenu intestinal : disperser les Lactobacillus, les Bifidobacterium et les échantillons fécaux avant la mise en culture ou le séquençage, afin que les agrégats ne faussent pas les résultats quantitatifs.
• Microbiologie des aliments et de l'eau : désagrégation des flocs dans les prélèvements par écouvillonnage, les rinçages et les bouillons d'enrichissement pour une détermination précise du nombre de colonies et de la viabilité.
• Recherche sur les biofilms : récupération de cellules à partir de supports et de surfaces sous forme de suspensions unicellulaires, sans traitement enzymatique susceptible d'éliminer les protéines de surface.
• Diagnostic clinique : remise en suspension d'expectorations, de pus et d'éluats de prélèvements par écouvillon dans des conditions de confinement.
• Culture cellulaire : séparation des agrégats de cellules de mammifères, d'insectes et de cellules CHO avant le comptage et le repiquage.
• Préparation couvrant l’ensemble du processus : le même appareil qui effectue une désagrégation à faible amplitude permet également une disruption cellulaire complète à des réglages plus élevés, de sorte que la lyse, l’extraction des protéines et la fragmentation de l’ADN s’enchaînent sans transfert entre tubes.

Littérature / Références