Protocole de dosage de la concentration minimale inhibitrice (CMI)

L'essai de concentration minimale inhibitrice (CMI) basé sur le biofilm est une méthode essentielle pour évaluer l'efficacité des agents antimicrobiens contre les micro-organismes associés au biofilm, qui présentent une résistance accrue en raison de leur matrice extracellulaire protectrice. Une étape cruciale de cet essai est la rupture des structures du biofilm afin de libérer les cellules incrustées pour une évaluation précise de la viabilité. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP facilite ce processus en utilisant des ultrasons focalisés pour générer une cavitation contrôlée, détachant efficacement les cellules du biofilm et les dispersant dans une suspension uniforme. Cette perturbation précise et reproductible du biofilm améliore la fiabilité et le rendement des essais MIC, faisant de l'UIP400MTP un outil essentiel pour faire avancer la recherche sur le biofilm.

Sonication pour le détachement du biofilm

L'essai CMI sur biofilm mesure généralement la viabilité bactérienne ou l'inhibition de la croissance à l'aide de méthodes telles que l'ensemencement, le comptage des colonies ou les mesures de densité optique. La sonication est une étape critique dans les tests CMI basés sur les biofilms lorsqu'il s'agit d'évaluer la sensibilité aux antimicrobiens des micro-organismes associés aux biofilms. Sa fonction première est de détacher et de disperser les cellules incluses dans la matrice du biofilm en une suspension uniforme pour une analyse précise.
Les biofilms sont nettement plus résistants aux agents antimicrobiens que les cellules planctoniques, d'où l'importance d'un détachement correct pour une analyse précise. Au cours de ce processus, les ondes ultrasoniques génèrent une cavitation contrôlée, brisant la matrice du biofilm et libérant les cellules incorporées dans une suspension uniforme dans le milieu de récupération. Cette étape permet d'évaluer avec précision la viabilité des cellules dispersées dans le biofilm par des méthodes telles que l'ensemencement, la dilution et le comptage des colonies. La désintégration correcte du biofilm par sonication empêche les composants résiduels de la matrice de protéger les cellules, ce qui pourrait conduire à une sous-estimation de l'activité antimicrobienne. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP est particulièrement bien adapté à cet objectif, car il offre des conditions de sonication précises et reproductibles qui garantissent une préparation fiable et à haut débit des plaques d'essai.

Pourquoi la sonication est-elle nécessaire dans les essais de concentration minimale inhibitrice basés sur les biofilms ?

Pour les mesures de viabilité et le comptage des cellules, un détachement et une dispersion complets et fiables des cellules individuelles sont nécessaires. L'UIP400MTP favorise un détachement uniforme et non dommageable du biofilm et une dispersion des cellules pour des résultats d'essai robustes.

• Complexité du biofilm : Les biofilms sont des communautés microbiennes structurées enfermées dans une matrice de substance polymère extracellulaire (EPS), qui protège les micro-organismes et les rend plus résistants aux agents antimicrobiens.
• Dispersion uniforme : Pour mesurer avec précision la viabilité des cellules incluses dans le biofilm ou leur sensibilité aux antimicrobiens, le biofilm doit d'abord être délogé et décomposé en une suspension homogène.

Protocole d'essai de concentration minimale inhibitrice basé sur le biofilm

Le dosage de la concentration minimale inhibitrice (CMI) détermine la concentration la plus faible d'un agent antimicrobien nécessaire pour inhiber la croissance visible des micro-organismes. Ce protocole est conçu pour les micro-organismes associés à un biofilm, en utilisant le sonificateur de plaques multipuits UIP400MTP pour la désintégration du biofilm.

Étape 1 : Préparation de l'inoculum bactérien

1. Préparer la suspension bactérienne :
   Cultiver des bactéries dans des milieux appropriés jusqu'à la phase logarithmique moyenne.
   Diluer la culture pour obtenir une densité cellulaire normalisée (par exemple, 0,5 McFarland standard ou OD600 ~0,1).
2. Préparer des solutions antimicrobiennes :
   Diluer l'agent antimicrobien dans un milieu approprié pour créer une gamme de concentrations (par exemple, dilutions en série deux fois plus importantes).
3. Distribuer dans la plaque de 96 puits :
   Ajouter les solutions antimicrobiennes dans les puits d'une plaque standard à 96 puits, avec un volume final de ~150-200 µl.
   Inclure des contrôles de croissance (pas d'antimicrobien) et des contrôles de stérilité (pas d'inoculum bactérien).

Étape 2 : Formation d'un biofilm sur le couvercle de l'aiguille

• Fixer le couvercle à piquet :
  Placer le couvercle spécialisé sur les puits inoculés, en veillant à ce que les chevilles soient entièrement immergées dans la suspension bactérienne.
• Incuber la plaque :
  Incuber à la température appropriée (par exemple, 37°C) pendant une durée déterminée (par exemple, 24 heures) dans des conditions statiques pour permettre la formation d'un biofilm sur les chevilles.

Étape 3 : Exposition aux antimicrobiens

• Rincer les chevilles :
  Retirer le couvercle de la suspension bactérienne et rincer doucement dans une solution saline stérile ou du PBS afin d'éliminer les cellules planctoniques non fixées.
• Exposition aux antimicrobiens :
  Transférer l'opercule dans une nouvelle plaque de 96 puits contenant les dilutions antimicrobiennes préparées précédemment.
  Incuber pendant une période définie (par exemple, 24 heures) dans des conditions statiques pour permettre à l'agent antimicrobien d'agir sur les biofilms.

Étape 4 : Sonication avec le sonificateur de microplaques UIP400MTP

L'étape de sonication est essentielle pour détacher les biofilms des couvercles des piquets afin d'évaluer la viabilité. Suivez les étapes suivantes pour le sonicateur UIP400MTP :

1. Préparer l'installation :
   Remplir chaque puits d'une nouvelle plaque à 96 puits avec du milieu de récupération (par exemple, du bouillon de neutralisation ou du milieu de croissance stérile).
2. Transférer le couvercle de la cheville :
   Retirer le couvercle de la plaque de traitement antimicrobien.
   Rincer le couvercle de la cheville dans du sérum physiologique stérile ou du PBS pour éliminer les agents antimicrobiens résiduels.
3. Placer la plaque dans le sonicateur :
   Fixer le couvercle à piquet à la plaque de milieu de récupération.
   Placer la plaque de milieu de récupération dans le sonicateur UIP400MTP, en veillant à ce que la plaque soit centrée et stable, comme indiqué dans le manuel.
4. Ajuster les paramètres de sonication :
   Régler les paramètres de sonication sur l'UIP400MTP (les réglages peuvent être adaptés au biofilm) :
   Amplitude : 70-100%.
   Durée de sonication : 1-3 minutes (à ajuster en fonction de la structure du biofilm) en mode cycle.
5. Sonicate :
   Lancez le processus de sonication. Les ondes ultrasoniques vont perturber la matrice du biofilm et déloger les cellules dans le milieu de récupération.
6. Contrôler le processus :
   Utilisez le capteur de température enfichable pour surveiller la température de l'échantillon dans les puits. L'UIP400MTP peut être connecté à un refroidisseur de laboratoire pour le refroidissement.
7. Traitement post-sonication :
   Transférer immédiatement le milieu de récupération contenant les biofilms détachés dans une nouvelle plaque stérile pour analyse ultérieure.

(A) Plaque contenant de la TSB avec 2% de glucose utilisée pour la formation de biofilms, la récupération de cellules et la détermination de la CMI et de la CMEB ; (B) Couvercle avec épingles pour la formation de biofilms staphylococciques.
Les cellules du biofilm formées sur les broches ont été délogées par sonication (Hielscher Ultrasound Technology) pendant 5 minutes dans des plaques à 96 puits contenant un milieu de culture frais pour la récupération des cellules.
(Image et étude : ©de Oliveira et al., 2016)

Étape 4 : Évaluation de la viabilité

Plaque et culture de biofilms détachés :

1. Effectuer des dilutions en série du milieu de récupération et ensemencer sur gélose pour dénombrer les unités formant des colonies (UFC).
2. Évaluer le MIC :
   Déterminer la CMI comme étant la concentration antimicrobienne la plus faible qui inhibe complètement la croissance microbienne visible dans le milieu de récupération.

CMI Concentration minimale inhibitrice : Exemple de plaque de microtitration et interprétation des résultats de la microdilution.
(Étude et image : ©Jaskiewicz et al. 2019)

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Lisez ici comment l'UIP400MTP est utilisé pour le détachement du biofilm dans le cadre du protocole ASTM E2799. – Test d'efficacité des désinfectants contre le biofilm de Pseudomonas aeruginosa à l'aide du test MBEC.