Protocole d’essai de concentration minimale inhibitrice (CMI)

L’essai de concentration minimale inhibitrice (CMI) sur biofilm est une méthode essentielle pour évaluer l’efficacité des agents antimicrobiens contre les micro-organismes associés aux biofilms, qui présentent une résistance accrue en raison de leur matrice extracellulaire protectrice. Une étape cruciale de cet essai est le détachement des structures du biofilm afin de libérer les cellules incluses pour une évaluation précise de la viabilité. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP facilite ce processus en utilisant des ultrasons focalisés pour générer une cavitation contrôlée, ce qui permet de déloger efficacement les cellules du biofilm et de les disperser en une suspension homogène. Cette désagrégation précise et reproductible du biofilm améliore la fiabilité et la cadence de traitement des échantillons des essais de CMI, faisant de l’UIP400MTP un outil essentiel pour faire progresser la recherche sur les biofilms.

Pourquoi utiliser la sonication lors des essais de CMI ?

• Des données précises et reproductibles : Obtenez des suspensions cellulaires homogènes qui éliminent l’effet protecteur de la matrice, afin que vos numérations de colonies et vos mesures de densité optique reflètent réellement l’efficacité antimicrobienne.
• Efficacité à haut débit : Traitez une plaque 96 puits entière simultanément en seulement 1–3 minutes, en remplaçant le grattage manuel, lent et irrégulier, par un flux de travail rationalisé.
• Viabilité cellulaire préservée : Délogez en douceur les cellules incluses sans les dommages physiques causés par le grattage, en maintenant des taux de survie plus élevés pour des calculs de CMI/MBEC fiables.
• Zéro risque de contamination croisée : Profitez d’une conception cup-horn sans contact qui traite tous les puits de manière uniforme, sans qu’aucune sonde ne touche les échantillons ou les puits individuels.
• Conformité aux normes : Alignez votre méthodologie sur des protocoles industriels validés tels que l’ASTM E2799-22, pour donner à vos données une plus grande crédibilité à des fins réglementaires ou de publication.
• Criblage fiable de médicaments et de traitements : Fiez-vous à vos résultats de sensibilité pour prendre des décisions plus éclairées concernant l’efficacité antimicrobienne, le profilage de la résistance ou le développement thérapeutique.

Sonication pour le détachement des biofilms

L’essai de CMI sur biofilm mesure généralement la viabilité bactérienne ou l’inhibition de la croissance à l’aide de méthodes telles que l’ensemencement sur boîte, la numération des colonies ou les mesures de densité optique. La sonication est une étape critique des essais de CMI sur biofilm lors de l’évaluation de la sensibilité antimicrobienne des micro-organismes associés aux biofilms. Sa fonction principale est de détacher et de disperser les cellules incluses dans la matrice du biofilm en une suspension homogène pour une analyse précise.
Les biofilms sont nettement plus résistants aux agents antimicrobiens que les cellules planctoniques, ce qui rend un détachement adéquat essentiel pour une analyse précise. Au cours de ce processus, les ondes ultrasonores génèrent une cavitation contrôlée qui désagrège la matrice du biofilm et libère les cellules incluses en une suspension homogène dans le milieu de récupération. Cette étape permet des évaluations précises de la viabilité des cellules dispersées du biofilm par des méthodes telles que l’ensemencement sur boîte, la dilution et la numération des colonies. Une désagrégation adéquate du biofilm par sonication empêche les composants résiduels de la matrice de protéger les cellules, ce qui pourrait sinon conduire à une sous-estimation de l’activité antimicrobienne. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP est particulièrement adapté à cet usage, car il offre des conditions de sonication précises et reproductibles garantissant une préparation fiable et à haut débit des plaques d’essai.

Pourquoi la sonication est nécessaire dans les essais de concentration minimale inhibitrice sur biofilm

Pour les mesures de viabilité et la numération cellulaire, un détachement et une dispersion complets et fiables en cellules individuelles sont nécessaires. L’UIP400MTP favorise un détachement des biofilms et une dispersion cellulaire uniformes et non dommageables pour des résultats d’essai robustes.

• Complexité des biofilms : Les biofilms sont des communautés microbiennes structurées enveloppées dans une matrice de substances polymériques extracellulaires (EPS), qui protège les micro-organismes et les rend plus résistants aux agents antimicrobiens.
• Dispersion homogène : Pour mesurer avec précision la viabilité des cellules incluses dans le biofilm ou leur sensibilité aux antimicrobiens, le biofilm doit d’abord être délogé et désagrégé en une suspension homogène.

Protocole d’essai de concentration minimale inhibitrice sur biofilm

L’essai de concentration minimale inhibitrice (CMI) détermine la plus faible concentration d’un agent antimicrobien nécessaire pour inhiber la croissance visible des micro-organismes. Ce protocole est conçu pour les micro-organismes associés aux biofilms et utilise le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP pour la désagrégation des biofilms.

Étape 1 : Préparation de l’inoculum bactérien

1. Préparer la suspension bactérienne :
   Cultiver les bactéries dans un milieu approprié jusqu’à la mi-phase logarithmique.
   Diluer la culture pour obtenir une densité cellulaire standardisée (p. ex. standard McFarland 0,5 ou OD600 ~0,1).
2. Préparer les solutions antimicrobiennes :
   Diluer l’agent antimicrobien dans un milieu approprié pour obtenir une gamme de concentrations (p. ex. dilutions sériées au demi).
3. Répartir dans la plaque 96 puits :
   Ajouter les solutions antimicrobiennes dans les puits d’une plaque 96 puits standard, avec un volume final par puits de ~150–200 µL.
   Inclure des témoins de croissance (sans antimicrobien) et des témoins de stérilité (sans inoculum bactérien).

Étape 2 : Formation du biofilm sur le couvercle à picots

• Mettre en place le couvercle à picots :
  Placer le couvercle à picots spécifique sur les puits inoculés, en veillant à ce que les picots soient entièrement immergés dans la suspension bactérienne.
• Incuber la plaque :
  Incuber à la température appropriée (p. ex. 37°C) pendant une durée déterminée (p. ex. 24 heures) en conditions statiques pour permettre la formation du biofilm sur les picots.

Étape 3 : Exposition aux antimicrobiens

• Rincer les picots :
  Retirer le couvercle à picots de la suspension bactérienne et le rincer délicatement dans une solution saline stérile ou du PBS afin d’éliminer les cellules planctoniques faiblement fixées.
• Exposer aux antimicrobiens :
  Transférer le couvercle à picots dans une nouvelle plaque 96 puits contenant les dilutions d’antimicrobien préparées précédemment.
  Incuber pendant une durée définie (p. ex. 24 heures) en conditions statiques pour permettre à l’agent antimicrobien d’agir sur les biofilms.

Étape 4 : Sonication avec le sonicateur pour microplaques UIP400MTP

L’étape de sonication est essentielle pour détacher les biofilms des couvercles à picots afin d’en évaluer la viabilité. Suivez ces étapes pour le sonicateur UIP400MTP :

1. Préparer le montage :
   Remplir chaque puits d’une nouvelle plaque 96 puits avec du milieu de récupération (p. ex. bouillon neutralisant ou milieu de culture stérile).
2. Transférer le couvercle à picots :
   Retirer le couvercle à picots de la plaque de traitement antimicrobien.
   Rincer le couvercle à picots dans une solution saline stérile ou du PBS afin d’éliminer les agents antimicrobiens résiduels.
3. Positionner la plaque dans le sonicateur :
   Fixer le couvercle à picots sur la plaque contenant le milieu de récupération.
   Placer la plaque contenant le milieu de récupération dans le sonicateur UIP400MTP, en veillant à ce qu’elle soit centrée et stable, comme décrit dans le manuel.
4. Régler les paramètres de sonication :
   Régler les paramètres de sonication sur l’UIP400MTP (les réglages peuvent être adaptés au biofilm) :
   Amplitude : 70–100%.
   Durée de sonication : 1–3 minutes (à ajuster selon la structure du biofilm) en mode cycle.
5. Soniquer :
   Démarrer le processus de sonication. Les ondes ultrasonores désagrègent la matrice du biofilm et délogent les cellules dans le milieu de récupération.
6. Surveiller le processus :
   Utiliser la sonde de température enfichable pour surveiller la température des échantillons dans les puits. L’UIP400MTP peut être raccordé à un refroidisseur de laboratoire pour le refroidissement.
7. Manipulation après sonication :
   Transférer immédiatement le milieu de récupération contenant les biofilms détachés dans une nouvelle plaque stérile pour l’analyse ultérieure.

(A) Plaque contenant du TSB avec 2% de glucose utilisée pour la formation du biofilm, la récupération des cellules et la détermination de la CMI et de la MBEC ; (B) Couvercle à broches pour la formation de biofilms staphylococciques.
Les cellules du biofilm formées sur les broches ont été délogées par sonication (Hielscher Ultrasound Technology) pendant 5 min dans des plaques 96 puits contenant du milieu de culture frais pour la récupération des cellules.
(Image et étude : ©de Oliveira et al., 2016)

Étape 4 : Évaluation de la viabilité

Ensemencer et cultiver les biofilms détachés :

1. Réaliser des dilutions sériées du milieu de récupération et les ensemencer sur gélose pour dénombrer les unités formant colonie (UFC).
2. Déterminer la CMI :
   Déterminer la CMI comme la plus faible concentration d’antimicrobien qui inhibe complètement la croissance microbienne visible dans le milieu de récupération.

CMI – concentration minimale inhibitrice : exemple de plaque de microtitration et interprétation des résultats de microdilution.
(Étude et image : ©Jaskiewicz et al. 2019)

Qui tire profit de la sonication lors des essais de CMI ?

• Fabricants de dispositifs médicaux : Pour tester l’efficacité des revêtements de surface et valider les protocoles de nettoyage des dispositifs sujets à la formation de biofilms.
• Microbiologistes cliniques : Pour diagnostiquer avec précision les infections associées aux implants (telles que les IPA) en récupérant les bactéries présentes sur le matériel médical.
• Développeurs pharmaceutiques : Pour évaluer l’efficacité de nouveaux agents antimicrobiens contre des pathogènes résistants inclus dans des biofilms.
• Chercheurs universitaires : Pour mener des études reproductibles à haut débit sur la biologie des biofilms et les mécanismes de résistance aux antimicrobiens.
• Équipes de contrôle qualité industriel : Pour évaluer le biofouling et l’efficacité des désinfectants en milieu industriel (p. ex. selon les normes ASTM E2799-22).

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Découvrez ici comment l’UIP400MTP est utilisé pour le détachement des biofilms dans le protocole ASTM E2799 – Test de l’efficacité des désinfectants contre le biofilm de Pseudomonas aeruginosa à l’aide de l’essai MBEC.