Protocole de culture et de détachement du biofilm de staphylocoque

Des méthodes standardisées sont essentielles pour obtenir des résultats de recherche fiables. Vous trouverez ici un protocole de culture et de détachement de biofilms staphylococciques. Ce protocole se concentre sur la préparation rationalisée d'échantillons à haut débit à l'aide du sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP pour un détachement efficace et à haut débit des biofilms dans des plaques à 96 puits. Le protocole contient également des étapes clés pour la culture, le lavage et la visualisation des biofilms, en mettant l'accent sur la minimisation de la variabilité et la garantie de la reproductibilité.

Biofilm de staphylocoque et recherche sur les antibiotiques

Les biofilms de staphylocoques jouent un rôle essentiel dans les infections persistantes en raison de leur résistance aux antibiotiques et aux réponses immunitaires. La formation de biofilms constitue un environnement protecteur pour les bactéries, ce qui rend les infections difficiles à traiter. La recherche sur les biofilms se concentre souvent sur la compréhension de leur formation, de leur comportement et de leur sensibilité aux antimicrobiens, en mettant l'accent sur les méthodes à haut débit pour rationaliser les flux de travail expérimentaux.
Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP offre un avantage significatif dans la recherche sur les biofilms en permettant le détachement rapide et efficace des biofilms des plaques à 96 puits. Cet appareil fournit une énergie ultrasonique uniforme à tous les puits, garantissant des résultats cohérents tout en minimisant la variabilité.

Protocole pour la culture et le détachement de biofilms de staphylocoques

Ci-dessous, nous vous guidons pas à pas dans le processus de culture et de détachement d'un biofilm de staphylocoque. Comme étape analytique exemplaire, nous vous montrons comment quantifier spectrophotométriquement la biomasse cultivée par coloration au cristal violet.

Culture du biofilm de staphylocoque

Matériel nécessaire :

• Plaques de microtitration stériles de 96 puits en polystyrène à fond plat, traitées pour la culture de tissus, avec couvercles
• Bouillon tryptique de soja (TSB) avec 0,25 % de glucose
• Cabinet de sécurité biologique

Les étapes :

1. Préparer un environnement de travail stérile dans une enceinte de sécurité biologique afin de minimiser la contamination.
2. Ajouter de la TSB contenant 0,25 % de glucose dans les puits de la plaque de microtitration. Le TSB sans glucose ne favorise généralement pas la formation de biofilms et ne doit être utilisé comme contrôle que si nécessaire.
3. Inoculer les puits avec des souches bactériennes préparées comme décrit ci-dessous :
4. Préparer les suspensions bactériennes en veillant à ce qu'il n'y ait pas d'amas cellulaires préexistants en homogénéisant les suspensions par sonication ou en brisant les amas à l'aide d'une aiguille de calibre 23 et en les agitant brièvement au vortex.
5. Sceller la plaque avec son couvercle et incuber dans des conditions optimales pour la formation d'un biofilm (par exemple, 37°C pendant 24 heures).
6. Réaliser l'expérience en trois exemplaires pour chaque souche bactérienne (trois puits par souche) afin de garantir la fiabilité.
7. Prévoir six puits par plaque pour les contrôles négatifs. Jusqu'à 30 souches peuvent être testées par plaque de 96 puits.

Visualisation et lavage des biofilms

1. Après l'incubation, jeter le milieu avec précaution pour éviter de perturber le biofilm.
2. Laver chaque puits quatre fois avec une solution saline physiologique pour éliminer les bactéries planctoniques.
3. Inspecter le fond des puits à la recherche de taches blanches indiquant la présence d'un biofilm.

Détachement du biofilm à l'aide du sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP

Configuration et paramètres de l'appareil :

• Sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP
• Paramètres de fonctionnement : 60% d'amplitude, mode cycle avec 60 secondes ON / 30 secondes OFF

Les étapes :

1. Placer la plaque de microtitration lavée sur la plate-forme UIP400MTP.
2. Soniquer les échantillons selon les réglages recommandés (60% d'amplitude, 60 secondes ON, 30 secondes OFF). Ajuster les réglages à la souche bactérienne.
3. Lancez le processus de sonication pour détacher le biofilm. Les ondes ultrasoniques perturbent la matrice du biofilm, libérant les bactéries adhérentes.
4. L'UIP400MTP assure une exposition uniforme dans tous les puits pour des résultats de détachement cohérents.

Étape analytique : Quantification de la biomasse du biofilm détaché de staphylocoques à l'aide du violet de cristal (CV)

Matériel nécessaire :

• 0Solution de cristal violet (CV) à 0,1
• 95% d'éthanol ou 30% d'acide acétique (pour la solubilisation)
• Lecteur de microplaques capable de lire à 570 nm
• Plaques de microtitration stériles pour la coloration

Les étapes :

1. Préparation de la plaque de coloration : Transférer 100 µl de la suspension de biofilm détaché de chaque puits de la plaque soniquée dans les puits correspondants d'une plaque de microtitration à 96 puits propre et stérile. Cela permet d'obtenir un environnement clair et uniforme pour la coloration.
2. Coloration du biofilm détaché : Ajouter 150 µl de solution de cristal violet à 0,1 % dans chaque puits contenant la suspension de biofilm détaché. Pipeter doucement pour assurer un mélange homogène de la suspension de biofilm et du cristal violet.
3. Incubation : Laisser la plaque incuber à température ambiante pendant 15 minutes pour permettre au cristal violet de colorer efficacement la biomasse.
4. Lavage : après l'incubation, éliminer soigneusement la solution de cristal violet des puits sans perturber la biomasse. Laver chaque puits trois fois avec une solution saline physiologique stérile pour éliminer le colorant non lié.
5. Séchage : Laisser la plaque sécher à l'air à température ambiante ou sous une hotte stérile. Éviter de chauffer, car cela peut altérer les résultats.
6. Solubilisation : Ajouter 200 µl d'éthanol à 95 % (ou d'acide acétique à 30 %, selon les pratiques de laboratoire standard) à chaque puits pour solubiliser le cristal violet lié. Mélanger doucement en pipettant ou en agitant la plaque pendant 10 minutes à température ambiante.
7. Mesure : Mesurer la densité optique (DO) de la solution de cristal violet solubilisée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
8. Analyse des données : Soustraire la valeur moyenne de l'OD570 des contrôles négatifs (puits avec TSB mais sans inoculum bactérien) des puits expérimentaux pour tenir compte de la coloration de fond. Enregistrer et analyser les données.

Remarque : réaliser l'expérience en trois exemplaires pour chaque condition afin de garantir la reproductibilité. Veillez à manipuler correctement le cristal violet et l'éthanol, en respectant les protocoles de sécurité et d'élimination.
 

Les principaux avantages de l'UIP400MTP en un coup d'œil :

• Traitement à haut débit : Conçu spécifiquement pour les plaques multi-puits, il permet de traiter plusieurs échantillons simultanément.
• Distribution uniforme des ultrasons : Garantit une intensité ultrasonique égale entre les puits, ce qui permet d'obtenir des résultats cohérents pour tous les échantillons.
• Utilisez n'importe quelle plaque standard : L'UIP400MTP peut prendre en charge toutes les plaques multi-puits, boîtes de Pétri et portoirs de tubes standard. Aucune plaque propriétaire coûteuse n'est nécessaire !
• Interface conviviale : Facile à installer et à contrôler, c'est un excellent outil pour augmenter la productivité des laboratoires. Les réglages programmables et l'automatisation facilitent la standardisation des processus !