Protocole de culture et de détachement de biofilms de Staphylococcus

Des méthodes standardisées sont indispensables pour obtenir des résultats de recherche fiables. Vous trouverez ici un protocole de culture et de détachement de biofilms staphylococciques. Ce protocole met l’accent sur une préparation des échantillons rationalisée et à haute cadence à l’aide du sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP, pour un détachement efficace et à haute cadence des biofilms dans des plaques à 96 puits. Le protocole comprend également les étapes clés de la culture, du lavage et de la visualisation des biofilms, en mettant l’accent sur la réduction de la variabilité et la garantie de la reproductibilité.

Biofilms de Staphylococcus et recherche sur les antibiotiques

Les biofilms de Staphylococcus jouent un rôle déterminant dans les infections persistantes en raison de leur résistance aux antibiotiques et aux réponses immunitaires. La formation de biofilms offre aux bactéries un environnement protecteur, ce qui rend les infections difficiles à traiter. La recherche sur les biofilms s’attache souvent à comprendre leur formation, leur comportement et leur sensibilité aux antimicrobiens, en privilégiant les méthodes à haute cadence afin de rationaliser les flux de travail expérimentaux.
Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP offre un avantage considérable pour la recherche sur les biofilms en permettant le détachement rapide et efficace des biofilms des plaques à 96 puits. Cet appareil délivre une énergie ultrasonore uniforme à tous les puits, garantissant des résultats constants tout en réduisant la variabilité.

Protocole de culture et de détachement de biofilms de Staphylococcus

Ci-dessous, nous vous guidons pas à pas à travers le processus de culture et de détachement d’un biofilm de staphylocoques. À titre d’exemple d’étape analytique, nous vous montrons comment quantifier par spectrophotométrie la biomasse cultivée au moyen d’une coloration au cristal violet.

Culture du biofilm de Staphylococcus

Matériel nécessaire :

• Microplaques de titration stériles à 96 puits, à fond plat, en polystyrène traité pour culture tissulaire, avec couvercles
• Bouillon trypticase soja (TSB) avec 0,25% de glucose
• Poste de sécurité microbiologique

Étapes :

1. Préparez un environnement de travail stérile dans un poste de sécurité microbiologique afin de réduire au minimum les contaminations.
2. Ajoutez du TSB contenant 0,25% de glucose dans les puits de la microplaque. Le TSB sans glucose ne favorise généralement pas la formation de biofilms et ne doit être utilisé que comme témoin, si nécessaire.
3. Inoculez les puits avec des souches bactériennes préparées comme décrit ci-dessous :
4. Préparez les suspensions bactériennes en vous assurant de l’absence d’amas cellulaires préexistants, en homogénéisant les suspensions par sonication ou en dissociant les amas à l’aide d’une aiguille de 23 gauges et d’un bref passage au vortex.
5. Fermez la plaque avec son couvercle et incubez-la dans des conditions optimales pour la formation de biofilms (p. ex. 37°C pendant 24 heures).
6. Réalisez l’expérience en triple pour chaque souche bactérienne (trois puits par souche) afin de garantir la fiabilité.
7. Réservez six puits par plaque aux témoins négatifs. Jusqu’à 30 souches peuvent être testées par plaque à 96 puits.

Visualisation et lavage du biofilm

1. Après l’incubation, éliminez le milieu avec précaution afin de ne pas perturber le biofilm.
2. Lavez chaque puits quatre fois avec du sérum physiologique afin d’éliminer les bactéries planctoniques.
3. Inspectez le fond des puits à la recherche de plaques blanches révélant la présence d’un biofilm.

Détachement du biofilm à l’aide du sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP

Configuration de l’appareil et paramètres :

• Sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP
• Réglages de fonctionnement : amplitude de 60%, mode cyclique avec 60 secondes en marche / 30 secondes à l’arrêt

Étapes :

1. Placez la microplaque lavée sur la plateforme de l’UIP400MTP.
2. Soniquez les échantillons aux réglages recommandés (amplitude de 60%, 60 secondes en marche, 30 secondes à l’arrêt). Adaptez les réglages à la souche bactérienne.
3. Lancez le processus de sonication pour détacher le biofilm. Les ondes ultrasonores désagrègent la matrice du biofilm et libèrent les bactéries adhérentes.
4. L’UIP400MTP assure une exposition uniforme de tous les puits pour des résultats de détachement constants.

Étape analytique : quantification de la biomasse du biofilm de Staphylococcus détaché à l’aide du cristal violet (CV)

Matériel nécessaire :

• Solution de cristal violet (CV) à 0,1%
• Éthanol à 95% ou acide acétique à 30% (pour la solubilisation)
• Lecteur de microplaques capable de mesurer à 570 nm
• Microplaques stériles pour la coloration

Étapes :

1. Préparation de la plaque de coloration : transférez 100 µL de la suspension de biofilm détaché de chaque puits de la plaque soniquée dans les puits correspondants d’une microplaque à 96 puits propre et stérile. Cela garantit un environnement net et uniforme pour la coloration.
2. Coloration du biofilm détaché : ajoutez 150 µL de solution de cristal violet à 0,1% dans chaque puits contenant la suspension de biofilm détaché. Pipetez délicatement pour assurer un mélange homogène de la suspension de biofilm et du cristal violet.
3. Incubation : laissez incuber la plaque à température ambiante pendant 15 minutes afin que le cristal violet colore efficacement la biomasse.
4. Lavage : après l’incubation, éliminez avec précaution la solution de cristal violet des puits sans perturber la biomasse. Lavez chaque puits trois fois avec du sérum physiologique stérile afin d’éliminer le colorant non fixé.
5. Séchage : laissez la plaque sécher à l’air à température ambiante ou sous une hotte à flux d’air stérile. Évitez de chauffer, car cela pourrait fausser les résultats.
6. Solubilisation : ajoutez 200 µL d’éthanol à 95% (ou d’acide acétique à 30%, selon les pratiques habituelles du laboratoire) dans chaque puits pour solubiliser le cristal violet fixé. Mélangez délicatement par pipetage ou en agitant la plaque pendant 10 minutes à température ambiante.
7. Mesure : mesurez la densité optique (DO) de la solution de cristal violet solubilisé à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
8. Analyse des données : soustrayez la valeur moyenne d’OD570 des témoins négatifs (puits contenant du TSB mais sans inoculum bactérien) de celle des puits expérimentaux afin de tenir compte de la coloration de fond. Enregistrez et analysez les données.

Remarque : réalisez l’expérience en triple pour chaque condition afin de garantir la reproductibilité. Veillez à manipuler correctement le cristal violet et l’éthanol, en respectant les protocoles de sécurité et d’élimination.

Les principaux avantages de l’UIP400MTP en un coup d’œil :

• Traitement à haute cadence : Conçu spécifiquement pour les plaques multipuits, il vous permet de traiter plusieurs échantillons simultanément.
• Distribution uniforme des ultrasons : Garantit une intensité ultrasonore égale dans tous les puits, pour des résultats constants sur l’ensemble des échantillons.
• Utilisation de toute plaque standard : L’UIP400MTP accepte toutes les plaques multipuits standard, boîtes de Petri et portoirs de tubes. Aucune plaque propriétaire coûteuse n’est nécessaire !
• Interface conviviale : Facile à configurer et à piloter, c’est un excellent outil pour accroître la productivité du laboratoire. Les réglages programmables et l’automatisation facilitent la standardisation des procédés !