Protocole d’utilisation des sonicateurs multi-échantillons Hielscher pour l’analyse des biofilms et l’analyse protéomique
L’utilisation de sonicateurs multi-échantillons, tels que le sonicateur multi-tubes VialTweeter et le sonicateur pour microplaques UIP400MTP, rationalise les flux de travail en laboratoire pour les applications à haut débit. Les deux appareils permettent un traitement par ultrasons précis et uniforme de plusieurs échantillons, ce qui minimise la variabilité et améliore la reproductibilité. Cela est particulièrement avantageux dans les expériences exigeant une lyse des échantillons, un détachement des biofilms, une extraction de protéines ou une digestion protéolytique homogènes, pour lesquelles les méthodes manuelles ou à échantillon unique sont moins efficaces et sujettes à des incohérences.
Rationalisez vos flux de travail avec les sonicateurs multi-échantillons
Le UIP400MTP, par exemple, permet le traitement simultané par ultrasons des puits d’une microplaque, garantissant un détachement uniforme des biofilms ou du matériel cellulaire. Le VialTweeter, quant à lui, assure une lyse et une homogénéisation précises de plusieurs échantillons en tubes sans contamination croisée. Ces sonicateurs réduisent considérablement les temps de traitement, améliorent la reproductibilité expérimentale et préservent une grande intégrité des échantillons, ce qui en fait des outils indispensables pour la recherche en microbiologie, en protéomique et en biologie moléculaire.
Vous trouverez ci-dessous un protocole détaillé illustrant l’utilisation des modèles de sonicateurs multi-échantillons Hielscher, le sonicateur multi-tubes VialTweeter et le sonicateur pour microplaques UIP400MTP, dans une étude portant sur la formation de biofilms d’E. coli et l’analyse protéomique qui s’ensuit.
Sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP – une préparation d’échantillons fiable à haut débit
Protocole : formation, détachement et analyse protéomique des biofilms à l’aide des sonicateurs multi-échantillons Hielscher
1. Préparation de la culture bactérienne
- Cultiver des bactéries E. coli (souche W3110) à 30°C, une température favorable à la formation de biofilms d’E. coli, dans un milieu bouillon tryptone (TB) contenant :
– 10 g/L de tryptone
– 5 g/L de NaCl - Ajouter des antibiotiques si nécessaire pour assurer le maintien des plasmides.
- Pour les études de microscopie et d’activité des promoteurs, utiliser la souche W3110 d’E. coli portant un rapporteur GFP amélioré (eGFP) génomique placé sous le contrôle du promoteur rplL.
- Utiliser des plasmides rapporteurs GFP pour différents promoteurs (par ex. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) afin de mesurer les activités des promoteurs.
2. Culture et détachement des biofilms
- Ensemencer 1,5 mL de culture bactérienne diluée par puits dans une plaque 12 puits (plaques 12 puits CellStar, Greiner Bio-One).
- Incuber pour permettre la formation du biofilm.
- Retirer délicatement la culture planctonique (non adhérente).
– Laver chaque puits avec 500 µL de PBS.
– Détacher les cellules adhérentes en soniquant la plaque 12 puits dans le sonicateur pour microplaques UIP400MTP. Le UIP400MTP garantit un détachement uniforme en délivrant une énergie ultrasonore constante dans tous les puits.
– Paramètres de sonication : amplitude de 60%, mode cyclique : 60 sec ON / 30 sec OFF.
3. Récolte et lyse des cellules
- Centrifuger les cellules de biofilm détachées à 4 500 g pendant 5 minutes.
- Laver les cellules culottées avec du PBS.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 µL de lauroylsarcosinate de sodium (SLS) à 2% et incuber à 95°C pendant 15 minutes.
- Soniquer à l’aide du sonicateur multi-tubes VialTweeter pour assurer une lyse cellulaire complète.
– Paramètres de sonication : amplitude de 100%, 50 s ON / 10 s OFF pour une durée totale de fonctionnement de 10 min ; maintenir les échantillons sur glace.
4. Réduction et alkylation
- Ajouter 5 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) pour réduire les ponts disulfure et incuber à 95°C pendant 15 minutes.
- Alkyler les protéines avec 10 mM d’iodoacétamide pendant 30 minutes à 25°C.
5. Quantification et digestion des protéines
- Centrifuger les lysats pour éliminer les débris.
- Quantifier la teneur en protéines totales à l’aide du kit Pierce BCA Protein Assay Kit.
- Digérer 50 µg de protéines totales avec 1 µg de trypsine dans une solution contenant 2% de SLS et 100 mM de bicarbonate d’ammonium.
- Incuber la réaction de digestion pendant la nuit à 30°C.
6. Purification des peptides
- Précipiter le SLS en ajoutant 1,5% d’acide trifluoroacétique (TFA), puis centrifuger.
- Purifier les peptides à l’aide de microcolonnes de centrifugation C18.
- Sécher les peptides purifiés et les remettre en suspension dans du TFA à 0,1%.
7. Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS)
- Analyser les peptides sur un spectromètre de masse Q-Exactive Plus couplé à un système Ultimate 3000 RSLC nano.
- Séparer les peptides à l’aide d’une colonne HPLC en phase inverse (75 µm × 42 cm) garnie de résine C18 (2,4 µm).
- Appliquer un gradient de 2% à 35% de solvant B (acétonitrile avec 0,15% d’acide formique) sur 140 minutes.
- Acquérir les données au moyen de balayages MS à haute résolution suivis de balayages MS/MS en tandem des 10 ions les plus intenses.
8. Analyse des données
- Traiter les données LC-MS brutes à l’aide du logiciel Progenesis.
- Exporter les fichiers .mgf et les analyser avec MASCOT.
- Effectuer la quantification des peptides à l’aide de SafeQuant pour le contrôle qualité et l’ajustement des fausses découvertes.
- Réaliser toutes les expériences en duplicats ou en triplicats pour garantir la reproductibilité.
Sonicateurs multi-échantillons pour la préparation d’échantillons à haut débit
Les modèles de sonicateurs multi-échantillons VialTweeter et UIP400MTP améliorent considérablement la précision et l’efficacité des flux de travail expérimentaux, en particulier dans la recherche sur les biofilms et en protéomique. Leur capacité à traiter uniformément plusieurs échantillons assure une capacité à haut débit sans compromettre la qualité des données. Ces avantages, associés aux flux de travail rationalisés décrits ci-dessus, font des sonicateurs multi-échantillons Hielscher des outils essentiels pour la recherche biologique moderne.
- haute efficacité
- technologie de pointe
- fiabilité & robustesse
- contrôle de processus réglable et précis
- batch & en ligne
- pour tout volume
- logiciel intelligent
- fonctions intelligentes (par ex. programmables, enregistrement des données, commande à distance)
- utilisation simple et sûre
- faible maintenance
- CIP (nettoyage en place)
Conception, fabrication et conseil – qualité made in Germany
Les ultrasonicateurs Hielscher sont réputés pour leurs normes de qualité et de conception les plus élevées. Leur robustesse et leur facilité d’utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasonicateurs dans les installations industrielles. Les conditions difficiles et les environnements exigeants sont facilement maîtrisés par les ultrasonicateurs Hielscher.
Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO qui accorde une importance particulière aux ultrasonicateurs haute performance alliant technologie de pointe et convivialité. Bien entendu, les ultrasonicateurs Hielscher sont conformes CE et répondent aux exigences UL, CSA et RoHs.
Bibliographie / Références / Fiches techniques
- Download PDF « Protocol using Hielscher Multi-Sample Sonicators in Biofilm and Proteomic Analysis » – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP – High-throughput Sonicator for Multiwell-Plates
- FactSheet VialTweeter – Simultaneous sonication of closed vials
- Shirley J.D., Nauta K.M., Carlson E.E. (2022): Live-Cell Profiling of Penicillin-Binding Protein Inhibitors in Escherichia coli MG1655. ACS Infectious Diseases Jul 8;8(7); 2022. 1241-1252.
- Teteneva N.A., Mart’yanov S.V., Esteban-López M., Kahnt J., Glatter T,. Netrusov A.I., Plakunov V.K., Sourjik V. (2020): Multiple drug-induced stress responses inhibit formation of Escherichia coli biofilms. Applied Environmental Microbiology 2020: 86:e01113-20.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Foire aux questions
Qu’est-ce qu’un biofilm ?
Un biofilm est une communauté structurée de micro-organismes enchâssés dans une matrice extracellulaire (ECM) qu’ils produisent eux-mêmes et adhérant à des surfaces. Il offre une protection contre les stress environnementaux, les antibiotiques et le système immunitaire, contribuant ainsi aux infections persistantes et à l’encrassement biologique (biofouling).
Qu’est-ce que le détachement des biofilms ?
Le détachement des biofilms est le processus par lequel des cellules ou des amas microbiens se séparent de la structure du biofilm, soit activement (par dégradation enzymatique ou quorum sensing), soit passivement (sous l’effet des forces de cisaillement, de l’épuisement des nutriments ou d’une perturbation mécanique). Ce processus favorise la dispersion du biofilm et la colonisation de nouvelles surfaces.
Que sont les protéines associées aux biofilms ?
Les protéines associées aux biofilms (BAP) sont des protéines microbiennes de surface ou sécrétées qui jouent un rôle clé dans la formation, la stabilité et l’adhésion des biofilms. Elles comprennent les adhésines, les enzymes extracellulaires et des protéines structurales telles que les fibres curli chez E. coli ou BapA chez Staphylococcus aureus.
Qu’est-ce que l’ECM dans les biofilms ?
La matrice extracellulaire (ECM) des biofilms est un réseau complexe de polysaccharides, de protéines, d’ADN extracellulaire (eDNA) et de lipides qui enveloppe les cellules microbiennes. Elle assure l’intégrité structurelle, médie l’adhésion, retient l’humidité et renforce la résistance du biofilm aux antimicrobiens et aux défenses de l’hôte.
Quelle fonction remplissent les fibres curli ?
Les fibres curli sont des fibrilles amyloïdes extracellulaires produites par Escherichia coli et des bactéries apparentées ; elles jouent un rôle crucial dans la formation des biofilms, l’adhésion aux surfaces et la colonisation de l’hôte. Elles contribuent à l’intégrité du biofilm, renforcent la résistance aux stress environnementaux et facilitent les interactions avec les tissus de l’hôte au cours de l’infection. En outre, les fibres curli participent à l’activation du système immunitaire et ont été impliquées dans la persistance et la pathogénicité bactériennes.
Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons haute performance, de la taille laboratoire à la taille industrielle.