Protocole d'utilisation des sonicateurs multi-échantillons Hielscher pour l'analyse des biofilms et de la protéomique
L'utilisation de sonicateurs multi-échantillons, tels que le sonicateur multi-tubes VialTweeter et le sonicateur pour microplaques UIP400MTP, permet de rationaliser les flux de travail des laboratoires pour les applications à haut débit. Ces deux appareils permettent un traitement ultrasonique précis et uniforme de plusieurs échantillons, minimisant ainsi la variabilité et améliorant la reproductibilité. Ceci est particulièrement avantageux pour les expériences nécessitant une lyse cohérente de l'échantillon, le détachement du biofilm, l'extraction de protéines ou la digestion protéolytique, où les méthodes manuelles ou à échantillon unique sont moins efficaces et sujettes à des incohérences.
Rationaliser les flux de travail avec les sonicateurs multi-échantillons
L'UIP400MTP, par exemple, permet un traitement simultané par ultrasons des puits de microplaques, garantissant un détachement uniforme des biofilms ou du matériel cellulaire. Le VialTweeter, quant à lui, permet une lyse et une homogénéisation précises d'échantillons en tubes multiples sans contamination croisée. Ces sonicateurs réduisent considérablement les temps de traitement, améliorent la reproductibilité des expériences et préservent l'intégrité des échantillons, ce qui en fait des outils indispensables pour la recherche en microbiologie, en protéomique et en biologie moléculaire.
Vous trouverez ci-dessous un protocole détaillé illustrant l'utilisation des modèles de sonicateurs multiéchantillons Hielscher, le sonicateur multi-tubes VialTweeter et le sonicateur pour microplaques UIP400MTP, dans le cadre d'une étude portant sur la formation d'un biofilm d'E. coli et l'analyse protéomique qui s'ensuit.

sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP – préparation fiable d'échantillons à haut débit
Protocole : Formation et détachement de biofilms et analyse protéomique à l'aide de sonicateurs Hielscher à échantillons multiples
1. Préparation de la culture bactérienne
- Cultiver les bactéries E. coli (souche W3110) à 30°C, une température favorable à la formation du biofilm d'E. coli, dans un milieu de bouillon de tryptone (TB) contenant :
– 10 g/L de tryptone
– 5 g/L NaCl - Compléter avec des antibiotiques si nécessaire pour assurer la rétention du plasmide.
- Pour les études de microscopie et d'activité du promoteur, utiliser la souche W3110 d'E. coli avec un rapporteur génomique GFP amélioré (eGFP) sous le contrôle du promoteur rplL.
- Utiliser des plasmides rapporteurs GFP pour différents promoteurs (par ex, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) pour mesurer l'activité des promoteurs.
2. Culture et détachement du biofilm
- Ensemencer 1,5 ml de culture bactérienne diluée par puits dans une plaque à 12 puits (plaques CellStar à 12 puits, Greiner Bio-One).
- Incuber pour permettre la formation d'un biofilm.
- Retirer soigneusement la culture planctonique (non adhérente).
– Laver chaque puits avec 500 µl de PBS.
– Détachez les cellules attachées en sonifiant la plaque de 12 puits dans le sonificateur de microplaques UIP400MTP. L'UIP400MTP assure un détachement uniforme en délivrant une énergie ultrasonique constante dans tous les puits.
– Paramètres de sonication : 60% d'amplitude, mode cycle : 60 secondes ON / 30 secondes OFF.
3. Récolte et lyse des cellules
- Centrifuger les cellules de biofilm détachées à 4 500 g pendant 5 minutes.
- Laver les cellules culottées avec du PBS.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 µl de lauroyl sarcosinate de sodium (SLS) à 2 % et incuber à 95 °C pendant 15 minutes.
- Soniquer à l'aide du sonicateur multi-tubes VialTweeter pour assurer une lyse cellulaire complète.
– Paramètres de sonication : 100% d'amplitude, 50 s ON / 10 s OFF pour une durée totale de 10 min ; conserver les échantillons sur de la glace.
4. Réduction et alkylation
- Ajouter 5 mM de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) pour réduire les liaisons disulfures et incuber à 95°C pendant 15 minutes.
- Alkyler les protéines avec 10 mM d'iodoacétamide pendant 30 minutes à 25°C.
5. Quantification et digestion des protéines
- Centrifuger les lysats pour éliminer les débris.
- Quantifier la teneur en protéines totales à l'aide du kit de dosage des protéines Pierce BCA.
- Digérer 50 µg de protéines totales avec 1 µg de trypsine dans une solution contenant 2% de SLS et 100 mM de bicarbonate d'ammonium.
- Incuber la réaction de digestion pendant une nuit à 30°C.
6. Purification des peptides
- Précipiter le SLS en ajoutant 1,5 % d'acide trifluoroacétique (TFA), puis centrifuger.
- Purifier les peptides à l'aide de colonnes de microspin C18.
- Sécher les peptides purifiés et les remettre en suspension dans 0,1 % de TFA.
7. Chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS/MS)
- Analyse des peptides sur un spectromètre de masse Q-Exactive Plus couplé à un nano-système Ultimate 3000 RSLC.
- Séparer les peptides à l'aide d'une colonne HPLC en phase inverse (75 µm × 42 cm) remplie de résine C18 (2,4 µm).
- Appliquer un gradient de 2% à 35% de solvant B (acétonitrile avec 0,15% d'acide formique) pendant 140 minutes.
- Acquérir des données à l'aide de scans MS à haute résolution suivis de scans MS/MS en tandem des 10 ions les plus intenses.
8. Analyse des données
- Traiter les données brutes de LC-MS à l'aide du logiciel Progenesis.
- Exporter des fichiers .mgf et les analyser avec MASCOT.
- Effectuer la quantification des peptides en utilisant SafeQuant pour le contrôle de la qualité et l'ajustement des fausses découvertes.
- Réaliser toutes les expériences en double ou en triple afin de garantir la reproductibilité.
Sonicateurs multi-échantillons pour la préparation d'échantillons à haut débit
Les modèles de sonicateurs multi-échantillons VialTweeter et UIP400MTP améliorent considérablement la précision et l'efficacité des flux de travail expérimentaux, en particulier dans les domaines de la recherche sur les biofilms et de la protéomique. Leur capacité à traiter plusieurs échantillons de manière uniforme garantit un débit élevé sans compromettre la qualité des données. Ces avantages, combinés aux flux de travail rationalisés décrits ci-dessus, font des sonicateurs multi-échantillons Hielscher des outils essentiels pour la recherche biologique moderne.
- haute efficacité
- Une technologie de pointe
- fiabilité & Robustesse
- contrôle du processus réglable et précis
- lot & en ligne
- pour tout volume
- logiciel intelligent
- fonctions intelligentes (par exemple, programmable, protocole de données, contrôle à distance)
- Facile et sûr à utiliser
- Faible entretien
- CIP (clean-in-place)
Conception, fabrication et conseil – Qualité Made in Germany
Les ultrasons Hielscher sont réputés pour leur qualité et leurs normes de conception les plus élevées. La robustesse et la facilité d'utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasons dans les installations industrielles. Les conditions difficiles et les environnements exigeants sont facilement gérés par les ultrasons Hielscher.
Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO et met l'accent sur les ultrasons de haute performance, dotés d'une technologie de pointe et d'une grande facilité d'utilisation. Bien entendu, les ultrasons Hielscher sont conformes à la norme CE et répondent aux exigences des normes UL, CSA et RoHs.
Littérature / Références / Fiches d'information
- Download PDF “Protocol using Hielscher Multi-Sample Sonicators in Biofilm and Proteomic Analysis” – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP – High-throughput Sonicator for Multiwell-Plates
- FactSheet VialTweeter – Simultaneous sonication of closed vials
- Shirley J.D., Nauta K.M., Carlson E.E. (2022): Live-Cell Profiling of Penicillin-Binding Protein Inhibitors in Escherichia coli MG1655. ACS Infectious Diseases Jul 8;8(7); 2022. 1241-1252.
- Teteneva N.A., Mart’yanov S.V., Esteban-López M., Kahnt J., Glatter T,. Netrusov A.I., Plakunov V.K., Sourjik V. (2020): Multiple drug-induced stress responses inhibit formation of Escherichia coli biofilms. Applied Environmental Microbiology 2020: 86:e01113-20.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Questions fréquemment posées
Qu'est-ce qu'un biofilm ?
Un biofilm est une communauté structurée de micro-organismes intégrés dans une matrice extracellulaire (MEC) autoproduite, qui adhère aux surfaces. Il offre une protection contre les agressions environnementales, les antibiotiques et le système immunitaire, contribuant ainsi aux infections persistantes et à l'encrassement.
Qu'est-ce que le détachement du biofilm ?
Le détachement du biofilm est le processus par lequel les cellules ou les groupes microbiens se séparent de la structure du biofilm, soit activement (par dégradation enzymatique ou quorum sensing), soit passivement (en raison des forces de cisaillement, de l'épuisement des nutriments ou d'une perturbation mécanique). Cela facilite la dispersion du biofilm et la colonisation de nouvelles surfaces.
Que sont les protéines associées au biofilm ?
Les protéines associées au biofilm (BAP) sont des protéines microbiennes de surface ou sécrétées qui jouent un rôle clé dans la formation, la stabilité et l'adhésion du biofilm. Il s'agit notamment d'adhésines, d'enzymes extracellulaires et de protéines structurelles telles que les fibres curli chez E. coli ou BapA chez Staphylococcus aureus.
Qu'est-ce que l'ECM dans les biofilms ?
La matrice extracellulaire (MEC) des biofilms est un réseau complexe de polysaccharides, de protéines, d'ADN extracellulaire (ADNe) et de lipides qui enveloppent les cellules microbiennes. Elle assure l'intégrité structurelle, facilite l'adhésion, retient l'humidité et renforce la résistance du biofilm aux antimicrobiens et aux défenses de l'hôte.
Quelle fonction remplissent les fibres Curli ?
Les fibres Curli sont des fibrilles amyloïdes extracellulaires produites par Escherichia coli et les bactéries apparentées, qui jouent un rôle crucial dans la formation du biofilm, l'adhésion à la surface et la colonisation de l'hôte. Elles contribuent à l'intégrité du biofilm, renforcent la résistance aux stress environnementaux et facilitent les interactions avec les tissus de l'hôte pendant l'infection. En outre, les fibres curli sont impliquées dans la promotion de l'activation du système immunitaire et ont été impliquées dans la persistance et la pathogénicité des bactéries.

Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons très performants à partir de laboratoires à taille industrielle.