Désparaffinisation et extraction de protéines à partir de FFPE
Facilitez l'extraction des protéines à partir de coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) en utilisant une combinaison optimisée de déparaffinisation, de solubilisation et de sonication avec un ultrasonateur multi-tubes VialTweeter. Ce protocole prend en charge la protéomique basée sur la spectrométrie de masse en aval et est compatible avec les flux de travail de nettoyage SP3 et de digestion enzymatique.
Cette SOP est destinée au personnel de laboratoire impliqué dans l'analyse protéomique d'échantillons de tissus FFPE à l'aide d'une sonication de haute performance. Elle est optimisée pour un maximum de dix échantillons FFPE traités en parallèle à l'aide du sonicateur multi-tubes VialTweeter.

Sonicateur VialTweeter pour la sonication simultanée de 10 échantillons, par exemple pour la lyse et l'extraction de protéines à partir d'échantillons FFPE
Protocole : Extraction de protéines à partir d'échantillons FFPE à l'aide du VialTweeter
Matériaux et réactifs
réactifs
- Xylène (qualité histologique)
- Éthanol (absolu 96 %)
- Tampon de lyse :
- Inhibiteur de protéase (facultatif ; par exemple, cOmplete™ mini EDTA-free)
6 M Chlorhydrate de guanidine
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyéthyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacétamide)
Equipement
- Ultrasonateur multi-tubes VialTweeter
- Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml ou 2,0 ml à faible liant
- Bloc thermique ou incubateur (95°C et 80°C)
- Microcentrifugeuse
- Thermomixer (facultatif mais recommandé)
Exemple d'entrée
- 1 à 2 sections de tissu FFPE de 10 µm d'épaisseur par échantillon (c'est-à-dire par flacon)
- Un total de ~100 µg de tissu par échantillon (c'est-à-dire par flacon)
ou
Note : Utiliser des lames neuves pour la microtomie afin de minimiser la contamination par les débris de paraffine.
Procédure
- désparaffinage
- Transférer les sections FFPE dans des tubes de microcentrifugation à faible liant.
- Ajouter 1 ml de xylène, vortexer brièvement.
- Incuber 10 minutes à température ambiante.
- Centrifuger à 14 000 × g pendant 2 minutes ; éliminer le surnageant.
- Répéter le lavage au xylène une fois de plus (étapes 2-4).
- Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 96 %, agiter au vortex, puis centrifuger à 14 000 × g pendant 2 minutes. Jeter le surnageant.
- Répéter le lavage à l'éthanol une fois de plus (2 lavages à l'éthanol au total).
- Sécher le culot à l'air pendant 10 minutes à température ambiante, couvercles ouverts, afin d'évaporer l'éthanol résiduel.
- Extraction des protéines et sonication
- Ajouter 200 µl de tampon de lyse à chaque culot sec.
Remarque : bien que le sonicateur puisse contenir jusqu'à 1 ml, 200 µl est la quantité optimale pour le traitement en aval. - Mélanger par vortex ou par pipetage doux.
- Ajouter 200 µl de tampon de lyse à chaque culot sec.
- Première incubation thermique
- Incuber les tubes à 95 °C pendant 30 minutes, en les agitant à 400 rpm à l'aide d'un thermomix ou d'un bloc thermique.
- Laisser les échantillons refroidir à température ambiante pendant 5 minutes.
- Première sonication avec le VialTweeter
- Placer les tubes dans le VialTweeter.
- Régler le VialTweeter UP200St sur les valeurs ci-dessous et procéder à la sonication.
- Deuxième incubation thermique
Retirer les tubes et incuber à nouveau à 95 °C pendant 15 minutes, 400 rpm. - Deuxième sonication
Répéter la sonication sur le VialTweeter en utilisant les mêmes réglages (comme ci-dessus) pour 10 cycles supplémentaires (15 min au total). - Clarification du lysat
- Centrifuger les échantillons à 13 000 × g pendant 10 minutes à 23 °C (température ambiante).
- Recueillir soigneusement le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf Safe-lock de 2,0 ml. Éviter de déranger le culot.
- Traitement en aval
Le lysat est maintenant prêt pour le nettoyage SP3 et la digestion enzymatique.
- Régler l'amplitude (A) à 100 %.
- Régler le mode de pulsation (C) sur 100%.
- Horloge périodique : Activé
- A l'heure : 60s
- Temps d'arrêt : 30s
- Valeur limite : 15 min (correspond à 10 cycles)
(Note de calcul : (60 s Marche + 30 s Arrêt) × 10 cycles = 900 s = 15 min)

Hielscher VialTweeter avec 10 tubes Eppendorf
Notes et bonnes pratiques
- Le risque de surchauffe pendant la sonication est atténué par un cycle ON/OFF programmé.
- Éviter le vortexage après la sonication pour éviter l'agrégation des protéines.
Élimination des déchets et sécurité
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons de laboratoire :
Dispositifs recommandés | Volume du lot | Débit |
---|---|---|
UIP400MTP Sonicateur pour plaques de 96 puits | plaques multi-puits / microtitres | n.d. |
Cornet à ultrasons | CupHorn pour flacons ou béchers | n.d. |
GDmini2 | réacteur ultrasonique à micro-flux | n.d. |
VialTweeter | 00,5 à 1,5 ml | n.d. |
UP100H | 1 à 500mL | 10 à 200mL/min |
UP200Ht, UP200St | 10 à 1000mL | 20 à 200mL/min |
UP400St | 10 à 2000mL | 20 à 400mL/min |
Tamiseuse à ultrasons | n.d. | n.d. |
Littérature / Références
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Questions fréquemment posées
Pourquoi les échantillons de tissus sont-ils fixés en tant que FFPE ?
La conservation des tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine (FFPE) stabilise la morphologie des tissus et la structure des protéines en formant des liaisons transversales covalentes par l'intermédiaire du formaldéhyde. L'inclusion dans la paraffine permet un stockage à long terme à température ambiante tout en préservant l'intégrité histologique et moléculaire pour des analyses rétrospectives.
Comment désaraffiner les échantillons FFPE ?
La déparaffinisation implique des lavages séquentiels de solvants pour éliminer la paraffine : généralement deux incubations avec du xylène, suivies de deux lavages avec de l'éthanol (96 %). Après centrifugation et séchage, le tissu est prêt pour l'extraction en aval. Ce processus rétablit l'accessibilité de l'échantillon pour la lyse et la digestion enzymatique.
Quel est le but de l'incubation thermique ?
L'incubation thermique désigne l'exposition contrôlée d'un échantillon à une température définie pendant une période de temps spécifique afin d'induire des changements biochimiques ou physiques. En protéomique, elle est couramment utilisée pour dénaturer les protéines, inverser les liaisons transversales au formaldéhyde dans les tissus FFPE ou améliorer l'efficacité du tampon de lyse. La température et la durée sont des paramètres critiques, adaptés à la réaction cible ou au type d'échantillon.
Qu'est-ce que la digestion SP3 ?
Le Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) est un flux de travail protéomique basé sur des billes. Il utilise des billes paramagnétiques pour lier les protéines, ce qui permet un nettoyage efficace, une concentration et une digestion enzymatique sur les billes dans des conditions dénaturantes. SP3 minimise la perte d'échantillons et est hautement compatible avec les échantillons FFPE et à faible débit.

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