Déparaffinage et extraction des protéines à partir d’échantillons FFPE

Facilitez l’extraction des protéines à partir de coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) grâce à une combinaison optimisée de déparaffinage, de solubilisation et de sonication avec l’ultrasonicateur multitubes VialTweeter. Ce protocole soutient la protéomique en aval basée sur la spectrométrie de masse et est compatible avec les flux de travail de purification SP3 et de digestion enzymatique.

Cette procédure opératoire normalisée (SOP) est destinée au personnel de laboratoire impliqué dans l’analyse protéomique d’échantillons de tissus FFPE par sonication haute performance. Elle est optimisée pour le traitement en parallèle de jusqu’à dix échantillons FFPE avec le sonicateur multitubes VialTweeter.

Protocole : extraction des protéines à partir d’échantillons FFPE avec le VialTweeter

Matériels et réactifs

Réactifs

• Xylène (qualité histologique)
• Éthanol (absolu 96%)
• Tampon de lyse :

6 M chlorhydrate de guanidine
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-carboxyéthyl)phosphine)
40 mM CAA (2-chloroacétamide)

• Inhibiteur de protéases (facultatif ; p. ex. cOmplete™ mini EDTA-free)

Équipement

• Ultrasonicateur multitubes VialTweeter
• Tubes de microcentrifugation à faible adsorption de 1,5 mL ou 2,0 mL
• Bloc chauffant ou incubateur (réglages à 95°C et 80°C)
• Microcentrifugeuse
• Thermomixeur (facultatif mais recommandé)

Quantité d’échantillon

• 1–2 coupes de tissu FFPE de 10 µm d’épaisseur par échantillon (c.-à-d. par flacon)

OU

• Au total ~100 µg de tissu par échantillon (c.-à-d. par flacon)

Remarque : utilisez des lames neuves pour la microtomie afin de minimiser la contamination par des débris de paraffine.

Mode opératoire

1. Déparaffinage
   1. Transférez les coupes FFPE dans des tubes de microcentrifugation à faible adsorption.
   2. Ajoutez 1 mL de xylène, vortexez brièvement.
   3. Incubez 10 minutes à température ambiante.
   4. Centrifugez à 14 000 × g pendant 2 minutes ; éliminez le surnageant.
   5. Répétez le lavage au xylène une fois de plus (étapes 2–4).
   6. Lavez le culot avec 1 mL d’éthanol à 96%, vortexez, puis centrifugez à 14 000 × g pendant 2 minutes. Éliminez le surnageant.
   7. Répétez le lavage à l’éthanol une fois de plus (2 lavages à l’éthanol au total).
   8. Séchez le culot à l’air pendant 10 minutes à température ambiante, couvercles ouverts, afin d’évaporer l’éthanol résiduel.
2. Extraction des protéines et sonication
   1. Ajoutez 200 µL de tampon de lyse à chaque culot sec.

      Remarque : bien que le sonicateur accepte jusqu’à 1 mL, 200 µL est le volume optimal pour le traitement en aval.

   2. Mélangez au vortex ou par pipetage doux.
3. Première incubation thermique
   1. Incubez les tubes à 95 °C pendant 30 min sous agitation à 400 rpm à l’aide d’un thermomixeur ou d’un bloc chauffant.
   2. Laissez refroidir les échantillons à température ambiante pendant 5 min.
4. Première sonication avec le VialTweeter
   1. Placez les tubes dans le VialTweeter.
   2. Réglez le VialTweeter UP200St sur les valeurs ci-dessous et lancez la sonication.
Réglages du sonicateur
• Réglez l’amplitude (A) sur 100%
• Réglez le mode de pulsation (C) sur 100%
• Period Clock : On
• Durée ON (On Time) : 60s
• Durée OFF (Off Time) : 30s
• Valeur limite (Limit Value) : 15 min (correspond à 10 cycles)
(Note de calcul : (60 s On + 30 s Off) × 10 cycles = 900 s = 15 min)
5. Deuxième incubation thermique
   Retirez les tubes et incubez-les à nouveau à 95 °C pendant 15 min, à 400 rpm.
6. Deuxième sonication
   Répétez la sonication dans le VialTweeter avec les mêmes réglages (voir ci-dessus) pendant 10 cycles supplémentaires (15 min au total).
7. Clarification du lysat
   1. Centrifugez les échantillons à 13 000 × g pendant 10 min à 23°C (température ambiante).
   2. Recueillez avec précaution le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf Safe-lock de 2,0 mL. Évitez de perturber le culot.
8. Traitement en aval
   Le lysat est maintenant prêt pour la purification SP3 et la digestion enzymatique.

Remarques et bonnes pratiques

1. Le risque de surchauffe pendant la sonication est atténué par des cycles ON/OFF programmés.
2. Évitez de vortexer après la sonication afin de prévenir l’agrégation des protéines.

Élimination des déchets et sécurité

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicateurs de laboratoire :