Hielscher Ultrasonics
Nous nous ferons un plaisir de discuter de votre processus.
Appelez-nous : +49 3328 437-420
Envoyez-nous un courrier : info@hielscher.com

Désparaffinisation et extraction de protéines à partir de FFPE

Facilitez l'extraction des protéines à partir de coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) en utilisant une combinaison optimisée de déparaffinisation, de solubilisation et de sonication avec un ultrasonateur multi-tubes VialTweeter. Ce protocole prend en charge la protéomique basée sur la spectrométrie de masse en aval et est compatible avec les flux de travail de nettoyage SP3 et de digestion enzymatique.

Cette SOP est destinée au personnel de laboratoire impliqué dans l'analyse protéomique d'échantillons de tissus FFPE à l'aide d'une sonication de haute performance. Elle est optimisée pour un maximum de dix échantillons FFPE traités en parallèle à l'aide du sonicateur multi-tubes VialTweeter.

Demande d'information







VialTweeter au processeur ultrasonique UP200ST

Sonicateur VialTweeter pour la sonication simultanée de 10 échantillons, par exemple pour la lyse et l'extraction de protéines à partir d'échantillons FFPE

Protocole : Extraction de protéines à partir d'échantillons FFPE à l'aide du VialTweeter

Matériaux et réactifs

réactifs

  • Xylène (qualité histologique)
  • Éthanol (absolu 96 %)
  • Tampon de lyse :
  • 6 M Chlorhydrate de guanidine
    50 mM Tris-HCl, pH 8,5
    10 mM TCEP (Tris(2-carboxyéthyl)phosphine)
    40 mM CAA (2-Chloroacétamide)

  • Inhibiteur de protéase (facultatif ; par exemple, cOmplete™ mini EDTA-free)

 
 

Equipement

  • Ultrasonateur multi-tubes VialTweeter
  • Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml ou 2,0 ml à faible liant
  • Bloc thermique ou incubateur (95°C et 80°C)
  • Microcentrifugeuse
  • Thermomixer (facultatif mais recommandé)

Exemple d'entrée

  • 1 à 2 sections de tissu FFPE de 10 µm d'épaisseur par échantillon (c'est-à-dire par flacon)
  • ou

  • Un total de ~100 µg de tissu par échantillon (c'est-à-dire par flacon)

Note : Utiliser des lames neuves pour la microtomie afin de minimiser la contamination par les débris de paraffine.

Procédure

  1. désparaffinage
    1. Transférer les sections FFPE dans des tubes de microcentrifugation à faible liant.
    2. Ajouter 1 ml de xylène, vortexer brièvement.
    3. Incuber 10 minutes à température ambiante.
    4. Centrifuger à 14 000 × g pendant 2 minutes ; éliminer le surnageant.
    5. Répéter le lavage au xylène une fois de plus (étapes 2-4).
    6. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 96 %, agiter au vortex, puis centrifuger à 14 000 × g pendant 2 minutes. Jeter le surnageant.
    7. Répéter le lavage à l'éthanol une fois de plus (2 lavages à l'éthanol au total).
    8. Sécher le culot à l'air pendant 10 minutes à température ambiante, couvercles ouverts, afin d'évaporer l'éthanol résiduel.
  2. Extraction des protéines et sonication
    1. Ajouter 200 µl de tampon de lyse à chaque culot sec.
      Remarque : bien que le sonicateur puisse contenir jusqu'à 1 ml, 200 µl est la quantité optimale pour le traitement en aval.

    2. Mélanger par vortex ou par pipetage doux.
  3. Première incubation thermique
    1. Incuber les tubes à 95 °C pendant 30 minutes, en les agitant à 400 rpm à l'aide d'un thermomix ou d'un bloc thermique.
    2. Laisser les échantillons refroidir à température ambiante pendant 5 minutes.
  4. Première sonication avec le VialTweeter
    1. Placer les tubes dans le VialTweeter.
    2. Régler le VialTweeter UP200St sur les valeurs ci-dessous et procéder à la sonication.
  5. Réglages du sonicateur
    - Régler l'amplitude (A) à 100 %.
    - Régler le mode de pulsation (C) sur 100%.
    - Horloge périodique : Activé
    - A l'heure : 60s
    - Temps d'arrêt : 30s
    - Valeur limite : 15 min (correspond à 10 cycles)
    (Note de calcul : (60 s Marche + 30 s Arrêt) × 10 cycles = 900 s = 15 min)
  6. Deuxième incubation thermique
    Retirer les tubes et incuber à nouveau à 95 °C pendant 15 minutes, 400 rpm.
  7. Deuxième sonication
    Répéter la sonication sur le VialTweeter en utilisant les mêmes réglages (comme ci-dessus) pour 10 cycles supplémentaires (15 min au total).
  8. Clarification du lysat
    1. Centrifuger les échantillons à 13 000 × g pendant 10 minutes à 23 °C (température ambiante).
    2. Recueillir soigneusement le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf Safe-lock de 2,0 ml. Éviter de déranger le culot.
  9. Traitement en aval
    Le lysat est maintenant prêt pour le nettoyage SP3 et la digestion enzymatique.

 

Le VialTweeter est un système ultrasonique unique permettant de sonifier simultanément jusqu'à 10 flacons dans les mêmes conditions, sans contamination croisée.

UP200St avec VialTweeter pour la sonication de flacons fermés

Vignette vidéo

 

VialTweeter avec tubes Eppendorf de 2,0 ml pour une préparation fiable des échantillons dans des conditions stériles

Hielscher VialTweeter avec 10 tubes Eppendorf

Demande d'information







Notes et bonnes pratiques

  1. Le risque de surchauffe pendant la sonication est atténué par un cycle ON/OFF programmé.
  2. Éviter le vortexage après la sonication pour éviter l'agrégation des protéines.

Élimination des déchets et sécurité

  • Le xylène et le chlorhydrate de guanidine sont des produits chimiques dangereux ; à manipuler sous une hotte.
  • Éliminer tous les solvants et déchets biologiques conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité et d'hygiène chimique.
  •  
     

    Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons de laboratoire :

    Dispositifs recommandés Volume du lot Débit
    UIP400MTP Sonicateur pour plaques de 96 puits plaques multi-puits / microtitres n.d.
    Cornet à ultrasons CupHorn pour flacons ou béchers n.d.
    GDmini2 réacteur ultrasonique à micro-flux n.d.
    VialTweeter 00,5 à 1,5 ml n.d.
    UP100H 1 à 500mL 10 à 200mL/min
    UP200Ht, UP200St 10 à 1000mL 20 à 200mL/min
    UP400St 10 à 2000mL 20 à 400mL/min
    Tamiseuse à ultrasons n.d. n.d.

    Demander plus d'informations

    Veuillez utiliser le formulaire ci-dessous pour demander des informations supplémentaires sur les processeurs à ultrasons, les applications et les prix. Nous nous ferons un plaisir de discuter avec vous de votre processus et de vous proposer un système à ultrasons répondant à vos exigences !









    Veuillez noter que notre Politique de confidentialité.




    Les homogénéisateurs ultrasoniques à haut cisaillement sont utilisés dans les laboratoires, les paillasses, les installations pilotes et les procédés industriels.

    Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons de haute performance pour les applications de mélange, de dispersion, d'émulsification et d'extraction à l'échelle du laboratoire, du pilote et de l'industrie.



    Littérature / Références

    Questions fréquemment posées

    Pourquoi les échantillons de tissus sont-ils fixés en tant que FFPE ?

    La conservation des tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine (FFPE) stabilise la morphologie des tissus et la structure des protéines en formant des liaisons transversales covalentes par l'intermédiaire du formaldéhyde. L'inclusion dans la paraffine permet un stockage à long terme à température ambiante tout en préservant l'intégrité histologique et moléculaire pour des analyses rétrospectives.

    Comment désaraffiner les échantillons FFPE ?

    La déparaffinisation implique des lavages séquentiels de solvants pour éliminer la paraffine : généralement deux incubations avec du xylène, suivies de deux lavages avec de l'éthanol (96 %). Après centrifugation et séchage, le tissu est prêt pour l'extraction en aval. Ce processus rétablit l'accessibilité de l'échantillon pour la lyse et la digestion enzymatique.

    Quel est le but de l'incubation thermique ?

    L'incubation thermique désigne l'exposition contrôlée d'un échantillon à une température définie pendant une période de temps spécifique afin d'induire des changements biochimiques ou physiques. En protéomique, elle est couramment utilisée pour dénaturer les protéines, inverser les liaisons transversales au formaldéhyde dans les tissus FFPE ou améliorer l'efficacité du tampon de lyse. La température et la durée sont des paramètres critiques, adaptés à la réaction cible ou au type d'échantillon.

    Qu'est-ce que la digestion SP3 ?

    Le Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) est un flux de travail protéomique basé sur des billes. Il utilise des billes paramagnétiques pour lier les protéines, ce qui permet un nettoyage efficace, une concentration et une digestion enzymatique sur les billes dans des conditions dénaturantes. SP3 minimise la perte d'échantillons et est hautement compatible avec les échantillons FFPE et à faible débit.


    Des ultrasons de haute performance ! La gamme de produits Hielscher couvre l'ensemble du spectre, de l'ultrasonateur de laboratoire compact aux systèmes ultrasoniques industriels complets, en passant par les unités de paillasse.

    Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons très performants à partir de laboratoires à taille industrielle.

    Nous nous ferons un plaisir de discuter de votre processus.

    Prenons contact.