Préparation d'échantillons FFPE à haut débit : Extraction des protéines et cisaillement de l'acide nucléique
Avec l'ultrasonateur à haut débit UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics relève les défis de la préparation des tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). Découvrez comment les ultrasons traitent les échantillons FFPE en grand nombre pour la déparaffinisation FFPE, la lyse des tissus, l'homogénéisation, l'extraction des protéines et le cisaillement de l'ADN et de l'ARN ! Tirez parti de la préparation ultrasonique des tissus FFPE – traitement de grands nombres d'échantillons dans des plaques multipuits ! Obtenez des échantillons de haute qualité et un grand nombre d'échantillons pour des résultats de recherche fiables ! Enfin, économisez du temps et de l'argent !
Préparation d'échantillons FFPE facilitée par la sonication à haut débit
La fixation au formol et l'inclusion dans la paraffine (FFPE) est la méthode la plus courante pour préserver et archiver les tissus solides. L'extraction de biomolécules à partir d'échantillons de tissus FFPE présente souvent des défis importants en raison de la qualité des échantillons stockés. Ces échantillons, qui sont des atouts inestimables en biologie moléculaire et en recherche clinique, constituent une riche source d'informations biologiques pour les études rétrospectives et la validation des biomarqueurs diagnostiques. Cependant, le processus de fixation au formol et d'inclusion en paraffine, tout en préservant l'architecture et la morphologie des tissus, complique l'extraction d'acides nucléiques et de protéines de haute qualité. Le formol induit une réticulation des acides nucléiques et des protéines, ce qui entraîne une fragmentation moléculaire et des modifications chimiques. Découvrez comment l'ultrasonateur à haut débit UIP400MTP permet de relever les défis de la préparation des échantillons FFPE !
Ultrasons pour une préparation efficace des échantillons FFPE
- Flux de travail facile à utiliser : Des processus simplifiés et conviviaux.
- Déparafinisation, extraction des protéines, cisaillement de l'ADN / ARN
- Traitement rapide à haut débit : Traitement efficace des plaques multi-puits.
- Déparaffinisation efficace : Amélioration de la solubilisation des protéines.
- Solvants non toxiques : Évite l'utilisation de solvants organiques nocifs tels que le xylène.
Sonicateur à haut débit UIP400MTP pour le traitement à haut débit d'échantillons FFPE dans des plaques multipuits
Progrès dans les techniques d'extraction de protéines à partir de tissus FFPE
Hielscher Ultrasonics relève les défis de la préparation d'échantillons FFPE à haut débit. La sonication utilise des ondes ultrasoniques pour générer des vibrations mécaniques et une cavitation ciblée, perturbant efficacement les structures cellulaires et améliorant la solubilisation des biomolécules. Cette technique a gagné en popularité en raison de sa capacité à augmenter l'efficacité et le rendement de l'extraction d'acides nucléiques et de protéines à partir de tissus FFPE, ainsi que le cisaillement de l'ADN et de l'ARN pour la préparation de librairies. Il est très important de souligner que l'ultrasonication à l'aide du sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP préserve l'intégrité de ces biomolécules pour les applications en aval.
Cisaillement des acides nucléiques par ultrasons à haut débit
L'ultrasonateur multi-puits UIP400MTP, destiné à être utilisé dans des environnements à haut débit, permet de franchir une nouvelle étape dans la préparation des échantillons FFPE. Cette méthode de sonication multi-puits offre une solution efficace et fiable pour le traitement simultané de plusieurs échantillons. Elle facilite l'extraction rapide et reproductible de l'ADN, de l'ARN et des protéines, qui sont essentiels pour diverses techniques analytiques, notamment le séquençage de nouvelle génération (NGS), la PCR quantitative et les analyses protéomiques. L'optimisation des paramètres de sonication, tels que l'amplitude, la durée et la température, améliore encore la qualité et la quantité des biomolécules extraites.
Le sonicateur UIP400MTP pour plaques multipuits offre des avantages significatifs pour la fragmentation et le cisaillement de l'ADN et de l'ARN à partir de tissus FFPE. L'une des caractéristiques les plus remarquables de ce système est sa capacité à obtenir des fragments d'ADN et d'ARN de taille étroite, en permettant un réglage précis de l'intensité de la sonication pour obtenir des fragments courts de 150 à 200 paires de bases (pb) ou des fragments plus longs de 15 à 20 paires de kilobases (kbp). Cette polyvalence rend l'UIP400MTP indispensable pour les applications de séquençage à lecture courte et à lecture longue, garantissant des résultats de haute qualité pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) et le séquençage du génome entier (WGS). Le contrôle précis de la taille des fragments est essentiel pour les chercheurs dans tous les domaines de la génomique, car il permet de préparer les échantillons conformément aux spécifications.
Contactez-nous pour des solutions avancées en matière de tissus FFPE
Découvrez le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP pour une récupération efficace des biomolécules à partir d'échantillons FFPE, en préservant l'intégrité des acides nucléiques et des protéines extraits et en garantissant la reproductibilité des résultats. Cette technologie s'intègre parfaitement à d'autres flux de travail préparatoires et analytiques, rationalisant et améliorant les investigations moléculaires à partir d'archives de tissus FFPE.
Les fixateurs et leurs effets
La fixation est une étape cruciale de la préparation des échantillons qui permet de préserver les structures cellulaires, d'arrêter les réactions biochimiques et de prévenir la dégradation. Différents fixateurs sont utilisés en fonction des exigences expérimentales spécifiques. Les deux fixateurs les plus courants sont le formaldéhyde et le paraformaldéhyde, qui réticulent les protéines et les acides nucléiques, préservant ainsi la morphologie et l'antigénicité des cellules et des tissus. D'autres fixateurs, tels que l'éthanol, le méthanol et le glutaraldéhyde, sont utilisés pour des applications spécifiques.
Les fixateurs formaldéhyde et paraformaldéhyde forment des ponts méthylène entre les groupes aminés, ce qui entraîne une réticulation des protéines. Ce processus immobilise efficacement les composants cellulaires, préservant leur intégrité au cours des étapes d'analyse ultérieures. Les effets de ces fixateurs peuvent être influencés par des facteurs tels que la concentration, le pH et la température, et l'optimisation de ces paramètres est cruciale pour garantir une préservation optimale des structures cellulaires.
Avantages de la préparation ultrasonique des FFPE
L'ultrasonication est une technique puissante de désintégration des cellules et des tissus fixés qui surpasse les techniques conventionnelles. Elle offre plusieurs avantages notables par rapport aux méthodes de lyse traditionnelles :
- Rapidité et efficacité : La lyse ultrasonique permet une perturbation rapide des cellules et des tissus, ce qui réduit considérablement le temps de traitement par rapport aux méthodes de lyse mécanique ou chimique. Les ondes sonores à haute fréquence générées par la sonde ultrasonique créent des forces de cisaillement mécaniques, provoquant la rupture des structures cellulaires fixées. Cette désintégration rapide et efficace permet aux chercheurs de traiter de grands volumes d'échantillons en peu de temps.
- Doux et ajustable : La lyse ultrasonique offre un mécanisme de désintégration en douceur qui minimise les dommages causés aux biomolécules sensibles telles que les protéines, les acides nucléiques et les enzymes. Contrairement aux méthodes mécaniques qui génèrent une chaleur ou des forces de cisaillement excessives, la lyse ultrasonique utilise une cavitation contrôlée pour désintégrer les cellules tout en préservant l'intégrité et la fonctionnalité des composants intracellulaires.
- Polyvalence : La lyse ultrasonique peut être appliquée à différents fixateurs, ce qui permet aux chercheurs de travailler avec une large gamme d'échantillons fixés. Qu'il s'agisse de formaldéhyde, de paraformaldéhyde ou d'autres fixateurs, la lyse ultrasonique permet une désintégration efficace et garantit une récupération optimale des composants cellulaires.
- Rendement et qualité élevés : La lyse ultrasonique permet d'obtenir des rendements élevés de composants cellulaires intacts grâce à sa capacité à perturber uniformément les cellules et les tissus fixés. Cela permet aux applications en aval telles que l'analyse des protéines, l'extraction des acides nucléiques et les essais enzymatiques d'obtenir des résultats fiables et reproductibles.
- Compatibilité avec l'automatisation : La lyse ultrasonique peut être facilement intégrée dans des systèmes automatisés, ce qui permet un traitement des échantillons à haut débit. Cette compatibilité permet aux chercheurs de rationaliser leur flux de travail et d'augmenter leur productivité, en particulier dans les études à grande échelle.
Sonicateur pour plaques à 96 puits UIP400MTP pour la sonication des plaques de microtitration et des plaques multipuits
La lyse ultrasonique a révolutionné la perturbation des cellules et des tissus fixés, offrant de nombreux avantages par rapport aux méthodes de lyse traditionnelles. Sa rapidité, son efficacité, sa sélectivité, sa polyvalence, son rendement élevé et sa compatibilité avec l'automatisation en font un outil indispensable pour la recherche en biologie moléculaire et en biotechnologie. Avec ses sonicateurs sans contact et ses sonicateurs à sonde, Hielscher Ultrasonics propose l'homogénéisateur à ultrasons le mieux adapté à votre application dans le domaine des sciences de la vie. Que vous souhaitiez traiter simultanément des échantillons uniques, des échantillons multiples ou un très grand nombre d'échantillons, nous vous proposerons le sonicateur le mieux adapté à vos besoins en matière de recherche et de diagnostic.
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Conception, fabrication et conseil – Qualité Made in Germany
Les ultrasons Hielscher sont réputés pour leur qualité et leurs normes de conception les plus élevées. La robustesse et la facilité d'utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasons dans les installations industrielles. Les conditions difficiles et les environnements exigeants sont facilement gérés par les ultrasons Hielscher.
Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO et met l'accent sur les ultrasons de haute performance, dotés d'une technologie de pointe et d'une grande facilité d'utilisation. Bien entendu, les ultrasons Hielscher sont conformes à la norme CE et répondent aux exigences des normes UL, CSA et RoHs.
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UIP400MTP Ultrasonator : Préparation d'échantillons FFPE à haut débit en plaques multi-puits
FAQ
Nous répondons ci-dessous aux questions fréquemment posées concernant la préparation des tissus FFPE et l'ultrasonisation des échantillons FFPE.
Comment le tissu FFPE est-il préparé ?
Étapes de la préparation des tissus FFPE : La manipulation et le traitement méticuleux des tissus frais sont essentiels à la production d'échantillons FFPE de haute qualité. La préservation de l'architecture cellulaire, des acides nucléiques et des protéines est essentielle pour une analyse précise en aval. Chaque étape - du prélèvement à l'inclusion - exige de la précision pour maintenir l'intégrité de l'échantillon en vue de diverses analyses, notamment l'examen histologique, l'immunohistochimie et les études moléculaires. Correctement exécuté, ce processus de fixation et d'inclusion garantit que le tissu préservé reflète fidèlement l'état in vivo, ce qui permet d'obtenir des résultats fiables en matière de diagnostic et de recherche.
Nous vous présentons les 6 principales étapes du processus d'inclusion des échantillons de tissus FFPE.
- Collection de tissus
Les biopsies de mammifères vivants et les cultures de tissus sont deux sources viables pour l'obtention de tissus frais en vue de la préparation d'échantillons FFPE.
Il est important d'utiliser une technique aseptique : Utiliser des instruments et des gants stériles pour éviter toute contamination. Idéalement, les tissus doivent être prélevés dans un environnement stérile, tel qu'une salle d'opération ou une hotte à flux laminaire.
Le spécimen étant très fragile, il est essentiel de le manipuler avec délicatesse : Réduire au minimum les délais de traitement et commencer immédiatement le traitement du tissu après l'excision. Ceci est crucial pour éviter l'autolyse et la dégradation. Conservez le tissu à température ambiante ; évitez la congélation car elle peut entraîner la formation de cristaux de glace et endommager le tissu. - Fixation des tissus
Le tissu est d'abord traité avec une solution de fixation : Utiliser du formol tamponné neutre (FBN) à 10 %, ce qui équivaut à 4 % de formaldéhyde dans l'eau, tamponné à un pH neutre.
Immerger complètement le tissu dans le formol. Veiller à ce que le rapport entre le volume du fixateur et celui du tissu soit d'au moins 10:1. La durée de fixation varie généralement de 6 à 24 heures, en fonction du type et de la taille du tissu. Il est important que le fixateur puisse pénétrer complètement dans le tissu. Toutefois, une fixation excessive peut entraîner une réticulation qui complique la récupération des antigènes, tandis qu'une fixation insuffisante peut entraîner une mauvaise conservation des tissus. - Parage des tissus
Deuxièmement, couper le tissu à une épaisseur d'environ 3-5 mm pour permettre une pénétration adéquate du fixateur. Veillez à ce que le tissu soit correctement orienté afin de capturer les structures histologiques pertinentes. Cela facilite le processus d'extraction lorsque le tissu est utilisé ultérieurement pour l'analyse. - Traitement de l'échantillon fixé
Le tissu fixé doit ensuite être déshydraté : Après la fixation, le tissu doit être déshydraté pour assurer une bonne pénétration de la paraffine. Passez le tissu dans une série graduée d'éthanol (70 %, 80 %, 90 % et 100 %) pour éliminer l'eau.
Nettoyage au xylène : La paraffine est insoluble dans l'eau, mais soluble dans le xylène. L'eau contenue dans le tissu doit donc être remplacée par du xylène. Cependant, le xylène lui-même est insoluble dans l'eau mais soluble dans l'alcool, ce qui nécessite une étape intermédiaire où l'eau est d'abord remplacée par de l'alcool.immerger le tissu dans du xylène ou un substitut de xylène pour éliminer l'éthanol et préparer le tissu pour l'infiltration de paraffine.
Infiltration à la paraffine : Incorporer le tissu dans de la paraffine fondue, en veillant à ce que l'infiltration soit complète. Cette étape implique généralement plusieurs changements de paraffine pour assurer une imprégnation complète. - Incorporation du tissu
Au cours de cette étape, le tissu est moulé en un bloc de tissu : Placer le tissu dans un moule avec l'orientation souhaitée et verser de la paraffine fondue dessus. Laisser la paraffine se solidifier en la refroidissant à température ambiante ou sur une plaque froide. - Sectionnement et montage
Microtomie : pour découper le tissu inclus, on utilise un microtome pour couper de fines sections (généralement de 4 à 5 micromètres) dans le bloc de paraffine. L'échantillon est ensuite monté, les sections étant placées sur des lames de verre en vue d'une coloration et d'une analyse microscopique ultérieures.
Enfin, vérifiez la qualité de l'histologie : Évaluer les premières coupes au microscope pour s'assurer que la fixation et le traitement sont corrects. Ajustez les protocoles si nécessaire en fonction du type de tissu et de la qualité observée.
Les tissus FFPE peuvent être utilisés pour récupérer de l'ARN, de l'ADN et des protéines, ainsi que pour découvrir des signes de cancer ou d'autres maladies. Ils peuvent être conservés pendant des années et constituent un élément essentiel de la manière dont les chercheurs et les médecins exploitent les échantillons de tissus à des fins de diagnostic et de recherche.
Quels sont les problèmes et les défis courants liés aux tissus FFPE ?
Les échantillons de tissus fixés au formol et enrobés de paraffine (FFPE) sont largement utilisés dans la recherche et le diagnostic, mais ils présentent plusieurs défis et problèmes communs :
- Dégradation des biomolécules : Une fixation prolongée peut entraîner la dégradation de l'ADN, de l'ARN et des protéines, ce qui rend difficile l'extraction d'acides nucléiques ou de protéines de haute qualité pour les applications en aval. Une fixation correcte (évitant la sous-fixation et la sur-fixation) est essentielle pour la préservation des tissus.
- Masquage de l'antigène : Le processus de fixation peut masquer les sites antigéniques, réduisant ainsi l'efficacité de la liaison des anticorps en immunohistochimie et dans d'autres tests immunologiques. Cette situation nécessite souvent la récupération d'antigènes, une procédure qui permet d'inverser le masquage d'un épitope et de rétablir la liaison entre l'épitope et l'anticorps. Cependant, l'antigénicité totale n'est pas toujours rétablie.
- Qualité variable de la fixation : Les différences de temps et de conditions de fixation peuvent conduire à une qualité inégale des échantillons, ce qui affecte la reproductibilité et la comparabilité des résultats. Utilisez des protocoles de fixation fiables et évitez la sous-fixation et la sur-fixation.
- Dommages et fragmentation de l'ADN : La fixation au formol des échantillons FFPE peut provoquer divers types de dommages à l'ADN, notamment la désamination de la cytosine (mutations de C en T), des dommages oxydatifs (par exemple, la 8-oxo-guanine entraînant des mutations de G en T), ainsi que des perturbations physiques telles que des entailles, des lacunes et des sites abasiques qui entravent l'activité de l'ADN-polymérase. Le processus de fixation au formol peut entraîner une fragmentation de l'ADN, ce qui complique les analyses génétiques et génomiques telles que la PCR et le séquençage.
- Qualité de l'ARN : L'ARN extrait des tissus FFPE est souvent fragmenté et chimiquement modifié, ce qui rend difficile la réalisation d'analyses transcriptomiques de haute qualité.
- Modifications des protéines : La formaline peut induire des modifications chimiques dans les protéines, affectant leur structure et leur fonction, ce qui peut interférer avec les analyses protéomiques.
- Artéfacts de traitement des échantillons : Au cours du processus d'inclusion et de sectionnement, le stress mécanique et la chaleur peuvent introduire des artefacts et causer d'autres dommages au tissu.
- Variabilité d'un lot à l'autre : Les variations dans les protocoles de fixation et d'inclusion entre les différents lots peuvent entraîner une variabilité importante des résultats, ce qui complique les comparaisons entre les études.
- Problèmes de stockage : Le stockage à long terme des blocs FFPE peut entraîner une dégradation supplémentaire et une perte d'intégrité de l'acide nucléique au fil du temps, ce qui a un impact sur la viabilité des échantillons archivés pour les études rétrospectives.
Réticulation : La fixation au formol entraîne la réticulation des protéines et des acides nucléiques, ce qui peut entraver l'analyse moléculaire et affecter la précision de l'immunohistochimie et d'autres tests.
L'utilisation de protocoles optimisés, la manipulation soigneuse des échantillons et l'application de techniques avancées permettent d'améliorer la qualité et la fiabilité des données obtenues à partir de tissus FFPE.
Quelle est la différence entre un tissu FFPE et un tissu congelé ?
Les tissus FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) sont conservés à l'aide de formol pour fixer le tissu et sont ensuite inclus dans de la paraffine, ce qui permet un stockage à long terme à température ambiante tout en conservant la morphologie du tissu. En revanche, les tissus congelés sont rapidement conservés par congélation, ce qui permet de mieux préserver l'intégrité des acides nucléiques et des protéines, mais nécessite un stockage à très basse température.
Quels sont les produits chimiques utilisés pour l'inclusion de FFPE ?
Les produits chimiques utilisés pour l'inclusion FFPE comprennent normalement le formol pour la fixation et la cire de paraffine pour l'inclusion. Pour l'inclusion FFPE, les tissus sont généralement fixés à l'aide de formol tamponné neutre à 10 % (v/v) (FA) ou d'une solution de formaldéhyde à 4 % (p/v) fraîchement préparée (PFA) à partir de poudre de paraformaldéhyde. Le formol, qui est une solution de formaldéhyde dans l'eau, est tamponné à un pH neutre afin de préserver la morphologie des tissus et d'éviter une réticulation excessive. La solution à base de paraformaldéhyde assure également une fixation efficace en réticulant les protéines, ce qui stabilise la structure du tissu en vue de son inclusion ultérieure dans la cire de paraffine. Ces produits chimiques sont essentiels pour maintenir l'intégrité et la morphologie des tissus pendant le processus de fixation et d'inclusion.
Comment la paraffine est-elle retirée des échantillons FFPE ?
Pour éliminer la paraffine des échantillons FFPE, les coupes de tissus sont généralement soumises à une série de lavages au xylène, suivis d'une réhydratation à l'aide d'une série graduée d'alcools et enfin d'eau. Le xylène étant très toxique et présentant des risques pour la santé (problèmes respiratoires, irritation de la peau et effets potentiels à long terme en cas d'exposition répétée), l'élimination de la paraffine par ultrasons apparaît comme une alternative prometteuse dans de nombreux laboratoires. Cette méthode utilise des ondes ultrasoniques intenses pour éliminer efficacement et en toute sécurité la paraffine sans avoir recours à des solvants toxiques comme le xylène, réduisant ainsi les risques pour le personnel de laboratoire et créant un environnement de travail plus sûr.
Combien de temps dois-je fixer mes tissus pour obtenir une bonne qualité d'échantillon FFPE ?
Les recommandations générales concernant la durée de fixation suggèrent généralement de fixer les échantillons de tissus dans le formol pendant 24 à 48 heures. Cette durée est généralement suffisante pour préserver la morphologie des tissus et les structures cellulaires tout en minimisant la sur-fixation, qui peut entraîner une réticulation et une dégradation excessives des acides nucléiques et des protéines. Toutefois, la durée de fixation optimale peut varier en fonction de la taille et du type de tissu, les échantillons plus petits ou plus délicats nécessitant des durées de fixation plus courtes. Il est essentiel de trouver un équilibre entre une fixation adéquate pour prévenir l'autolyse et la dégradation des tissus tout en évitant une fixation prolongée qui pourrait compliquer les analyses moléculaires en aval.