Préparation d’échantillons FFPE à haute cadence : extraction de protéines et cisaillement des acides nucléiques
Avec l’ultrasonicateur à haute cadence UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics relève les défis de la préparation des tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). Découvrez comment la sonication traite les échantillons FFPE en grand nombre pour le déparaffinage FFPE, la lyse tissulaire, l’homogénéisation, l’extraction de protéines et le cisaillement de l’ADN/ARN ! Profitez de la préparation des tissus FFPE par ultrasons – traitement d’un grand nombre d’échantillons en plaques multipuits ! Obtenez des échantillons de haute qualité en grand nombre pour des résultats de recherche fiables ! Et enfin, et surtout, économisez du temps et de l’argent !
Préparation d’échantillons FFPE facilitée par la sonication à haute cadence
La fixation au formol et l’inclusion en paraffine (FFPE) constituent la méthode la plus courante pour conserver et archiver les tissus solides. L’extraction de biomolécules à partir d’échantillons de tissus FFPE pose souvent des difficultés importantes en raison de la qualité des échantillons stockés. Ces échantillons, qui représentent des ressources inestimables en biologie moléculaire et en recherche clinique, constituent une riche source d’informations biologiques pour les études rétrospectives et la validation de biomarqueurs diagnostiques. Cependant, le processus de fixation au formol et d’inclusion en paraffine, s’il préserve l’architecture et la morphologie des tissus, complique l’extraction d’acides nucléiques et de protéines de haute qualité. Le formol induit une réticulation des acides nucléiques et des protéines, entraînant une fragmentation moléculaire et des modifications chimiques. Découvrez comment l’ultrasonicateur à haute cadence UIP400MTP surmonte les défis de la préparation des échantillons FFPE !
Ultrasonicateur pour une préparation efficace des échantillons FFPE
- Flux de travail facile à utiliser : des processus simplifiés et conviviaux.
- Déparaffinage, extraction de protéines, cisaillement de l’ADN / ARN
- Traitement rapide à haute cadence : manipulation efficace des plaques multipuits.
- Déparaffinage efficace : solubilisation améliorée des protéines.
- Solvants non toxiques : évite l’utilisation de solvants organiques nocifs tels que le xylène.
Sonicateur à haute cadence UIP400MTP pour le traitement à haute cadence d’échantillons FFPE en plaques multipuits
Progrès des techniques d’extraction de protéines à partir de tissus FFPE
Hielscher Ultrasonics relève les défis de la préparation à haute cadence des échantillons FFPE. La sonication utilise des ondes ultrasonores pour générer des vibrations mécaniques et une cavitation focalisée, qui rompent efficacement les structures cellulaires et favorisent la solubilisation des biomolécules. Cette technique a gagné en popularité grâce à sa capacité à augmenter l’efficacité et le rendement de l’extraction des acides nucléiques et des protéines à partir de tissus FFPE, ainsi que du cisaillement de l’ADN et de l’ARN pour la préparation de banques. Il est très important de souligner que la sonication au moyen du sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP préserve l’intégrité de ces biomolécules pour les applications en aval.
Cisaillement des acides nucléiques par sonication à haute cadence
L’ultrasonicateur multipuits UIP400MTP, destiné aux environnements à haute cadence, porte la préparation des échantillons FFPE à un nouveau niveau. Cette méthode de sonication en plaques multipuits offre une solution efficace et fiable pour le traitement simultané de plusieurs échantillons. Elle facilite l’extraction rapide et reproductible de l’ADN, de l’ARN et des protéines, essentiels pour diverses techniques analytiques, notamment le séquençage de nouvelle génération (NGS), la PCR quantitative et les analyses protéomiques. L’optimisation des paramètres de sonication, tels que l’amplitude, la durée et la température, améliore encore la qualité et la quantité des biomolécules extraites.
Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP offre des avantages significatifs pour la fragmentation et le cisaillement de l’ADN et de l’ARN issus de tissus FFPE. L’une des caractéristiques remarquables de ce système est sa capacité à obtenir des tailles de fragments d’ADN et d’ARN dans une plage étroite, grâce à un réglage précis de l’intensité de sonication permettant d’obtenir des fragments courts de 150–200 paires de bases (pb) ou des fragments plus longs de 15–20 kilopaires de bases (kpb). Cette polyvalence rend l’UIP400MTP indispensable pour les applications de séquençage à lectures courtes comme à lectures longues, garantissant des résultats de haute qualité pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) et le séquençage du génome entier (WGS). Son contrôle précis de la taille des fragments est crucial pour les chercheurs de tous les domaines de la génomique, car il permet de préparer les échantillons conformément aux spécifications.
Contactez-nous pour des solutions avancées pour les tissus FFPE
Découvrez le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP pour une récupération efficace des biomolécules à partir d’échantillons FFPE, qui préserve l’intégrité des acides nucléiques et des protéines extraits et garantit la reproductibilité des résultats. Cette technologie s’intègre parfaitement aux autres flux de travail préparatifs et analytiques, simplifiant et améliorant les investigations moléculaires utilisant des archives de tissus FFPE.
Les fixateurs et leurs effets
La fixation est une étape cruciale de la préparation des échantillons, qui préserve les structures cellulaires, arrête les réactions biochimiques et empêche la dégradation. Différents fixateurs sont employés en fonction des exigences expérimentales spécifiques. Les deux fixateurs les plus courants sont le formaldéhyde et le paraformaldéhyde, qui réticulent les protéines et les acides nucléiques, préservant ainsi la morphologie et l’antigénicité des cellules et des tissus. D’autres fixateurs, tels que l’éthanol, le méthanol et le glutaraldéhyde, sont utilisés pour des applications spécifiques.
Les fixateurs à base de formaldéhyde et de paraformaldéhyde forment des ponts méthylène entre les groupes amino, ce qui entraîne une réticulation des protéines. Ce processus immobilise efficacement les composants cellulaires, préservant leur intégrité lors des étapes d’analyse ultérieures. Les effets de ces fixateurs peuvent être influencés par des facteurs tels que la concentration, le pH et la température, et l’optimisation de ces paramètres est cruciale pour garantir une conservation optimale des structures cellulaires.
Avantages de la préparation FFPE par ultrasons
La sonication est une technique puissante pour rompre les cellules et tissus fixés, qui surpasse les techniques conventionnelles. Elle offre plusieurs avantages notables par rapport aux méthodes de lyse traditionnelles :
- Rapidité et efficacité : La lyse par ultrasons permet une rupture rapide des cellules et des tissus, réduisant considérablement le temps de traitement par rapport aux méthodes de lyse mécaniques ou chimiques. Les ondes sonores à haute fréquence générées par la sonde à ultrasons créent des forces de cisaillement mécaniques qui provoquent la rupture des structures cellulaires fixées. Cette rupture rapide et efficace permet aux chercheurs de traiter de grands volumes d’échantillons en peu de temps.
- Douce et réglable : La lyse par ultrasons offre un mécanisme de rupture doux qui minimise les dommages aux biomolécules sensibles telles que les protéines, les acides nucléiques et les enzymes. Contrairement aux méthodes mécaniques qui génèrent une chaleur ou des forces de cisaillement excessives, la lyse par ultrasons utilise une cavitation contrôlée pour rompre les cellules tout en préservant l’intégrité et la fonctionnalité des composants intracellulaires.
- Polyvalence : La lyse par ultrasons peut être appliquée avec divers fixateurs, ce qui permet aux chercheurs de travailler avec un large éventail d’échantillons fixés. Que l’on utilise du formaldéhyde, du paraformaldéhyde ou d’autres fixateurs, la lyse par ultrasons assure systématiquement une rupture efficace, garantissant une récupération optimale des composants cellulaires.
- Rendement et qualité élevés : La lyse par ultrasons favorise des rendements élevés en composants cellulaires intacts grâce à sa capacité à rompre uniformément les cellules et tissus fixés. Cela permet aux applications en aval, telles que l’analyse des protéines, l’extraction des acides nucléiques et les dosages enzymatiques, de fournir des résultats fiables et reproductibles.
- Compatibilité avec l’automatisation : La lyse par ultrasons peut être facilement intégrée dans des systèmes automatisés, permettant un traitement des échantillons à haute cadence. Cette compatibilité permet aux chercheurs de rationaliser leur flux de travail et d’accroître leur productivité, en particulier dans les études à grande échelle.
Sonicateur pour plaques à 96 puits UIP400MTP pour la sonication des plaques de microtitration et des plaques multipuits
La lyse par ultrasons a révolutionné la rupture des cellules et tissus fixés, offrant de nombreux avantages par rapport aux méthodes de lyse traditionnelles. Sa rapidité, son efficacité, sa sélectivité, sa polyvalence, son rendement élevé et sa compatibilité avec l’automatisation en font un outil indispensable en biologie moléculaire et en recherche biotechnologique. Proposant aussi bien des sonicateurs sans contact que des sonicateurs à sonde, Hielscher Ultrasonics offre l’homogénéisateur à ultrasons le plus adapté à votre application en sciences de la vie. Que vous souhaitiez traiter des échantillons individuels, plusieurs échantillons ou un très grand nombre d’échantillons simultanément, nous vous proposerons le sonicateur le mieux adapté à vos exigences en matière de recherche et de diagnostic.
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- investissement unique
- utilisez vos propres consommables
- pas de coûts récurrents pour des accessoires et consommables propriétaires
- haute cadence
- contrôle de précision
- technologie de pointe
- fiabilité et robustesse
- contrôle du processus réglable et précis
- qualité industrielle : fonctionnement continu possible 24/7
- utilisation simple et sûre
- faible maintenance
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Conception, fabrication et conseil – qualité « Made in Germany »
Les ultrasonicateurs Hielscher sont réputés pour leurs normes de qualité et de conception les plus élevées. Leur robustesse et leur facilité d’utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasonicateurs dans les installations industrielles. Les ultrasonicateurs Hielscher maîtrisent sans difficulté les conditions rudes et les environnements exigeants.
Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO qui accorde une importance particulière aux ultrasonicateurs hautes performances alliant technologie de pointe et convivialité. Bien entendu, les ultrasonicateurs Hielscher sont conformes CE et satisfont aux exigences UL, CSA et RoHs.
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Ultrasonicateur UIP400MTP : Préparation d’échantillons FFPE à haute cadence en plaque multipuits
FAQ
Nous répondons ci-dessous aux questions fréquentes concernant la préparation des tissus FFPE et la sonication des échantillons FFPE.
Comment les tissus FFPE sont-ils préparés ?
Étapes de préparation des tissus FFPE : la manipulation et le traitement minutieux des tissus frais sont essentiels pour obtenir des échantillons FFPE de haute qualité. Garantir la préservation de l’architecture cellulaire, des acides nucléiques et des protéines est indispensable à une analyse en aval précise. Chaque étape – du prélèvement à l’inclusion – exige de la précision pour maintenir l’intégrité de l’échantillon en vue de diverses analyses, notamment l’examen histologique, l’immunohistochimie et les études moléculaires. Correctement exécuté, ce processus de fixation et d’inclusion garantit que le tissu conservé reflète fidèlement l’état in vivo, permettant des résultats diagnostiques et de recherche fiables.
Nous vous présentons les 6 principales étapes du processus d’inclusion des échantillons de tissus FFPE.
- Prélèvement des tissus
Les biopsies provenant de mammifères vivants et les cultures tissulaires sont toutes deux des sources viables de tissu frais pour la préparation d’échantillons FFPE.
Il est important d’utiliser une technique aseptique : utilisez des instruments et des gants stériles pour éviter toute contamination. Idéalement, prélevez les tissus dans un environnement stérile, tel qu’un bloc opératoire ou une hotte à flux laminaire.
Le spécimen étant très fragile, une manipulation délicate est essentielle : réduisez au minimum les délais de traitement et commencez immédiatement le traitement ultérieur du tissu après l’excision. Ceci est crucial pour prévenir l’autolyse et la dégradation. Conservez le tissu à température ambiante ; évitez la congélation, car elle peut provoquer la formation de cristaux de glace et endommager le tissu. - Fixation des tissus
Tout d’abord, le tissu est traité avec une solution fixatrice : utilisez du formol tamponné neutre à 10 % (NBF), qui équivaut à du formaldéhyde à 4 % dans l’eau, tamponné à pH neutre.
Immergez complètement le tissu dans le formol. Veillez à un rapport volumique fixateur/tissu d’au moins 10:1. La durée de fixation varie généralement de 6 à 24 heures, selon le type et la taille du tissu. Il est important que le fixateur puisse pénétrer complètement le tissu. Toutefois, une surfixation peut entraîner une réticulation qui complique la restauration antigénique, tandis qu’une sous-fixation peut conduire à une mauvaise conservation du tissu. - Découpe des tissus
Deuxièmement, découpez le tissu à une épaisseur d’environ 3–5 mm afin de permettre une pénétration adéquate du fixateur. Veillez à une orientation correcte du tissu pour saisir les structures histologiques pertinentes. Cela facilite le processus d’extraction lorsque le tissu est ultérieurement utilisé pour l’analyse. - Traitement de l’échantillon fixé
Le tissu fixé doit maintenant être déshydraté : après la fixation, le tissu doit être déshydraté afin d’assurer une pénétration complète de la cire de paraffine. Faites passer le tissu par une série graduée d’éthanol (70 %, 80 %, 90 % et 100 %) pour éliminer l’eau.
Éclaircissement au xylène : la cire de paraffine est insoluble dans l’eau, mais soluble dans le xylène. L’eau contenue dans le tissu doit donc être remplacée par du xylène. Cependant, le xylène lui-même est insoluble dans l’eau mais soluble dans l’alcool, ce qui nécessite une étape intermédiaire au cours de laquelle l’eau est d’abord remplacée par de l’alcool. Immergez le tissu dans du xylène ou un substitut du xylène pour éliminer l’éthanol et préparer le tissu à l’imprégnation en paraffine.
Imprégnation en paraffine : incluez le tissu dans de la cire de paraffine fondue, en veillant à une imprégnation complète. Cette étape implique généralement plusieurs bains de paraffine successifs pour assurer une imprégnation en profondeur. - Inclusion du tissu
Lors de cette étape, le tissu est moulé en un bloc tissulaire : placez le tissu dans un moule selon l’orientation souhaitée et versez de la paraffine fondue par-dessus. Laissez la paraffine se solidifier en refroidissant à température ambiante ou sur une plaque froide. - Coupe et montage
Microtomie : pour trancher le tissu inclus, utilisez un microtome afin de réaliser des coupes fines (généralement 4–5 micromètres) à partir du bloc de paraffine. L’échantillon est ensuite monté, les coupes étant placées sur des lames de verre en vue de la coloration et de l’analyse microscopique ultérieures.
Enfin, vérifiez la qualité histologique : examinez les premières coupes au microscope pour vous assurer que la fixation et le traitement sont corrects. Ajustez les protocoles si nécessaire en fonction du type de tissu et de la qualité observée.
Les tissus FFPE peuvent être utilisés pour récupérer de l’ARN, de l’ADN et des protéines, ainsi que pour détecter des signes de cancer ou d’autres maladies. Ils peuvent être conservés pendant des années et constituent un élément essentiel de la manière dont les chercheurs et les médecins exploitent les échantillons tissulaires à des fins de diagnostic et de recherche.
Quels sont les problèmes et défis courants liés aux tissus FFPE ?
Les échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) sont largement utilisés en recherche et en diagnostic, mais ils présentent plusieurs défis et problèmes courants :
- Dégradation des biomolécules : Une fixation prolongée peut entraîner la dégradation de l’ADN, de l’ARN et des protéines, ce qui rend difficile l’extraction d’acides nucléiques ou de protéines de haute qualité pour les applications en aval. Une fixation correcte (en évitant la sous-fixation et la surfixation) est essentielle à la conservation des tissus.
- Masquage des antigènes : Le processus de fixation peut masquer les sites antigéniques, réduisant l’efficacité de la liaison des anticorps en immunohistochimie et dans d’autres dosages immunologiques. Cela nécessite souvent une restauration antigénique, une procédure par laquelle le masquage d’un épitope est inversé et la liaison épitope-anticorps est rétablie. Toutefois, l’antigénicité complète n’est pas toujours restaurée.
- Qualité de fixation variable : Des différences dans les durées et les conditions de fixation peuvent entraîner une qualité d’échantillon inégale, affectant la reproductibilité et la comparabilité des résultats. Utilisez des protocoles de fixation fiables et évitez la sous-fixation et la surfixation.
- Dommages et fragmentation de l’ADN : La fixation au formol des échantillons FFPE peut provoquer divers types de dommages à l’ADN, notamment la désamination de la cytosine (mutations C vers T), des dommages oxydatifs (p. ex. la 8-oxo-guanine entraînant des mutations G vers T), ainsi que des altérations physiques telles que des coupures (nicks), des brèches et des sites abasiques qui entravent l’activité de l’ADN polymérase. Le processus de fixation au formol peut provoquer une fragmentation de l’ADN, compliquant les analyses génétiques et génomiques telles que la PCR et le séquençage.
- Qualité de l’ARN : L’ARN extrait de tissus FFPE est souvent fragmenté et chimiquement modifié, ce qui complique la réalisation d’analyses transcriptomiques de haute qualité.
- Modifications des protéines : Le formol peut induire des modifications chimiques des protéines, affectant leur structure et leur fonction, ce qui peut interférer avec les analyses protéomiques.
- Artefacts liés au traitement des échantillons : Au cours du processus d’inclusion et de coupe, les contraintes mécaniques et la chaleur peuvent introduire des artefacts et endommager davantage le tissu.
- Variabilité d’un lot à l’autre : Les variations des protocoles de fixation et d’inclusion entre différents lots peuvent entraîner une variabilité importante des résultats, compliquant les comparaisons entre études.
- Problèmes de stockage : Le stockage à long terme des blocs FFPE peut entraîner une dégradation supplémentaire et une perte d’intégrité des acides nucléiques au fil du temps, ce qui compromet l’exploitabilité des échantillons d’archives pour les études rétrospectives.
Réticulation : La fixation au formol provoque une réticulation des protéines et des acides nucléiques, ce qui peut entraver l’analyse moléculaire et affecter la précision de l’immunohistochimie et d’autres dosages.
L’utilisation de protocoles optimisés, une manipulation soigneuse des échantillons et l’application de techniques avancées contribuent à améliorer la qualité et la fiabilité des données obtenues à partir de tissus FFPE.
Quelle est la différence entre les tissus FFPE et les tissus congelés ?
Le tissu FFPE (fixé au formol et inclus en paraffine) est conservé en fixant le tissu au formol, puis en l’incluant dans de la cire de paraffine, ce qui permet un stockage à long terme à température ambiante tout en préservant la morphologie tissulaire. En revanche, le tissu congelé est rapidement conservé par congélation, ce qui préserve mieux l’intégrité des acides nucléiques et des protéines, mais nécessite un stockage à très basse température.
Quels produits chimiques sont utilisés pour l’inclusion FFPE ?
Les produits chimiques utilisés pour l’inclusion FFPE comprennent normalement le formol pour la fixation et la cire de paraffine pour l’inclusion. Pour l’inclusion FFPE, les tissus sont généralement fixés soit avec du formol tamponné neutre à 10 % (v/v) (FA), soit avec une solution de formaldéhyde à 4 % (w/v) (PFA) fraîchement préparée à partir de poudre de paraformaldéhyde. Le formol, qui est une solution de formaldéhyde dans l’eau, est tamponné à pH neutre afin de préserver la morphologie tissulaire et d’éviter une réticulation excessive. La solution à base de paraformaldéhyde assure également une fixation efficace par réticulation des protéines, stabilisant ainsi la structure tissulaire en vue de l’inclusion ultérieure dans la cire de paraffine. Ces produits chimiques sont essentiels pour maintenir l’intégrité et la morphologie des tissus pendant le processus de fixation et d’inclusion.
Comment la paraffine est-elle éliminée des échantillons FFPE ?
Pour éliminer la paraffine des échantillons FFPE, les coupes de tissu sont généralement soumises à une série de lavages au xylène, suivie d’une réhydratation par une série graduée d’alcools, puis enfin par de l’eau. Le xylène étant hautement toxique et présentant des risques pour la santé tels que des troubles respiratoires, une irritation cutanée et d’éventuels effets à long terme en cas d’exposition répétée, le déparaffinage par ultrasons s’impose comme une alternative prometteuse dans de nombreux laboratoires. Cette méthode utilise des ondes ultrasonores intenses pour éliminer la paraffine de manière efficace et sûre, sans recourir à des solvants toxiques comme le xylène, réduisant ainsi les risques pour le personnel de laboratoire et créant un environnement de travail plus sûr.
Combien de temps dois-je fixer mes tissus pour obtenir des échantillons FFPE de bonne qualité ?
Les recommandations générales concernant la durée de fixation préconisent généralement de fixer les échantillons de tissu dans le formol pendant 24 à 48 heures. Cette durée est en général suffisante pour préserver la morphologie tissulaire et les structures cellulaires tout en minimisant la surfixation, qui peut entraîner une réticulation excessive et une dégradation des acides nucléiques et des protéines. Toutefois, la durée de fixation optimale peut varier selon la taille et le type de tissu, les échantillons plus petits ou plus délicats nécessitant des durées de fixation plus courtes. Il est essentiel de trouver un équilibre entre une fixation suffisante pour prévenir l’autolyse et la dégradation du tissu et l’absence de fixation prolongée susceptible de compliquer les analyses moléculaires en aval.