Protocole d'essai MBEC utilisant le sonicateur pour plaques à 96 puits UIP400MTP

L'essai MBEC est utilisé pour déterminer la concentration d'agents antimicrobiens nécessaire pour éliminer les biofilms formés sur les couvercles des piquets. Pour évaluer la viabilité des biofilms, il faut d'abord les détacher des couvercles des plaques à 96 puits. La sonication est la méthode la plus fiable et la plus efficace pour ce détachement. Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP est spécialement conçu pour traiter les plaques d'essai avec un maximum d'efficacité et de commodité, rationalisant et accélérant les essais MBEC à haut débit.

Sonication pour le détachement du biofilm

La sonication est une étape cruciale dans les essais de concentration minimale d'éradication du biofilm (CMEB), car elle permet de déloger efficacement les cellules du biofilm de leur attachement à la surface. Les biofilms sont des communautés intrinsèquement structurées de micro-organismes enfermés dans une matrice extracellulaire, ce qui les rend nettement plus résistants aux agents antimicrobiens que les cellules planctoniques. Lors des essais MBEC, la sonication utilise des ondes ultrasoniques pour générer une cavitation contrôlée, perturbant la matrice du biofilm et libérant les cellules incorporées dans une suspension. Cette étape garantit que les cellules du biofilm sont uniformément dispersées dans le milieu de récupération, ce qui facilite l'évaluation précise de la viabilité par ensemencement, dilution ou méthodes spectrophotométriques. Sans un détachement correct du biofilm, les composants résiduels de la matrice pourraient protéger les cellules, ce qui entraînerait une sous-estimation de l'efficacité antimicrobienne. Par conséquent, la sonication est indispensable pour obtenir des valeurs MBEC fiables et reproductibles, reflétant le véritable potentiel d'éradication des agents testés. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP permet de préparer facilement des échantillons à haut débit dans des plaques d'essai.

Protocole d'essai de la concentration minimale d'éradication du biofilm (CMEB)

Étape 1 : Formation du biofilm

1. Préparer la suspension bactérienne :
   Cultiver les bactéries dans des milieux appropriés jusqu'à la phase logarithmique.
   Diluer la culture bactérienne jusqu'à une densité optique définie (par exemple, OD600 ~0,1).
2. Inoculer la plaque à 96 puits :
   Ajouter la suspension bactérienne (par exemple, 150-200 µL) dans chaque puits d'une plaque de microtitration standard à 96 puits.
3. Fixer le couvercle à piquet :
   Placer le couvercle sur la plaque inoculée pour permettre la formation d'un biofilm sur les surfaces des chevilles.
4. Incuber la plaque :
   Incuber le montage à une température appropriée (par exemple, 37 °C) pendant 24 à 48 heures sans agitation pour favoriser la croissance du biofilm.

Étape 2 : Traitement avec des agents antimicrobiens

• Préparer des solutions antimicrobiennes :
  Préparer une gamme de concentrations antimicrobiennes dans des milieux frais.
  Exposer les biofilms à des agents antimicrobiens :
  Retirer le couvercle de la culture bactérienne et la rincer dans une solution saline stérile ou du PBS pour éliminer les cellules planctoniques.
  Placer le couvercle dans une nouvelle plaque à 96 puits contenant les solutions antimicrobiennes.
• Incuber la plaque :
  Incuber pendant une période définie (par exemple, 24 heures) pour permettre l'exposition aux antimicrobiens.

Étape 3 : Sonication avec le sonificateur pour plaques de 96 puits UIP400MTP

L'étape de sonication est essentielle pour détacher les biofilms des couvercles des piquets afin d'évaluer la viabilité. Suivez les étapes suivantes pour le sonicateur UIP400MTP :

1. Préparer l'installation :
   Remplir chaque puits d'une nouvelle plaque à 96 puits avec du milieu de récupération (par exemple, du bouillon de neutralisation ou du milieu de croissance frais).
2. Transférer le couvercle de la cheville :
   Retirer le couvercle de la plaque de traitement antimicrobien.
   Rincer le couvercle de la cheville dans du sérum physiologique stérile ou du PBS pour éliminer les agents antimicrobiens résiduels.
3. Positionner la plaque et le sonicateur :
   Fixer le couvercle à piquet à la plaque de milieu de récupération.
   Placer la plaque de milieu de récupération sur la plate-forme du sonicateur UIP400MTP, en veillant à ce que la plaque soit centrée et stable.
4. Ajuster les paramètres de sonication :
   Régler les paramètres de sonication sur l'UIP400MTP (les réglages peuvent être adaptés au biofilm) :
   Amplitude : 70-100%.
   Durée de sonication : 1 à 3 minutes (à ajuster en fonction de la robustesse du biofilm) en mode cycle.
5. Sonicate :
   Lancer le processus de sonication. Les vibrations ultrasoniques délogeront les biofilms des surfaces des chevilles dans le milieu de récupération.
6. Contrôler le processus :
   Utilisez le capteur de température enfichable pour surveiller la température de l'échantillon dans les puits. L'UIP400MTP peut être connecté à un refroidisseur de laboratoire pour le refroidissement.
7. Traitement post-sonication :
   Transférer immédiatement le milieu de récupération (contenant maintenant des biofilms détachés) dans une nouvelle plaque stérile pour l'analyse en aval.

(A) Plaque contenant de la TSB avec 2% de glucose utilisée pour la formation du biofilm, la récupération des cellules et la formation de l'ADN.
détermination de la CMI et de la MBCB ; (B) Couvercle avec des épingles pour la formation de biofilms staphylococciques. détermination de la CMI et de la MBCB ; (B) Couvercle avec des épingles pour la formation de biofilms staphylococciques.
Les cellules du biofilm formées sur les broches ont été délogées par sonication (Hielscher Ultrasound Technology) pendant 5 minutes dans des plaques à 96 puits contenant un milieu de culture frais pour la récupération des cellules.
(Image et étude : ©de Oliveira et al., 2016)

Étape 4 : Évaluation de la viabilité

Plaque et culture de biofilms détachés :

1. Effectuer des dilutions en série du milieu de récupération et ensemencer sur gélose pour dénombrer les unités formant des colonies (UFC).
   Il est également possible d'utiliser un test de viabilité colorimétrique ou basé sur la fluorescence.
2. Résultats records :
   Déterminer la CMEB comme étant la concentration la plus faible d'antimicrobien qui a éradiqué la viabilité détectable du biofilm.

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Lisez ici comment l'UIP400MTP est utilisé pour le détachement du biofilm en tant qu'étape de préparation de l'échantillon dans le cadre du protocole ASTM E2799 pour tester l'efficacité des désinfectants contre le biofilm de Pseudomonas aeruginosa à l'aide de l'essai MBEC.