Protocole de test MBEC avec le sonicateur pour plaques 96 puits UIP400MTP

Le test MBEC sert à déterminer la concentration d’agents antimicrobiens nécessaire pour éliminer les biofilms formés sur des couvercles à picots. Pour évaluer la viabilité des biofilms, ceux-ci doivent d’abord être détachés des couvercles à picots d’une plaque 96 puits. La sonication est la méthode la plus fiable et la plus efficace pour ce détachement. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP est spécialement conçu pour traiter les plaques de test avec une efficacité et une commodité maximales, ce qui simplifie et accélère les tests MBEC à haute cadence.

Sonication pour le détachement des biofilms

La sonication est une étape cruciale des tests de concentration minimale d’éradication du biofilm (MBEC), car elle permet de détacher efficacement les cellules du biofilm de la surface à laquelle elles adhèrent. Les biofilms sont par nature des communautés structurées de micro-organismes enrobées dans une matrice extracellulaire, ce qui les rend nettement plus résistants aux agents antimicrobiens que les cellules planctoniques. Lors des tests MBEC, la sonication utilise des ondes ultrasonores pour générer une cavitation contrôlée, qui désagrège la matrice du biofilm et libère les cellules incluses dans une suspension. Cette étape garantit que les cellules du biofilm sont uniformément dispersées dans le milieu de récupération, ce qui facilite des évaluations précises de la viabilité par étalement, dilution ou méthodes spectrophotométriques. Sans un détachement adéquat du biofilm, des composants résiduels de la matrice pourraient protéger les cellules et conduire à une sous-estimation de l’efficacité antimicrobienne. La sonication est donc indispensable pour obtenir des valeurs MBEC fiables et reproductibles, reflétant le véritable potentiel d’éradication des agents testés. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP permet une préparation aisée des échantillons à haute cadence dans les plaques de test.

Protocole du test de concentration minimale d’éradication du biofilm (MBEC)

Étape 1 : formation du biofilm

1. Préparer la suspension bactérienne :
   Cultiver les bactéries dans un milieu approprié jusqu’à la phase de croissance exponentielle (phase log).
   Diluer la culture bactérienne jusqu’à une densité optique définie (p. ex. OD600 ~0,1).
2. Inoculer la plaque 96 puits :
   Ajouter la suspension bactérienne (p. ex. 150–200 µL) dans chaque puits d’une microplaque standard de 96 puits.
3. Mettre en place le couvercle à picots :
   Placer le couvercle à picots sur la plaque inoculée afin de permettre la formation du biofilm sur la surface des picots.
4. Incuber la plaque :
   Incuber le dispositif à une température appropriée (p. ex. 37°C) pendant 24–48 heures sans agitation afin de favoriser la croissance du biofilm.

Étape 2 : traitement par des agents antimicrobiens

• Préparer les solutions antimicrobiennes :
  Préparer une gamme de concentrations antimicrobiennes dans du milieu frais.
  Exposer les biofilms aux agents antimicrobiens :
  Retirer le couvercle à picots de la culture bactérienne et le rincer dans une solution saline stérile ou du PBS afin d’éliminer les cellules planctoniques.
  Placer le couvercle à picots dans une nouvelle plaque 96 puits contenant les solutions antimicrobiennes.
• Incuber la plaque :
  Incuber pendant une durée définie (p. ex. 24 heures) afin de permettre l’exposition aux antimicrobiens.

Étape 3 : sonication avec le sonicateur pour plaques 96 puits UIP400MTP

L’étape de sonication est essentielle pour détacher les biofilms des couvercles à picots afin d’en évaluer la viabilité. Suivez ces étapes pour le sonicateur UIP400MTP :

1. Préparer le dispositif :
   Remplir chaque puits d’une nouvelle plaque 96 puits avec du milieu de récupération (p. ex. bouillon neutralisant ou milieu de croissance frais).
2. Transférer le couvercle à picots :
   Retirer le couvercle à picots de la plaque de traitement antimicrobien.
   Rincer le couvercle à picots dans une solution saline stérile ou du PBS afin d’éliminer les agents antimicrobiens résiduels.
3. Positionner la plaque et le sonicateur :
   Fixer le couvercle à picots sur la plaque de milieu de récupération.
   Placer la plaque de milieu de récupération sur la plateforme du sonicateur UIP400MTP en veillant à ce qu’elle soit centrée et stable.
4. Régler les paramètres de sonication :
   Régler les paramètres de sonication sur l’UIP400MTP (les réglages peuvent être adaptés au biofilm) :
   Amplitude : 70–100%.
   Durée de sonication : 1–3 minutes (à ajuster selon la robustesse du biofilm) en mode cyclique.
5. Soniquer :
   Lancer le processus de sonication. Les vibrations ultrasonores détachent les biofilms de la surface des picots et les libèrent dans le milieu de récupération.
6. Surveiller le processus :
   Utiliser le capteur de température enfichable pour surveiller la température des échantillons dans les puits. L’UIP400MTP peut être raccordé à un refroidisseur de laboratoire pour le refroidissement.
7. Manipulation après sonication :
   Transférer immédiatement le milieu de récupération (contenant désormais les biofilms détachés) dans une nouvelle plaque stérile pour l’analyse en aval.

(A) Plaque contenant du TSB avec 2% de glucose utilisée pour la formation du biofilm, la récupération des cellules et la
détermination de la MIC et de la MBCB ; (B) Couvercle à broches pour la formation de biofilms staphylococciques. détermination de la MIC et de la MBCB ; (B) Couvercle à broches pour la formation de biofilms staphylococciques.
Les cellules du biofilm formées sur les broches ont été détachées par sonication (Hielscher Ultrasound Technology) pendant 5 min dans des plaques 96 puits contenant du milieu de culture frais pour la récupération des cellules.
(Image et étude : ©de Oliveira et al., 2016)

Étape 4 : évaluation de la viabilité

Étaler et cultiver les biofilms détachés :

1. Réaliser des dilutions en série du milieu de récupération et les étaler sur gélose afin de dénombrer les unités formant colonie (UFC).
   Autre possibilité : utiliser un test de viabilité colorimétrique ou basé sur la fluorescence.
2. Consigner les résultats :
   Déterminer la MBEC comme la plus faible concentration d’antimicrobien ayant éradiqué toute viabilité détectable du biofilm.

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Découvrez ici comment l’UIP400MTP est utilisé pour le détachement des biofilms comme étape de préparation des échantillons dans le protocole ASTM E2799, qui évalue l’efficacité des désinfectants contre le biofilm de Pseudomonas aeruginosa à l’aide du test MBEC.