Sonikaatiolyysi: Solujen häiriöt ja uuttaminen

Solujen hajoaminen tai lyysi on yleinen osa päivittäisen näytteen valmistamista biotekniikan laboratorioissa. Lyysin tavoite on häiritä soluseinän tai täydellisen solun osia biologisten molekyylien vapauttamiseksi. Ns. Lysaatti voi koostua esim. Plasmidista, reseptorimäärityksistä, proteiineista, DNA: sta, RNA: sta. Lyysiä seuraavat vaiheet ovat fraktiointi, organellien eristäminen ja / tai proteiinien uuttaminen ja puhdistaminen. Uutettu materiaali (= lysaatti) on erotettava ja sitä on jatkettava lisätutkimuksilla tai sovelluksilla, esimerkiksi proteomisella tutkimuksella. Ultrasonic homogenisaattorit ovat yleinen työkalu menestyksekkään solujen hajoamiseen. Koska ultraääniintensiteetti voidaan tasoittaa säätämällä prosessiparametreja, optimaalinen sonikointiintensiteetti erittäin pehmeästä erittäin kovaan voidaan asettaa erikseen jokaiselle aineelle ja väliaineelle vastaamaan erityistä sovellusvaatimusta.

Solurakenne

Soluja suojaavat puoliläpäisevä plasmamembraani, joka koostuu fosfolipidistä kaksoiskerroksesta (myös proteiini-lipidikaksoiskerros, joka muodostuu hydrofobisista lipideistä ja hydrofiilisistä fosforimolekyyleistä, joissa on sulautettuja proteiinimolekyylejä) ja muodostaa esteen solun sisäisten alueiden (sytoplasman) ja ekstrasellulaarinen ympäristö. Kasvisoluja ja prokaryoottisia soluja ympäröi soluseinä. Koska selluloosan paksut soluseinät ovat monikerroksisia, kasvisoluja on vaikeampi lyysata kuin eläinsoluilla. Solun sisäosat, kuten organelles, ydin, mitokondrio, stabiloivat sytoskeletoni.
Solut hajottamalla se on tarkoitettu organelaalien, proteiinien, DNA: n, mRNA: n tai muiden biomolekyylien uuttamiseen ja erottamiseen.

Ultra ääni uuttamalla kasvi soluista: mikroskooppinen poikittainen osa (TS) osoittaa mekanismi toimien aikana Ultra ääni uuttamalla soluista (suurennus 2000x) [resurssi: Vilkhu et al. 2011]

menetelmät

Solujen hajottamiseen on olemassa useita menetelmiä, jotka voidaan jakaa mekaanisiin ja kemiallisiin menetelmiin, joihin kuuluu pesuaineiden tai liuottimien käyttö, korkean paineen soveltaminen tai helmimyllyn tai ranskalaisen puristimen käyttö. Näiden menetelmien ongelmallisin haitta on prosessiparametrien vaikea hallinta ja säätö ja siten vaikutus.
Yhteisten lyysimenetelmien tärkeimmät haitat:

Taulukko: Solun hajoamisen tavanomaisilla menetelmillä on merkittäviä haittoja

Päinvastoin sonikointi on erittäin tehokas ja luotettava väline solujen hajoamiseen, joka mahdollistaa täydellisen kontrolloinnin sonikaatioparametreista. Tämä takaa korkean valikoivuuden materiaalien vapautumiselle ja tuotteen puhtaudelle. [Balasundaram et ai. 2009] Sopii kaikkiin solutyyppeihin ja soveltuvat hyvin pieniin ja suurimittaisiin. Ultrasonicators on helppo puhdistaa. Ultraäänihomogenisaattorissa on aina puhtaat paikat (CIP) ja sterilointipaikka (SIP). Sonotrode koostuu massiivisesta titaanista, joka voidaan pyyhkiä tai huuhdella vedellä tai liuottimella (työvälineestä riippuen). Ultraäänilaitteiden huolto johtuu niiden voimakkuudesta melkein laiminlyötynä.

hajottaminen

Lyysi on herkkä prosessi. Solutuksen aikana solumembraanin suojaus tuhoutuu, mutta erotettujen proteiinien inaktivointi, denaturointi ja hajoaminen epfysiologisella ympäristössä (poikkeaminen pH-arvosta) on estettävä. Siksi yleensä lyysi suoritetaan puskuriliuoksessa. Useimmat vaikeudet johtuvat hallitsemattomasta solujen häiriöstä, joka johtaa kaikkien solunsisäisen materiaalin tai kohteen ja tuotteen denaturoinnin kohdistamattomaan vapautumiseen.

ultraääni-lyysi

Yleensä näytteiden hajotus laboratoriossa kestää 15 sekuntia ja 2 minuuttia. Koska sonication intensiteetti on erittäin helppo säätää amplitudilla, joka säätää sonikointiaikaa ja valitsemalla oikeat laitteet, on mahdollista häiritä solumembraaneja hyvin varovasti tai hyvin äkillisesti riippuen solurakenteesta ja lyysin tarkoituksesta ( esim. DNA: n uuttaminen vaatii pehmeämpää sonikointia, bakteerien täydellinen proteiinien ekstraktio vaatii voimakkaampaa ultraäänihoitoa). Prosessin aikana lämpötilaa voidaan seurata integroidulla lämpötila-anturilla ja sitä voidaan helposti ohjata jäähdyttämällä (jäähaude tai virtaussolut jäähdytysvaippojen avulla) tai sonikaatiolla pulssitilassa. Pulssimuotoisen sonikoinnin aikana lyhyet sonikaatiopurst-syklit, joiden pituus on 1-15 sekuntia, mahdollistavat lämmön häviämisen ja jäähdytyksen pitkiä ajoittaisia ​​jaksoja.
Kaikki ultraäänipohjaiset prosessit ovat täysin toistettavia ja lineaarisesti skaalautuvia.

ultraääni Homogenisaattorit

Erilaisia Ultraäänilaitteet mahdollistavat näytteenvalmistustavoitteen sovittamisen ja takaavat käyttäjäystävällisyyden ja käyttömukavuuden. Probe-tyyppiset ultrasonicators ovat laboratoriossa tavallisimpia laitteita. Ne sopivat parhaiten pienien ja keskikokoisten näytteiden valmistamiseen, joiden tilavuus on 0,1 - 1000 ml. Eri tehon koot ja sonotrodit mahdollistavat ultrasonicatorin sovittamisen näytteen tilavuuteen ja astiaan tehokkaimpien ja tehokkaiden sonikoitustulosten saavuttamiseksi. Ultrasonic-koetinlaite on paras valinta, kun yksittäisiä näytteitä on valmisteltava.

Jos on valmistettava enemmän näytteitä, esim. 8 injektiopulloa soluliuosta, laitteet, kuten VialTweeter tai ultrasonic cuphorn, ovat sopivin homogenisaattori lyysiä varten. Useita injektiopulloja sonikoidaan samanaikaisesti samalla intensiteetillä. Tämä säästää paitsi aikaa myös varmistaa samalla kaikkien näytteiden samanlaisen käsittelyn, mikä tekee tuloksista näytteiden kesken luotettavan ja vertailukelpoisen. Lisäksi vältetään ristikontaminaatio upottamalla ultrasonic sonotrode (tunnetaan myös nimellä ultraääni-koetin, sarvi, kärki tai sormi). Koska injektiopulloja käytetään, jätetään aikaa vievää puhdistusta ja näytteen menetystä alusten dekantoimisen vuoksi.
Suurimpiin määriin, esimerkiksi solujen uutteiden kaupalliseen tuotantoon sopivimpia ovat jatkuvatoimiset ultraäänijärjestelmät, joissa on virtaussolureaktori. Jalostetun materiaalin jatkuva ja tasainen virtaus takaa tasaisen sonikoinnin. Kaikki ultraäänen hajotusprosessin parametrit voidaan optimoida ja mukauttaa sovelluksen ja spesifisen solumateriaalin vaatimuksiin.
Esimerkkimenetelmä bakteerisolujen ultraäänilisaatiolle:

• Solususpension valmistus: Solupelletit on kokonaan suspendoitava puskuriliuokseen homogenoimalla (valitse puskuriliuoksesi, joka on yhteensopiva seuraavan analyysin kanssa, esim. Spesifinen kromatografiamenetelmä). Lisää tarvittaessa lysosymiä ja / tai muita lisäaineita (niiden on myös oltava yhteensopivia erotus- / puhdistusvälineiden kanssa). Sekoita / homogenoidaan liuos varovasti lievässä sonikaatiossa, kunnes täydellinen suspensio on saavutettu.
• Ultrasonic lysis: Aseta näyte jäähauteeseen. Soluhaittoja varten, lykätä suspensiota 60-90 sekunnin purskeilla (käyttämällä ultraäänilaitteen pulssitilaa).
• Erottaminen: sentrifugoidaan lysaatti (esim. 10 minuuttia 10 000 xg: ssa 4 ° C: ssa). Erota supernatantti solupelletistä huolellisesti. Supematantti on kokonaissolulysaatti. Supernatantin suodattamisen jälkeen saadaan liukenevan soluproteiinin kirkastettu neste.

Yleisimmät biologian ja bioteknologian ultraäänilaitteiden sovellukset ovat:

• Solujen uutteiden valmistus
• Hiivan, bakteerien, kasvisolujen, pehmeän tai kovasolukudoksen, nukleiinimateriaalin, nukleiinimateriaalin häiriöt
• Proteiinin uuttaminen
• Entsyymien valmistus ja eristäminen
• Antigeenien tuotanto
• DNA-uutto ja / tai kohdennettu fragmentaatio
• liposomivalmisteen