Solujen hajoaminen tai hajoaminen on yleinen osa päivittäistä näytteenvalmistusta biotekniikan laboratorioissa. Lyysin tavoitteena on häiritä soluseinän osia tai koko solua biologisten molekyylien vapauttamiseksi. Ultraäänihomogenisaattoreita käytetään laajalti onnistuneeseen solulyysiin. Kehittyneiden ultraäänilaitteiden suurin etu on prosessiparametrien, kuten intensiteetin ja lämpötilan, tarkka hallinta, mikä mahdollistaa lempeän, mutta erittäin tehokkaan solujen häiriön ja uuttamisen.

Solulyysi ultraäänellä

Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on menetelmä, jota käytetään avoimien solujen murtamiseen ja sisällön uuttamiseen käyttämällä korkeataajuisia ääniaaltoja eli ultraääntä. Sonikaatio on lyysitekniikka, jota käytetään laajalti vakiintuneena ja luotettavana menetelmänä solujen häiriöihin ja solunsisäisen materiaalin uuttamiseen. Ultraäänilyysi on luotettava tekniikka lysaatin valmistamiseksi, joka sisältää mm. plasmidia, reseptorimäärityksiä, proteiineja, DNA: ta, RNA: ta jne. Koska ultraääniintensiteetti voidaan tasoittaa säätämällä prosessiparametreja, optimaalinen sonikaatiointensiteetti erittäin pehmeästä voimakkaaseen voidaan asettaa erikseen kullekin aineelle ja väliaineelle erityisten sovellusvaatimusten täyttämiseksi. Seuraavat lyysivaiheet ovat fraktiointi, organellien eristäminen ja/tai proteiinien uuttaminen ja puhdistaminen. Uutettu materiaali (= lysaatti) on erotettava ja siitä tehdään lisätutkimuksia tai sovelluksia esimerkiksi proteomiikkatutkimusta varten.

Verrattuna muihin solulyysi- ja uuttomenetelmiin ultraäänisolulyysillä on useita etuja:

1. Nopeus: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on nopea menetelmä, joka voi rikkoa avoimet solut muutamassa sekunnissa. Tämä on paljon nopeampaa kuin muut menetelmät, kuten homogenointi, pakastesulatus tai helmijyrsintä.
2. tehokkuus: Ultraäänisolulyysiä ja uuttamista voidaan käyttää pienten, suurten tai useiden näytteiden käsittelyyn kerralla, mikä tekee siitä tehokkaamman kuin muut menetelmät, jotka edellyttävät pienten näytteiden yksilöllistä käsittelyä.
3. Kemikaaliton: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on ei-invasiivinen menetelmä, joka ei vaadi kovien kemikaalien tai entsyymien käyttöä. Tämä tekee siitä ihanteellisen sovelluksiin, joissa solun sisällön eheys on säilytettävä. Näytteiden ei-toivottu kontaminaatio voidaan välttää.
4. Korkea saanto: Ultraäänisolulyysi ja uutto voivat uuttaa solun sisällön, mukaan lukien DNA: n, RNA: n ja proteiinien, korkean saannon. Tämä johtuu siitä, että korkeataajuiset ääniaallot rikkovat soluseinät auki ja vapauttavat sisällön ympäröivään liuokseen.
5. Lämpötilan säätö: Kehittyneet ultraäänilaitteet mahdollistavat näytteen tarkan lämpötilan hallinnan. Hielscherin digitaaliset sonikaattorit on varustettu kytkettävällä lämpötila-anturilla ja lämpötilan valvontaohjelmistolla.
6. Toistettavissa: Ultraäänisolulyysin protokollat voidaan helposti toistaa ja jopa sovittaa erilaisiin suurempiin tai pienempiin näytetilavuuksiin yksinkertaisella lineaarisella skaalauksella.
7. Monipuolinen: Ultraäänisolulyysiä ja uuttamista voidaan käyttää monenlaisten solutyyppien uuttamiseen, mukaan lukien bakteerit, hiiva, sienet, kasvi- ja nisäkässolut. Sitä voidaan käyttää myös erityyppisten molekyylien, kuten proteiinien, DNA: n, RNA: n ja lipidien, uuttamiseen.
8. Useiden näytteiden samanaikainen valmistelu: Hielscher Ultrasonics tarjoaa useita ratkaisuja lukuisten näytteiden mukavaan käsittelyyn täsmälleen samoissa prosessiolosuhteissa. Tämä tekee näytteen valmistusvaiheesta lyysin ja uuttamisen erittäin tehokkaan ja aikaa säästävän.
9. Helppo käyttää: Ultraäänisolujen lyysi- ja uuttolaitteet ovat helppokäyttöisiä ja vaativat vain vähän koulutusta. Laitteet ovat myös taloudellisia, koska ne ovat yksi investointi, jossa ei vaadita luovutusten takaisinostoa. Tämä tekee siitä houkuttelevan monille tutkijoille ja laboratorioille.

Kaiken kaikkiaan ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on nopea, tehokas, tarkasti hallittavissa oleva ja monipuolinen menetelmä solun sisällön uuttamiseksi. Sen edut vaihtoehtoisiin menetelmiin verrattuna tekevät siitä houkuttelevan valinnan monenlaisiin tutkimus- ja teollisuussovelluksiin.

Ultraäänisolulyysin toimintaperiaate

Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen käyttää korkeataajuisia ääniaaltoja solujen häiritsemiseen ja niiden sisällön purkamiseen. Ääniaallot aiheuttavat paineenmuutoksia ympäröivässä nesteessä, mikä aiheuttaa pienten kuplien muodostumisen ja romahtamisen prosessissa, joka tunnetaan nimellä kavitaatio. Nämä kuplat tuottavat paikallisia erittäin voimakkaita mekaanisia voimia, jotka voivat rikkoa avoimia soluja ja vapauttaa niiden sisällön ympäröivään liuokseen.

Solulyysi, jossa käytetään ultraäänilaitetta, sisältää yleensä seuraavat vaiheet:

• Näyte asetetaan putkeen tai säiliöön, jossa on nestepuskuri.
• Näytteeseen asetetaan ultraäänianturi ja käytetään korkeataajuisia ääniaaltoja, joiden taajuus on noin 20-30 kHz.
• Ultraääniaallot aiheuttavat värähtelyä ja kavitaatiota ympäröivässä nesteessä, jolloin syntyy paikallisia voimia, jotka rikkovat avoimet solut ja vapauttavat niiden sisällön.
• Näyte sentrifugoidaan tai suodatetaan solujätteiden poistamiseksi, ja uutettu sisältö kerätään loppupään analyysiä varten.

Tehokkaat ultraääniaallot häiritsevät biologisten rakenteiden solumatriisia ja vapauttavat bioaktiiviset yhdisteet. Massansiirtoa kasvimateriaalin ja liuottimen (esim. puskurin) välillä tehostetaan. (grafiikka: ©Vilkhu et al., 2006)

Yleisten lyysimenetelmien haitat

Laboratoriotyössäsi olet ehkä jo kokenut solulyysin vaivan käyttämällä perinteisiä mekaanisia tai kemiallisia lyysiprotokollia.

• Mekaaninen hajoaminen: Mekaanisissa lyysimenetelmissä, kuten hionnassa laastilla ja survimella tai homogenisoinnissa ranskalaisella puristimella, helmimyllyllä tai roottori-staattorijärjestelmällä, ei usein ole esikäsittely- ja säätövaihtoehtoja. Tämä tarkoittaa, että jauhamisen ja jauhamisen käyttö voi nopeasti tuottaa lämpöä ja leikkausvoimia, jotka voivat vahingoittaa näytettä ja denaturoida proteiineja. Ne voivat myös olla aikaa vieviä ja vaatia suuria määriä lähtöainetta.
• Kemiallinen lyysi: Kemialliset lyysimenetelmät, kuten pesuainepohjainen lyysi, voivat vahingoittaa näytettä häiritsemällä lipidien kaksikerroksisia ja denaturoivia proteiineja. Ne voivat myös vaatia useita vaiheita ja jättää jäämiä epäpuhtauksista, jotka häiritsevät loppupään sovelluksia. Pesuaineen optimaalisen annoksen löytäminen on lisähaaste.
• Jäätymis-sulatusjaksot: Jäätymis-sulatussyklit voivat aiheuttaa solukalvojen repeämisen, mutta toistuvat syklit voivat myös aiheuttaa proteiinien denaturoitumista ja hajoamista. Tämä menetelmä voi myös vaatia useita syklejä, mikä voi olla aikaa vievää ja johtaa usein pienempiin saantoihin.
• Entsymaattinen lyysi: Entsymaattiset lyysimenetelmät voivat olla spesifisiä tietyille solutyypeille ja vaatia useita vaiheita, mikä tekee niistä aikaa vieviä. Ne tuottavat myös jätettä ja vaativat huolellista optimointia näytteen hajoamisen välttämiseksi. Entsymaattiset lyysisarjat ovat usein kalliita. Jos nykyinen entsymaattinen lyysimenettely antaa riittämättömät tulokset, sonikaatiota synergistisenä menetelmänä voidaan soveltaa solujen häiriöiden tehostamiseen.

Toisin kuin tavanomaiset mekaaniset ja kemialliset solulyysimenetelmät, sonikaatio on erittäin tehokas ja luotettava työkalu solujen hajoamiseen, joka mahdollistaa sonikaatioparametrien täydellisen hallinnan. Tämä varmistaa korkean selektiivisyyden materiaalien vapautumisessa ja tuotteen puhtaudessa. [vrt. Balasundaram et ai., 2009]
Se soveltuu kaikille solutyypeille ja soveltuu helposti pienissä ja suurissa mittakaavassa – aina valvotuissa olosuhteissa. Ultraäänilaitteet on helppo puhdistaa. Ultraäänihomogenisaattorissa on aina clean-in-place (CIP) ja sterilize-in-place (SIP) -toiminto. Sonotrode koostuu massiivisesta titaanisarvesta, joka voidaan pyyhkiä tai huuhdella vedessä tai liuottimessa (työväliaineesta riippuen). Ultraäänilaitteiden ylläpito johtuu niiden kestävyydestä lähes laiminlyötynä.

Ultraäänilyysi ja solujen häiriöt

Yleensä näytteiden hajotus laboratoriossa kestää 15 sekuntia ja 2 minuuttia. Koska sonication intensiteetti on erittäin helppo säätää amplitudilla, joka säätää sonikointiaikaa ja valitsemalla oikeat laitteet, on mahdollista häiritä solumembraaneja hyvin varovasti tai hyvin äkillisesti riippuen solurakenteesta ja lyysin tarkoituksesta ( esim. DNA: n uuttaminen vaatii pehmeämpää sonikointia, bakteerien täydellinen proteiinien ekstraktio vaatii voimakkaampaa ultraäänihoitoa). Prosessin aikana lämpötilaa voidaan seurata integroidulla lämpötila-anturilla ja sitä voidaan helposti ohjata jäähdyttämällä (jäähaude tai virtaussolut jäähdytysvaippojen avulla) tai sonikaatiolla pulssitilassa. Pulssimuotoisen sonikoinnin aikana lyhyet sonikaatiopurst-syklit, joiden pituus on 1-15 sekuntia, mahdollistavat lämmön häviämisen ja jäähdytyksen pitkiä ajoittaisia ​​jaksoja.
Kaikki ultraäänipohjaiset prosessit ovat täysin toistettavia ja lineaarisesti skaalautuvia.

Ultraäänihomogenisaattorit solulyysiin ja uuttamiseen

Erityyppiset ultraäänilaitteet mahdollistavat näytteen valmistelutavoitteen sovittamisen ja käyttäjäystävällisyyden ja käyttömukavuuden varmistamisen. Anturityyppiset ultraäänilaitteet ovat yleisimpiä laitteita laboratoriossa. Ne soveltuvat parhaiten pienten ja keskikokoisten näytteiden valmistukseen, joiden tilavuus on 0,1 ml - 1000 ml. Eri tehokoot ja sonotrodit mahdollistavat ultraäänilaitteen mukauttamisen näytteen tilavuuteen ja astiaan tehokkaimpien ja tehokkaimpien sonikointitulosten saavuttamiseksi. Ultraäänianturilaite on paras valinta, kun yksittäisiä näytteitä on valmisteltava.

Jos on valmistettava enemmän näytteitä, esimerkiksi 8-10 injektiopulloa soluliuosta, voimakas epäsuora sonikaatio ultraäänijärjestelmillä, kuten VialTweeter tai ultraäänikuppi, ovat sopivin homogenointimenetelmä tehokkaaseen lyysiin. Useita injektiopulloja sonikoidaan samanaikaisesti, samalla intensiteetillä. Tämä säästää paitsi aikaa myös varmistaa kaikkien näytteiden saman käsittelyn, mikä tekee näytteiden tuloksista luotettavia ja vertailukelpoisia. Lisäksi epäsuoran sonikoinnin aikana vältetään ristikontaminaatiota upottamalla ultraäänisonotrodi (tunnetaan myös nimellä ultraäänianturi, sarvi, kärki tai sormi). Koska käytetään yksilöllisesti näytteen kokoon sopivia injektiopulloja, aikaa vievä puhdistus ja näytteiden hävikki, joka johtuu astioiden dekantoinnista, jätetään pois. Multiwell- tai mikrotitterilevyjen yhtenäiseen sonikaatioon Hielscher tarjoaa UIP400MTP: n.
Suurimpiin määriin, esimerkiksi solujen uutteiden kaupalliseen tuotantoon sopivimpia ovat jatkuvatoimiset ultraäänijärjestelmät, joissa on virtaussolureaktori. Jalostetun materiaalin jatkuva ja tasainen virtaus takaa tasaisen sonikoinnin. Kaikki ultraäänen hajotusprosessin parametrit voidaan optimoida ja mukauttaa sovelluksen ja spesifisen solumateriaalin vaatimuksiin.
 
 
Esimerkkimenetelmä bakteerisolujen ultraäänilisaatiolle:

• Solususpension valmistus: Solupelletit on kokonaan suspendoitava puskuriliuokseen homogenoimalla (valitse puskuriliuoksesi, joka on yhteensopiva seuraavan analyysin kanssa, esim. Spesifinen kromatografiamenetelmä). Lisää tarvittaessa lysosymiä ja / tai muita lisäaineita (niiden on myös oltava yhteensopivia erotus- / puhdistusvälineiden kanssa). Sekoita / homogenoidaan liuos varovasti lievässä sonikaatiossa, kunnes täydellinen suspensio on saavutettu.
• Ultrasonic lysis: Aseta näyte jäähauteeseen. Soluhaittoja varten, lykätä suspensiota 60-90 sekunnin purskeilla (käyttämällä ultraäänilaitteen pulssitilaa).
• Erottaminen: sentrifugoidaan lysaatti (esim. 10 minuuttia 10 000 xg: ssa 4 ° C: ssa). Erota supernatantti solupelletistä huolellisesti. Supematantti on kokonaissolulysaatti. Supernatantin suodattamisen jälkeen saadaan liukenevan soluproteiinin kirkastettu neste.

 
Yleisimmät biologian ja bioteknologian ultraäänilaitteiden sovellukset ovat:

• Solujen uutteiden valmistus
• Hiivan, bakteerien, kasvisolujen, pehmeän tai kovasolukudoksen, nukleiinimateriaalin, nukleiinimateriaalin häiriöt
• Proteiinin uuttaminen
• Entsyymien valmistus ja eristäminen
• Antigeenien tuotanto
• DNA-uutto ja / tai kohdennettu fragmentaatio
• liposomivalmisteen