Sonikaatio solulyysiin: solujen häiriöt ja uuttaminen
Ultraäänisolulyysi on näytteenvalmistusmenetelmä biotekniikan laboratorioissa. Tavoitteena on häiritä soluseinämiä tai kokonaisia soluja biologisten molekyylien vapauttamiseksi. Sonikaatiota käytetään yleisesti solulyysiin, solujen häiriöihin ja uuttamiseen. Sonikaattoreiden suurin etu solulyysissä on prosessiparametrien, kuten intensiteetin ja lämpötilan, tarkka hallinta, mikä mahdollistaa hellävaraisen mutta tehokkaan solujen häiriön ja uuttamisen.
Solulyysi ultraäänellä
Ultraäänisolulyysi käyttää korkeataajuisia ääniaaltoja solujen avaamiseen ja niiden sisällön uuttamiseen. Sonikaatio on vakiintunut ja luotettava solujen häiriöihin ja solunsisäisen materiaalin, kuten plasmidien, reseptorimääritysten, proteiinien, DNA: n ja RNA: n, uuttamiseen. Prosessiparametreja säätämällä ultraääniintensiteettiä voidaan hienosäätää vastaamaan erityisiä sovellusvaatimuksia, jotka vaihtelevat lempeästä voimakkaaseen sonikaatioon. Hajoamisen jälkeisiä vaiheita ovat fraktiointi, organellien eristäminen sekä proteiinien uuttaminen ja puhdistaminen. Tuloksena oleva lysaatti on erotettava lisätutkimuksia tai sovelluksia, kuten proteomiikkatutkimusta, varten.
Jos haluat lisätietoja sonikaatiosta lyysiin, solujen häiriöihin ja uuttamiseen, ota meihin yhteyttä. Tekninen tiimimme työskentelee mielellään kanssasi solulyysiprojektissasi.
Ultraäänihomogenisaattorit UP100H (100 wattia) ja UP400St (400 wattia): Sonikaatio solujen lyysiin ja uuttamiseen.
Sonikoinnin käytön edut solujen lyysissä
Verrattuna muihin solulyysi- ja uuttomenetelmiin ultraäänisolulyysillä on useita etuja:
- Nopeus: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on nopea menetelmä, joka voi rikkoa avoimet solut muutamassa sekunnissa. Tämä on paljon nopeampaa kuin muut menetelmät, kuten homogenointi, pakastesulatus tai helmijyrsintä.
- Tehokkuus: Ultraäänisolulyysiä ja uuttamista voidaan käyttää pienten, suurten tai useiden näytteiden käsittelyyn kerralla, mikä tekee siitä tehokkaamman kuin muut menetelmät, jotka edellyttävät pienten näytteiden yksilöllistä käsittelyä.
- Kemikaaliton: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on ei-invasiivinen menetelmä, joka ei vaadi kovien kemikaalien tai entsyymien käyttöä. Tämä tekee siitä ihanteellisen sovelluksiin, joissa solun sisällön eheys on säilytettävä. Näytteiden ei-toivottu kontaminaatio voidaan välttää.
- Korkea saanto: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen voivat uuttaa suuren saannon solujen sisällöstä, mukaan lukien DNA, RNA ja proteiinit. Tämä johtuu siitä, että korkeataajuiset ääniaallot rikkovat soluseinät ja vapauttavat sisällön ympäröivään liuokseen.
- Lämpötilan säätö: Kehittyneet ultraäänilaitteet mahdollistavat näytteen tarkan lämpötilan hallinnan. Hielscherin digitaaliset sonikaattorit on varustettu kytkettävällä lämpötila-anturilla ja lämpötilan valvontaohjelmistolla.
- Toistettavissa: Ultraäänisolulyysin protokollat voidaan helposti toistaa ja jopa sovittaa erilaisiin suurempiin tai pienempiin näytemääriin yksinkertaisella lineaarisella skaalauksella.
- Monipuolinen: Ultraäänisolujen lyysiä ja uuttamista voidaan käyttää monenlaisten solutyyppien, kuten bakteerien, hiivan, sienien, kasvi- ja nisäkässolujen, uuttamiseen. Sitä voidaan käyttää myös erityyppisten molekyylien uuttamiseen, mukaan lukien proteiinit, DNA, RNA ja lipidit.
- Useiden näytteiden samanaikainen valmistelu: Hielscher Ultrasonics tarjoaa useita ratkaisuja lukuisten näytteiden mukavaan käsittelyyn täsmälleen samoissa prosessiolosuhteissa. Tämä tekee näytteen valmistusvaiheesta lyysin ja uuttamisen erittäin tehokkaan ja aikaa säästävän.
- Helppokäyttöinen: Ultraäänisolujen lyysi- ja uuttolaitteet ovat helppokäyttöisiä ja vaativat vain vähän koulutusta. Laitteisto on myös taloudellinen, koska se on yksittäinen investointi, jossa ei tarvitse ostaa luovutuksia uudelleen. Tämä tekee siitä houkuttelevan monille tutkijoille ja laboratorioille.
Kaiken kaikkiaan ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on nopea, tehokas, tarkasti hallittavissa oleva ja monipuolinen menetelmä solujen sisällön uuttamiseksi. Sen edut vaihtoehtoisiin menetelmiin verrattuna tekevät siitä houkuttelevan valinnan monenlaisiin tutkimus- ja teollisuussovelluksiin.
Ultraäänisolulyysin toimintaperiaate
Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen käyttää korkeataajuisia ääniaaltoja solujen häiritsemiseksi ja niiden sisällön uuttamiseksi. Ääniaallot aiheuttavat paineen muutoksia ympäröivään nesteeseen, mikä aiheuttaa pienten kuplien muodostumisen ja romahtamisen prosessissa, joka tunnetaan nimellä kavitaatio. Nämä kuplat tuottavat paikallisia erittäin voimakkaita mekaanisia voimia, jotka voivat rikkoa avoimet solut ja vapauttaa niiden sisällön ympäröivään liuokseen.
Solulyysi ultraäänilaitteella sisältää yleensä seuraavat vaiheet:
- Näyte asetetaan putkeen tai säiliöön, jossa on nestepuskuri.
- Näytteeseen asetetaan ultraäänianturi ja käytetään korkeataajuisia ääniaaltoja, joiden taajuus on noin 20-30 kHz.
- Ultraääniaallot aiheuttavat värähtelyä ja kavitaatiota ympäröivässä nesteessä, mikä tuottaa paikallisia voimia, jotka rikkovat avoimet solut ja vapauttavat niiden sisällön.
- Näyte sentrifugoidaan tai suodatetaan solujätteiden poistamiseksi, ja uutettu sisältö kerätään loppupään analysointia varten.
Voimakkaat ultraääniaallot häiritsevät biologisten rakenteiden solumatriisia ja vapauttavat bioaktiiviset yhdisteet. Massansiirto kasvimateriaalin ja liuottimen (esim. puskurin) välillä tehostuu. (grafiikka: ©Vilkhu et al., 2006)
Yleisten lyysimenetelmien haitat
Työskennellessäsi laboratorioissa olet ehkä jo kokenut solulyysin vaivan käyttämällä perinteisiä mekaanisia tai kemiallisia lyysiprotokollia.
- Mekaaninen hajoaminen: Mekaanisista lyysimenetelmistä, kuten jauhamisesta laastilla ja survimella tai homogenoinnista ranskalaisella puristimella, helmimyllyllä tai roottoristaattorijärjestelmällä, puuttuu usein säätö- ja säätövaihtoehdot. Tämä tarkoittaa, että jauhaminen ja jauhaminen voivat nopeasti tuottaa lämpöä ja leikkausvoimia, jotka voivat vahingoittaa näytettä ja denaturoida proteiineja. Ne voivat myös olla aikaa vieviä ja vaatia suuria määriä lähtöainetta.
- Kemiallinen hajoaminen: Kemialliset lyysimenetelmät, kuten pesuainepohjainen lyysi, voivat vahingoittaa näytettä häiritsemällä lipidikaksoiskerrosta ja denaturoivia proteiineja. Ne voivat myös vaatia useita vaiheita ja jättää epäpuhtauksia, jotka häiritsevät jatkosovelluksia. Lisähaasteena on pesuaineen optimaalisen annoksen löytäminen.
- Jäätymis- ja sulatusjaksot: Jäätymis- ja sulamissyklit voivat aiheuttaa solukalvojen repeämisen, mutta toistuvat syklit voivat myös aiheuttaa proteiinien denaturoitumista ja hajoamista. Tämä menetelmä voi myös vaatia useita syklejä, mikä voi olla aikaa vievää ja johtaa usein pienempiin saantoihin.
- Entsymaattinen lyysi: Entsymaattiset lyysimenetelmät voivat olla spesifisiä tietyille solutyypeille ja vaatia useita vaiheita, mikä tekee niistä aikaa vieviä. Ne tuottavat myös jätettä ja vaativat huolellista optimointia näytteen hajoamisen välttämiseksi. Entsymaattiset lyysisarjat ovat usein kalliita. Jos nykyinen entsymaattinen lyysimenetelmä antaa riittämättömiä tuloksia, sonikaatiota synergistisenä menetelmänä voidaan soveltaa solujen häiriöiden tehostamiseen.
Toisin kuin tavanomaiset mekaaniset ja kemialliset solulyysimenetelmät, sonikaatio on erittäin tehokas ja luotettava työkalu solujen hajoamiseen, joka mahdollistaa sonikaatioparametrien täydellisen hallinnan. Tämä varmistaa materiaalien vapautumisen ja tuotteen puhtauden korkean selektiivisyyden. [vrt. Balasundaram et al., 2009]
Se soveltuu kaikille solutyypeille ja soveltuu helposti pieniin ja suuriin mittasuhteisiin – aina valvotuissa olosuhteissa. Ultrasonicators on helppo puhdistaa. Ultraäänihomogenisaattorissa on aina clean-in-place (CIP) ja sterilointi-in-place (SIP) -toiminto. Sonotrode koostuu massiivisesta titaanisarvesta, joka voidaan pyyhkiä tai huuhdella vedessä tai liuottimessa (työaineesta riippuen). Ultraäänilaitteiden ylläpito johtuu niiden kestävyydestä lähes laiminlyötävissä.
Ultraäänilyysi ja solujen häiriöt
Yleensä näytteiden analysointi laboratoriossa kestää 15 sekunnista 2 minuuttiin. Koska sonikaatiota on erittäin helppo säätää amplitudiasetuksella sonikaatioaika sekä valitsemalla oikeat laitteet, on mahdollista häiritä solukalvoja hyvin varovasti tai hyvin äkillisesti solurakenteesta ja lyysin tarkoituksesta riippuen (esim. DNA-uutto vaatii pehmeämpää sonikaatiota, bakteerien täydellinen proteiiniuutto vaatii intensiivisempää ultraäänihoitoa). Lämpötilaa prosessin aikana voidaan seurata integroidulla lämpötila-anturilla, ja sitä voidaan helposti ohjata jäähdyttämällä (jäähaude tai virtauskennot, joissa on jäähdytysvaipat) tai sonikaatiolla pulssitilassa. Pulssitilan sonikoinnin aikana lyhyet sonikaatiopurskejaksot, joiden kesto on 1-15 sekuntia, mahdollistavat lämmöntuotannon ja jäähdytyksen pidempien ajoittaisten jaksojen aikana.
Kaikki ultraääniohjatut prosessit ovat täysin toistettavissa ja lineaarisesti skaalautuvia.
The VialTweeter on ultraäänihomogenisaattori lukuisten näytteiden samanaikaiseen, yhtenäiseen ja nopeaan steriiliin valmistukseen.
Ultraäänihomogenisaattorit solujen lyysiin ja uuttamiseen
Erilaiset ultraäänilaitteet mahdollistavat näytteen valmistustavoitteen sovittamisen ja varmistavat käyttäjäystävällisyyden ja käyttömukavuuden. Koetintyyppiset ultraäänilaitteet ovat yleisimpiä laitteita laboratoriossa. Ne soveltuvat parhaiten pienten ja keskikokoisten näytteiden valmistukseen, joiden tilavuus on 0,1 ml - 1000 ml. Eri tehokoot ja sonotrodit mahdollistavat ultraäänilaitteen mukauttamisen näytteen tilavuuteen ja astiaan tehokkaimpien ja tehokkaimpien sonikointitulosten saavuttamiseksi. Ultraäänianturilaite on paras valinta, kun on valmistettava yksittäisiä näytteitä.
Jos on valmistettava enemmän näytteitä, esimerkiksi 8-10 injektiopulloa soluliuosta, voimakas epäsuora sonikaatio ultraäänijärjestelmillä, kuten VialTweeter tai ultraäänikuppi, ovat sopivin homogenisointimenetelmä tehokkaaseen lyysiin. Useita injektiopulloja sonikoidaan samanaikaisesti, samalla intensiteetillä. Tämä säästää paitsi aikaa, myös varmistaa kaikkien näytteiden yhdenvertaisen käsittelyn, mikä tekee näytteiden tuloksista luotettavia ja vertailukelpoisia. Lisäksi epäsuoran sonikaatioristikontaminaation aikana vältetään upottamalla ultraäänisonotrode (tunnetaan myös nimellä ultraäänianturi, sarvi, kärki tai sormi). Koska käytetään yksittäin ja näytteen kokoisia injektiopulloja, aikaa vievä puhdistus ja astioiden dekantoinnista johtuva näytteen menetys jätetään pois. Multiwell- tai mikrotitterilevyjen yhtenäiseen sonikaatioon Hielscher tarjoaa UIP400MTP.
Suurempiin määriin, esimerkiksi soluuutteiden kaupalliseen tuotantoon, sopivat parhaiten jatkuvat ultraäänijärjestelmät, joissa on virtaussolureaktori. Käsitellyn materiaalin jatkuva ja tasainen virtaus takaa tasaisen sonikaation. Kaikki ultraäänihajoamisprosessin parametrit voidaan optimoida ja säätää sovelluksen ja tietyn solumateriaalin vaatimuksiin.
Esimerkillinen menettely bakteerisolujen ultraäänilyysiin:
- Solususpension valmistus: Solupelletit on suspendoitava kokonaan puskuriliuokseen homogenoimalla (valitaan puskuriliuos, joka on yhteensopiva seuraavan analyysin kanssa, esim. spesifinen kromatografiamenetelmä). Lisää tarvittaessa lysotsyymejä ja / tai muita lisäaineita (niiden on oltava yhteensopivia myös erotus- / puhdistusvälineiden kanssa). Sekoita / homogenoi liuos varovasti lievässä sonikaatiossa, kunnes täydellinen suspensio saavutetaan.
- Ultraäänilyysi: Aseta näyte jäähauteeseen. Soluhäiriöitä varten sonikoidaan suspensio 60-90 sekunnin purskeissa (käyttämällä sonicatorin pulssitilaa).
- Erotus: Sentrifugoidaan lysaatti (esim. 10 minuuttia 10 000 x g:ssa; 4 °C:ssa). Supernatantti erotetaan solupelletistä huolellisesti. Supernatantti on solulysaatin kokonaismäärä. Supernatantin suodatuksen jälkeen saat kirkastettua nestettä liukoisesta soluproteiinista.
Biologian ja biotekniikan ultraäänilaitteiden yleisimmät sovellukset ovat:
- Soluuutteen valmistus
- Hiivan, bakteerien, kasvisolujen, pehmeän tai kovan solukudoksen, nukleiinimateriaalin häiriöt
- proteiinin uuttaminen
- Entsyymien valmistus ja eristäminen
- Antigeenien tuotanto
- DNA:n uuttaminen ja/tai kohdennettu pirstoutuminen
- liposomin valmiste
Solujen häiriöt koetintyyppisellä ultraäänilaitteella on tehokas näytteenvalmistusmenetelmä.
Alla oleva taulukko antaa sinulle yleiskuvan ultraäänilaitteistamme solujen häiriöihin ja uuttamiseen. Napsauta laitetyyppiä saadaksesi lisätietoja jokaisesta ultraäänihomogenisaattorista. Hyvin koulutettu ja pitkäaikainen kokemus tekninen henkilökunta auttaa mielellään valitsemaan sopivimman ultraäänilaitteen näytteillesi!
| Erän tilavuus | Virtausnopeus | Suositellut laitteet |
|---|---|---|
| enintään 10 injektiopulloa tai tuubia | n.a. | VialTweeter |
| Multiwell / mikrotiitterilevyt | n.a. | UIP400MTP |
| useita putkia / astioita | n.a. | CupHorn |
| 1 - 500 ml | 10 - 200 ml / min | UP100H |
| 10 - 1000ml | 20–200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 - 2000ml | 20–400 ml/min | UP400St |
Ultraäänen moninaiset sovellukset haarautuvat biotekniikan, biotekniikan, mikrobiologian, molekyylibiologian, biokemian, immunologian, bakteriologian, virologian, proteomiikan, genetiikan, fysiologian, solubiologian, hematologian ja kasvitieteen aloilla.
Lyysi: solurakenteiden rikkominen
Soluja suojaa puoliläpäisevä plasmamembraani, joka koostuu fosfolipidikaksoiskerroksesta (myös proteiini-lipidikaksikerros; muodostuu hydrofobisista lipideistä ja hydrofiilisistä fosforimolekyyleistä, joihin on upotettu proteiinimolekyylejä) ja luo esteen solun sisäosien (sytoplasma) ja solunulkoisen ympäristön välille. Kasvisoluja ja prokaryoottisia soluja ympäröi soluseinä. Selluloosan monikerroksisen soluseinän vuoksi kasvisoluja on vaikeampi hajottaa kuin eläinsoluja. Solun sisätilat, kuten organellit, ydin, mitokondriot, stabiloidaan sytoskeleton avulla.
Soluja lysoimalla sen tarkoituksena on uuttaa ja erottaa organellit, proteiinit, DNA, mRNA tai muut biomolekyylit.
Tavanomaiset solulyysimenetelmät ja niiden haitat
Solujen lysointiin on useita menetelmiä, jotka voidaan jakaa mekaanisiin ja kemiallisiin menetelmiin, joihin kuuluu pesuaineiden tai liuottimien käyttö, korkean paineen käyttö tai helmimyllyn tai ranskalaisen puristimen käyttö. Näiden menetelmien ongelmallisin haittapuoli on prosessiparametrien vaikea hallinta ja säätö ja siten vaikutus.
Seuraavassa taulukossa esitetään yleisten lyysimenetelmien tärkeimmät haitat:
Taulukko: Tavanomaisilla solulyysimenetelmillä on suuria haittoja
Lyysin menettely
Lyysi on herkkä prosessi. Hajoamisen aikana solukalvon suojaus tuhoutuu, mutta uutettujen proteiinien inaktivoituminen, denaturoituminen ja hajoaminen epäfysiologisessa ympäristössä (poikkeama pH-arvosta) on estettävä. Siksi yleensä lyysi suoritetaan puskuriliuoksessa. Useimmat vaikeudet johtuvat hallitsemattomasta soluhäiriöstä, joka johtaa kaiken solunsisäisen materiaalin kohdistamattomaan vapautumiseen ja/tai kohdetuotteen denaturoitumiseen.
Usein kysyttyjä kysymyksiä sonikaatiosta ja solujen lyysistä
- Voitko lyse-soluja sonikaatiolla? Kyllä, sonikaatio hajottaa solut tehokkaasti käyttämällä korkeataajuisia ultraääniaaltoja, jotka indusoivat kavitaatiota, ilmiötä, jossa pienet höyrykuplat muodostuvat ja romahtavat väkivaltaisesti solususpensiossa. Tuloksena olevat mekaaniset voimat häiritsevät solukalvoja ja helpottavat solunsisäisten komponenttien vapautumista nesteeseen.
- Miten käyttää sonikaattoria solujen lyysiin? Sonikaattorin käyttäminen solulyysiin sisältää sonikaattorianturin upottamisen solususpensioon ja parametrien, kuten amplitudin ja pulssin keston, säätämisen. Prosessia tulee seurata tarkasti solujen häiriöiden optimoimiseksi ja samalla minimoida proteiinien denaturaatio ja entsyymien inaktivointi.
- Mikä on solulyysin sonikaatioperiaate? Sonikaatio toimii akustisen kavitaation periaatteella. Ultraäänienergia siirtyy nestemäiseen väliaineeseen, mikä aiheuttaa nopeita paineen vaihteluita, jotka johtavat mikrokuplien muodostumiseen ja luhistumiseen. Nämä luhistumat tuottavat voimakkaita leikkausvoimia ja paikallisia korkeita lämpötiloja, häiritsevät solurakenteita ja lisäävät lysaatin homogeenisuutta.
- Kuinka kauan solulyysin sonikaatio kestää? Sonikoinnin kesto solulyysissä voi vaihdella merkittävästi riippuen tekijöistä, kuten solutyypistä, solutiheydestä, sonikaattorin tehosta ja käytetystä erityisestä protokollasta. Tyypilliset toimenpiteet voivat vaihdella useista sekunnista muutamaan minuuttiin, ja ne suoritetaan usein sykleissä lämmöntuotannon hallitsemiseksi ja kennojen tasaisen häiriön varmistamiseksi.
- Mikä on sonikoinnin tarkoitus proteiinien uuttamisessa? Proteiinien uuttamisessa sonikaatio palvelee tehokkaasti solukalvojen repeämistä ja proteiinien liuottamista. Tämä menetelmä on erityisen hyödyllinen proteiinien vapauttamiseksi soluosastoista, mikä tekee siitä välttämättömän valmistettaessa lysaatteja, joista proteiinit on puhdistettava tai analysoitava.
- Miksi sonikaatiota käytetään uuttamiseen? Sonikaatiota suositaan uuttamiseen sen nopean toiminnan ja kyvyn soveltaa kohdennettua energiaa, hajottamalla solurakenteita bioaktiivisten molekyylien vapauttamiseksi ilman ankaria kemiallisia käsittelyjä, mikä säilyttää uutettujen yhdisteiden toiminnallisen eheyden.
- Häiritseekö sonikaatio proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia? Vaikka sonikaatio voi tehokkaasti häiritä solukalvoja, se voi myös häiritä proteiinien ja proteiinien vuorovaikutusta. Häiriötaso riippuu sonikaatiointensiteetistä ja altistuksen kestosta, mikä voi johtaa proteiinikompleksien denaturaatioon tai dissosiaatioon, mikä voi vaikuttaa myöhempiin analyyttisiin tai toiminnallisiin tutkimuksiin.
- Voiko sonikaatiota käyttää E. colin hajottamiseen? Hielscher-sonikaattorit ovat erityisen tehokkaita bakteerisolujen, kuten E. colin, lysoinnissa, joilla on vankat soluseinät. Tekniikka tarjoaa fysikaalisen menetelmän soluseinän ja kalvon leikkaamiseen, mikä tekee siitä edullisen menetelmän bakteerilysaattien valmistamiseksi molekyylibiologian ja biokemian laboratorioissa.
Kirjallisuus/viitteet
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.