Sonikaatio solulyysiin: solujen häiriöt ja uuttaminen
Solujen ultraäänilyysi on laajalti käytetty näytteenvalmistustekniikka nykyaikaisissa biotekniikan laboratorioissa. Sen ensisijaisena tarkoituksena on rikkoa solukalvoja tai kokonaisia soluja solunsisäisten komponenttien, kuten proteiinien, nukleiinihappojen tai organellien, vapauttamiseksi. Päivittäisessä laboratoriotyössä tämä tarkoittaa, että sonikointi on vakiomenetelmä solujen hallittuun hajottamiseen ja biomolekyylien tehokkaaseen uuttamiseen. Sonikaattoreiden tärkein etu on niiden kyky muokata tarkasti kriittisiä prosessiparametreja, kuten ultraäänen intensiteettiä, pulssia ja lämpötilan säätöä. Tämän ohjauksen avulla tutkijat voivat saavuttaa luotettavan lyysiprosessin ja minimoida samalla herkkien biomolekyylien lämpö- tai mekaaniset vauriot, mikä johtaa hellävaraiseen mutta erittäin tehokkaaseen uuttoprosessiin.
Solujen lyysi Sonicatorsin avulla
Solujen ultraäänilyysi käyttää akustista kavitaatiota solukalvojen rikkomiseksi ja solunsisäisten molekyylien vapauttamiseksi. Hielscher Ultrasonics tarjoaa klassisen anturityyppisen sonikaattorin sekä usean näytteen sonikaattorit steriiliin käsittelyyn: VialTweeter useille putkille ja injektiopulloille ja 96-kuoppalevy Sonicator UIP400MTP tavallisille mikrolevyille.
Hielscher Ultrasonics toimittaa tehokkaita kosketuksettomia sonikaattoreita näytteen valmistukseen ja kliiniseen analyysiin. Monikuoppainen levysoitin UIP400MTP, The VialTweeter, CupHorn ja GDmini2-virtauskuulutuslaite käsitellä näytteet steriileissä olosuhteissa.
Ultraäänihomogenisaattorit UP100H (100 wattia) ja UP400St (400 wattia): Sonikaatio solujen lyysiin ja uuttamiseen.
Ultraäänihomogenisaattorit solujen lyysiin ja uuttamiseen
| Ultraäänilaitteen tyyppi | Sovelluksen painopiste | Näytteen tilavuus | Tyypillinen käyttötapaus | Etuja | Esimerkkimallit |
|---|---|---|---|---|---|
| Koetintyyppiset sonikaattorit | Yhden näytteen sonikointi | 0.1 ml - ~1000 ml | Solujen lyysi, proteiinien uuttaminen, DNA/RNA-fragmentointi | Tarkka energian säätö; erilaisia sonotrodeja; optimaalinen pienille ja keskikokoisille näytteille. | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Useiden suljettujen injektiopullojen rinnakkaiskäsittely | 8-10 injektiopulloa (~1-20 ml kukin) | Monisolususpension standardoitu lyysi | Tasainen sonikointi; ristiinkontaminaation välttäminen; toistettavat tulokset. | VialTweeter, CupHorn |
| 96-kuoppalevyn Sonicator | Monikaivo- ja mikrotiterilevyjen sonikointi | Mikrolevyformaatti | Suuren läpimenon seulonta, proteomiikka, solututkimukset | Samanaikainen, tasainen sonikointi kaikissa kuopissa; ihanteellinen usean näytteen työnkuluissa. | UIP400MTP |
| virtauskennoreaktorit | Jatkuva sonikointi suuremmille volyymeille | >1 L, skaalautuva | Teollisen mittakaavan solujen hajottaminen, uutteen tuotanto | Jatkuva käsittely; skaalautuva; täydellinen prosessin hallinta (amplitudi, paine, lämpötila). | UIP1000hdT, UIP2000hdT + virtauskenno |
| Steriilit / epäsuorat sonikointijärjestelmät | Näytteiden käsittely ilman kontaminaatiota | Riippuvainen injektiopullosta/putkesta/mikroskooppilevystä | Herkät näytteet, steriilit ympäristöt, sääntely-ympäristöt | Ei kosketusta anturiin; vältetään kulkeutuminen; minimaalinen puhdistustyö. | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Sonikoinnin käytön edut solujen lyysissä
Verrattuna muihin solulyysi- ja uuttomenetelmiin ultraäänisolulyysillä on useita etuja:
- Nopeus: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on nopea menetelmä, joka voi rikkoa avoimet solut muutamassa sekunnissa. Tämä on paljon nopeampaa kuin muut menetelmät, kuten homogenointi, pakastesulatus tai helmijyrsintä.
- Tehokkuus: Ultraäänisolulyysiä ja uuttamista voidaan käyttää pienten, suurten tai useiden näytteiden käsittelyyn kerralla, mikä tekee siitä tehokkaamman kuin muut menetelmät, jotka edellyttävät pienten näytteiden yksilöllistä käsittelyä.
- Kemikaaliton: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on ei-invasiivinen menetelmä, joka ei vaadi kovien kemikaalien tai entsyymien käyttöä. Tämä tekee siitä ihanteellisen sovelluksiin, joissa solun sisällön eheys on säilytettävä. Näytteiden ei-toivottu kontaminaatio voidaan välttää.
- Korkea saanto: Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen voivat uuttaa suuren saannon solujen sisällöstä, mukaan lukien DNA, RNA ja proteiinit. Tämä johtuu siitä, että korkeataajuiset ääniaallot rikkovat soluseinät ja vapauttavat sisällön ympäröivään liuokseen.
- Lämpötilan säätö: Kehittyneet ultraäänilaitteet mahdollistavat näytteen tarkan lämpötilan hallinnan. Hielscherin digitaaliset sonikaattorit on varustettu kytkettävällä lämpötila-anturilla ja lämpötilan valvontaohjelmistolla.
- Toistettavissa: Ultraäänisolulyysin protokollat voidaan helposti toistaa ja jopa sovittaa erilaisiin suurempiin tai pienempiin näytemääriin yksinkertaisella lineaarisella skaalauksella.
- Monipuolinen: Ultraäänisolujen lyysiä ja uuttamista voidaan käyttää monenlaisten solutyyppien, kuten bakteerien, hiivan, sienien, kasvi- ja nisäkässolujen, uuttamiseen. Sitä voidaan käyttää myös erityyppisten molekyylien uuttamiseen, mukaan lukien proteiinit, DNA, RNA ja lipidit.
- Useiden näytteiden samanaikainen valmistelu: Hielscher Ultrasonics tarjoaa useita ratkaisuja lukuisten näytteiden mukavaan käsittelyyn täsmälleen samoissa prosessiolosuhteissa. Tämä tekee näytteen valmistusvaiheesta lyysin ja uuttamisen erittäin tehokkaan ja aikaa säästävän.
- Helppokäyttöinen: Ultraäänisolujen lyysi- ja uuttolaitteet ovat helppokäyttöisiä ja vaativat vain vähän koulutusta. Laitteisto on myös taloudellinen, koska se on yksittäinen investointi, jossa ei tarvitse ostaa luovutuksia uudelleen. Tämä tekee siitä houkuttelevan monille tutkijoille ja laboratorioille.
Kaiken kaikkiaan ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen on nopea, tehokas, tarkasti hallittavissa oleva ja monipuolinen menetelmä solujen sisällön uuttamiseksi. Sen edut vaihtoehtoisiin menetelmiin verrattuna tekevät siitä houkuttelevan valinnan monenlaisiin tutkimus- ja teollisuussovelluksiin.
Ultraäänisolulyysin toimintaperiaate
Ultraäänisolujen lyysi ja uuttaminen käyttää korkeataajuisia ääniaaltoja solujen häiritsemiseksi ja niiden sisällön uuttamiseksi. Ääniaallot aiheuttavat paineen muutoksia ympäröivään nesteeseen, mikä aiheuttaa pienten kuplien muodostumisen ja romahtamisen prosessissa, joka tunnetaan nimellä kavitaatio. Nämä kuplat tuottavat paikallisia erittäin voimakkaita mekaanisia voimia, jotka voivat rikkoa avoimet solut ja vapauttaa niiden sisällön ympäröivään liuokseen.
Solulyysi ultraäänilaitteella sisältää yleensä seuraavat vaiheet:
- Näyte asetetaan putkeen tai säiliöön, jossa on nestepuskuri.
- Näytteeseen asetetaan ultraäänianturi ja käytetään korkeataajuisia ääniaaltoja, joiden taajuus on noin 20-30 kHz.
- Ultraääniaallot aiheuttavat värähtelyä ja kavitaatiota ympäröivässä nesteessä, mikä tuottaa paikallisia voimia, jotka rikkovat avoimet solut ja vapauttavat niiden sisällön.
- Näyte sentrifugoidaan tai suodatetaan solujätteiden poistamiseksi, ja uutettu sisältö kerätään loppupään analysointia varten.
Yleisten lyysimenetelmien haitat
Työskennellessäsi laboratorioissa olet ehkä jo kokenut solulyysin vaivan käyttämällä perinteisiä mekaanisia tai kemiallisia lyysiprotokollia.
- Mekaaninen hajoaminen: Mekaanisista lyysimenetelmistä, kuten jauhamisesta laastilla ja survimella tai homogenoinnista ranskalaisella puristimella, helmimyllyllä tai roottoristaattorijärjestelmällä, puuttuu usein säätö- ja säätövaihtoehdot. Tämä tarkoittaa, että jauhaminen ja jauhaminen voivat nopeasti tuottaa lämpöä ja leikkausvoimia, jotka voivat vahingoittaa näytettä ja denaturoida proteiineja. Ne voivat myös olla aikaa vieviä ja vaatia suuria määriä lähtöainetta.
- Kemiallinen hajoaminen: Kemialliset lyysimenetelmät, kuten pesuainepohjainen lyysi, voivat vahingoittaa näytettä häiritsemällä lipidikaksoiskerrosta ja denaturoivia proteiineja. Ne voivat myös vaatia useita vaiheita ja jättää epäpuhtauksia, jotka häiritsevät jatkosovelluksia. Lisähaasteena on pesuaineen optimaalisen annoksen löytäminen.
- Jäätymis- ja sulatusjaksot: Jäätymis- ja sulamissyklit voivat aiheuttaa solukalvojen repeämisen, mutta toistuvat syklit voivat myös aiheuttaa proteiinien denaturoitumista ja hajoamista. Tämä menetelmä voi myös vaatia useita syklejä, mikä voi olla aikaa vievää ja johtaa usein pienempiin saantoihin.
- Entsymaattinen lyysi: Entsymaattiset lyysimenetelmät voivat olla spesifisiä tietyille solutyypeille ja vaatia useita vaiheita, mikä tekee niistä aikaa vieviä. Ne tuottavat myös jätettä ja vaativat huolellista optimointia näytteen hajoamisen välttämiseksi. Entsymaattiset lyysisarjat ovat usein kalliita. Jos nykyinen entsymaattinen lyysimenetelmä antaa riittämättömiä tuloksia, sonikaatiota synergistisenä menetelmänä voidaan soveltaa solujen häiriöiden tehostamiseen.
Toisin kuin tavanomaiset mekaaniset ja kemialliset solulyysimenetelmät, sonikaatio on erittäin tehokas ja luotettava työkalu solujen hajoamiseen, joka mahdollistaa sonikaatioparametrien täydellisen hallinnan. Tämä varmistaa materiaalien vapautumisen ja tuotteen puhtauden korkean selektiivisyyden. [vrt. Balasundaram et al., 2009]
Se soveltuu kaikille solutyypeille ja soveltuu helposti pieniin ja suuriin mittasuhteisiin – aina valvotuissa olosuhteissa. Ultrasonicators on helppo puhdistaa. Ultraäänihomogenisaattorissa on aina clean-in-place (CIP) ja sterilointi-in-place (SIP) -toiminto. Sonotrode koostuu massiivisesta titaanisarvesta, joka voidaan pyyhkiä tai huuhdella vedessä tai liuottimessa (työaineesta riippuen). Ultraäänilaitteiden ylläpito johtuu niiden kestävyydestä lähes laiminlyötävissä.
Ultraäänilyysi ja solujen häiriöt
Yleensä näytteiden analysointi laboratoriossa kestää 15 sekunnista 2 minuuttiin. Koska sonikaatiota on erittäin helppo säätää amplitudiasetuksella sonikaatioaika sekä valitsemalla oikeat laitteet, on mahdollista häiritä solukalvoja hyvin varovasti tai hyvin äkillisesti solurakenteesta ja lyysin tarkoituksesta riippuen (esim. DNA-uutto vaatii pehmeämpää sonikaatiota, bakteerien täydellinen proteiiniuutto vaatii intensiivisempää ultraäänihoitoa). Lämpötilaa prosessin aikana voidaan seurata integroidulla lämpötila-anturilla, ja sitä voidaan helposti ohjata jäähdyttämällä (jäähaude tai virtauskennot, joissa on jäähdytysvaipat) tai sonikaatiolla pulssitilassa. Pulssitilan sonikoinnin aikana lyhyet sonikaatiopurskejaksot, joiden kesto on 1-15 sekuntia, mahdollistavat lämmöntuotannon ja jäähdytyksen pidempien ajoittaisten jaksojen aikana.
Kaikki ultraääniohjatut prosessit ovat täysin toistettavissa ja lineaarisesti skaalautuvia.
The VialTweeter on ultraäänihomogenisaattori lukuisten näytteiden samanaikaiseen, yhtenäiseen ja nopeaan steriiliin valmistukseen.
- Solususpension valmistus: Solupelletit on suspendoitava kokonaan puskuriliuokseen homogenoimalla (valitaan puskuriliuos, joka on yhteensopiva seuraavan analyysin kanssa, esim. spesifinen kromatografiamenetelmä). Lisää tarvittaessa lysotsyymejä ja / tai muita lisäaineita (niiden on oltava yhteensopivia myös erotus- / puhdistusvälineiden kanssa). Sekoita / homogenoi liuos varovasti lievässä sonikaatiossa, kunnes täydellinen suspensio saavutetaan.
Lue lisää lysotsyymien ja sonikaation synergiasta! - Ultraäänilyysi: Aseta näyte jäähauteeseen. Soluhäiriöitä varten sonikoidaan suspensio 60-90 sekunnin purskeissa (käyttämällä sonicatorin pulssitilaa).
- Erotus: Sentrifugoidaan lysaatti (esim. 10 minuuttia 10 000 x g:ssa; 4 °C:ssa). Supernatantti erotetaan solupelletistä huolellisesti. Supernatantti on solulysaatin kokonaismäärä. Supernatantin suodatuksen jälkeen saat kirkastettua nestettä liukoisesta soluproteiinista.
Biologian ja biotekniikan ultraäänilaitteiden yleisimmät sovellukset ovat:
- Soluuutteen valmistus
- Hiivan, bakteerien, kasvisolujen, pehmeän tai kovan solukudoksen, nukleiinimateriaalin häiriöt
- proteiinin uuttaminen
- Entsyymien valmistus ja eristäminen
- Antigeenien tuotanto
- DNA:n uuttaminen ja/tai kohdennettu pirstoutuminen
- liposomin valmiste
Solujen häiriöt koetintyyppisellä ultraäänilaitteella on tehokas näytteenvalmistusmenetelmä.
Ultraäänen moninaiset sovellukset haarautuvat biotekniikan, biotekniikan, mikrobiologian, molekyylibiologian, biokemian, immunologian, bakteriologian, virologian, proteomiikan, genetiikan, fysiologian, solubiologian, hematologian ja kasvitieteen aloilla.
Lyysi: solurakenteiden rikkominen
Soluja suojaa puoliläpäisevä plasmamembraani, joka koostuu fosfolipidikaksoiskerroksesta (myös proteiini-lipidikaksikerros; muodostuu hydrofobisista lipideistä ja hydrofiilisistä fosforimolekyyleistä, joihin on upotettu proteiinimolekyylejä) ja luo esteen solun sisäosien (sytoplasma) ja solunulkoisen ympäristön välille. Kasvisoluja ja prokaryoottisia soluja ympäröi soluseinä. Selluloosan monikerroksisen soluseinän vuoksi kasvisoluja on vaikeampi hajottaa kuin eläinsoluja. Solun sisätilat, kuten organellit, ydin, mitokondriot, stabiloidaan sytoskeleton avulla.
Soluja lysoimalla sen tarkoituksena on uuttaa ja erottaa organellit, proteiinit, DNA, mRNA tai muut biomolekyylit.
Tavanomaiset solulyysimenetelmät ja niiden haitat
Solujen lysointiin on useita menetelmiä, jotka voidaan jakaa mekaanisiin ja kemiallisiin menetelmiin, joihin kuuluu pesuaineiden tai liuottimien käyttö, korkean paineen käyttö tai helmimyllyn tai ranskalaisen puristimen käyttö. Näiden menetelmien ongelmallisin haittapuoli on prosessiparametrien vaikea hallinta ja säätö ja siten vaikutus.
Seuraavassa taulukossa esitetään yleisten lyysimenetelmien tärkeimmät haitat:
Taulukko: Tavanomaisilla solulyysimenetelmillä on suuria haittoja
Lyysin menettely
Lyysi on herkkä prosessi. Hajoamisen aikana solukalvon suojaus tuhoutuu, mutta uutettujen proteiinien inaktivoituminen, denaturoituminen ja hajoaminen epäfysiologisessa ympäristössä (poikkeama pH-arvosta) on estettävä. Siksi yleensä lyysi suoritetaan puskuriliuoksessa. Useimmat vaikeudet johtuvat hallitsemattomasta soluhäiriöstä, joka johtaa kaiken solunsisäisen materiaalin kohdistamattomaan vapautumiseen ja/tai kohdetuotteen denaturoitumiseen.
Usein kysyttyjä kysymyksiä sonikaatiosta ja solujen lyysistä
- Voitko lyse-soluja sonikaatiolla? Kyllä, sonikaatio hajottaa solut tehokkaasti käyttämällä korkeataajuisia ultraääniaaltoja, jotka indusoivat kavitaatiota, ilmiötä, jossa pienet höyrykuplat muodostuvat ja romahtavat väkivaltaisesti solususpensiossa. Tuloksena olevat mekaaniset voimat häiritsevät solukalvoja ja helpottavat solunsisäisten komponenttien vapautumista nesteeseen.
- Miten käyttää sonikaattoria solujen lyysiin? Sonikaattorin käyttäminen solulyysiin sisältää sonikaattorianturin upottamisen solususpensioon ja parametrien, kuten amplitudin ja pulssin keston, säätämisen. Prosessia tulee seurata tarkasti solujen häiriöiden optimoimiseksi ja samalla minimoida proteiinien denaturaatio ja entsyymien inaktivointi.
- Mikä on solulyysin sonikaatioperiaate? Sonikaatio toimii akustisen kavitaation periaatteella. Ultraäänienergia siirtyy nestemäiseen väliaineeseen, mikä aiheuttaa nopeita paineen vaihteluita, jotka johtavat mikrokuplien muodostumiseen ja luhistumiseen. Nämä luhistumat tuottavat voimakkaita leikkausvoimia ja paikallisia korkeita lämpötiloja, häiritsevät solurakenteita ja lisäävät lysaatin homogeenisuutta.
- Kuinka kauan solulyysin sonikaatio kestää? Sonikoinnin kesto solulyysissä voi vaihdella merkittävästi riippuen tekijöistä, kuten solutyypistä, solutiheydestä, sonikaattorin tehosta ja käytetystä erityisestä protokollasta. Tyypilliset toimenpiteet voivat vaihdella useista sekunnista muutamaan minuuttiin, ja ne suoritetaan usein sykleissä lämmöntuotannon hallitsemiseksi ja kennojen tasaisen häiriön varmistamiseksi.
- Mikä on sonikoinnin tarkoitus proteiinien uuttamisessa? Proteiinien uuttamisessa sonikaatio palvelee tehokkaasti solukalvojen repeämistä ja proteiinien liuottamista. Tämä menetelmä on erityisen hyödyllinen proteiinien vapauttamiseksi soluosastoista, mikä tekee siitä välttämättömän valmistettaessa lysaatteja, joista proteiinit on puhdistettava tai analysoitava.
- Miksi sonikaatiota käytetään uuttamiseen? Sonikaatiota suositaan uuttamiseen sen nopean toiminnan ja kyvyn soveltaa kohdennettua energiaa, hajottamalla solurakenteita bioaktiivisten molekyylien vapauttamiseksi ilman ankaria kemiallisia käsittelyjä, mikä säilyttää uutettujen yhdisteiden toiminnallisen eheyden.
- Häiritseekö sonikaatio proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia? Vaikka sonikaatio voi tehokkaasti häiritä solukalvoja, se voi myös häiritä proteiinien ja proteiinien vuorovaikutusta. Häiriötaso riippuu sonikaatiointensiteetistä ja altistuksen kestosta, mikä voi johtaa proteiinikompleksien denaturaatioon tai dissosiaatioon, mikä voi vaikuttaa myöhempiin analyyttisiin tai toiminnallisiin tutkimuksiin.
- Voiko sonikaatiota käyttää E. colin hajottamiseen? Hielscher-sonikaattorit ovat erityisen tehokkaita bakteerisolujen, kuten E. colin, lysoinnissa, joilla on vankat soluseinät. Tekniikka tarjoaa fysikaalisen menetelmän soluseinän ja kalvon leikkaamiseen, mikä tekee siitä edullisen menetelmän bakteerilysaattien valmistamiseksi molekyylibiologian ja biokemian laboratorioissa.
- Mitkä ovat sonikaatiovaihetta seuraavat prosessit?
Ultraäänilyysiä seuraaviin vaiheisiin kuuluu tyypillisesti lysaatin fraktiointi, organellien kohdennettu eristäminen ja proteiinien uuttaminen tai puhdistaminen.
Käsitelty lysaatti erotetaan ja valmistellaan analyyttisiä tai toiminnallisia sovelluksia varten, kuten korkean resoluution proteomiikkaan, transkriptomiikkaan tai reseptorien sitoutumistutkimuksiin.
Kirjallisuus/viitteet
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.