Virusvacciner baseret på cellekulturer – Effektiv celleopbrydning ved hjælp af ultralydsbehandling

Ofte stillede spørgsmål om ultralydsbaseret celleopbrydning til fremstilling af virusbaserede vacciner

Hvad er ultralydsbaseret celleopbrydning?

Ved ultralydsbaseret celleopbrydning anvendes højintensivt ultralyd, typisk i området 20 til 30 kHz, til at sprænge cellemembraner og frigive intracellulært materiale. Kraftige ultralydsbølger danner kavitationsbobler i væsken. Når disse bobler kollapser, genererer de intense lokale forskydningskræfter og mikrostrømninger, som mekanisk nedbryder cellerne og fremmer masseoverførslen mellem cellernes indre og det omgivende medium. I vaccineproduktionen anvendes denne metode til at lysere virusinficerede cellekulturer og frigøre intracellulære og membranbundne viruspartikler til udbyttet.

Hvorfor anvende ultralydsbehandling i stedet for kemisk eller enzymatisk lysering til udvinding af virus?

Ultralydsbehandling fungerer udelukkende ved hjælp af mekaniske kræfter. Der kræves ingen vaskemidler, lysozym, proteinase K eller andre lyseringsreagenser, som kan ændre lysatet, forstyrre den efterfølgende oprensning eller skal fjernes før yderligere forarbejdning. Kemiske reagenser kræver typisk en tidskrævende forberedelse i flere trin for at forhindre hæmning af efterfølgende analyser og andre efterbehandlingstrin. Enzymatisk nedbrydning kræver lange inkubationstider og giver ofte ikke-reproducerbare resultater. Ultralydslysis samler desuden trinene resuspension, nedbrydning og ekstraktion i én enkelt, kontinuerlig proces. Hvis din proces kræver et trin med vaskemiddel eller enzymer, forstærker sonikering dette trin i stedet for at erstatte det: kavitation svækker membranerne og sikrer, at alle celler udsættes for reagenset på en ensartet måde.

Hvordan adskiller ultralydsbehandling sig fra mekaniske homogeniseringsmetoder?

Ultralydsapparater af sondetypen overfører ultralydsenergi direkte og effektivt, da sonotroden er i direkte kontakt med prøven. Mekanisk drevne homogeniseringsteknikker medfører ofte en lavere energieffektivitet. Ultralydsbehandling kræver ingen forbrugsartikler som slibekugler eller roterende tætninger i produktstrømmen, ingen dyser eller kamre, der kan tilstoppes af tyktflydende cellemasse, og ingen krydskontaminering mellem batcher.

Kan ultralydsbehandling beskadige virusset eller antigenet?

Dette er den centrale optimeringsopgave, og den kan styres. Ved at justere parametrene for ultralydsbehandlingen kan virkningerne af sonikeringen styres præcist: lav amplitude og kort sonikeringstid giver meget milde virkninger, mens høje amplituder, forhøjet tryk og længere sonikeringstid resulterer i en intensiv behandling. Da intensiteten kan tilpasses nøjagtigt til den biologiske prøve, undgås overbehandling, nedbrydning og udbyttetab. I praksis indstilles amplituden, opholdstiden og antallet af gennemløb til det minimum, der opnår den ønskede nedbrydningshastighed, med løbende temperaturovervågning og afkøling.

Reducerer ultralydsbehandlingen høstens viskositet?

Ja. Koncentrerede høstudbytter med høj celletæthed er tyktflydende og vanskelige at pumpe på grund af frigivet, ufragmenteret værtscelle-DNA. Ultralydsbehandling klipper og fragmenterer DNA og RNA, og den opløser cellemassen og adskiller celleresterne. Resultatet er en homogen, pumpbar suspension, der muliggør en mere effektiv klaring, centrifugering og kromatografi. Fragmentering af DNA og RNA ved kontrolleret ultralydsbehandling er en veletableret laboratorieanvendelse af den samme teknologi.

Kan jeg køre processen i kontinuerlig inline-tilstand?

Ja. Hielschers ultralydsenheder er udviklet til kontinuerlig drift døgnet rundt i industrielle miljøer og kan konfigureres med gennemstrømningsceller og reaktorer til kontinuerlig inline-ultralydsbehandling, recirkulationskredsløb eller integration i produktionsmoduler og forarbejdningslinjer. Både single-pass- og multi-pass-drift er mulige.

Hvordan skalerer jeg op fra laboratoriet til produktion?

Lineært, baseret på målbar energitilførsel. Alle ultralydsbehandlingsresultater opnået med en Hielscher-ultralydshomogenisator kan skaleres lineært op til højere gennemløbskapaciteter i industriel produktion; ultralydsparametre udviklet med en bordmodel-ultralydsbehandler kan overføres direkte til større Hielscher-systemer. Kriteriet for opskalering er den specifikke energitilførsel pr. volumen sammen med amplitude, opholdstid og temperatur. Hielschers procesrådgivning omfatter anbefalinger til parameteroptimering (amplitude, specifik energi E/V, opholdstid, temperatur og trykregulering) knyttet til den målbare energitilførsel.

Er ultralydsbaseret celleopbrydning egnet til produktion i renrum og i henhold til GMP-standarder?

Hielschers ultralydsenheder kan nemt installeres i renrumslaboratorier og produktionsanlæg. Kabinetterne er fremstillet af antibakteriel plast eller rustfrit stål. Alle dele, der kommer i kontakt med væsken, såsom sonotroder og gennemstrømningsceller, er fremstillet af titanium eller rustfrit stål og kan autoklaveres. Der findes specielle gennemstrømningscelle-reaktorer, der opfylder avancerede CIP- (clean-in-place) og SIP- (sterilize-in-place) krav. Transduceren i den industrielle UIP-serie har IP64-klassificering og kan installeres i krævende miljøer, mens generatoren placeres separat. Da Hielschers sonikatorer omdanner elektrisk energi til mekanisk svingning med en meget høj effektivitet på ca. 80–90 % fra stikket til væsken, kan transduceren indbygges i lukkede kabinetter uden ventilationslameller, og der er ikke behov for tvungen køling, såsom trykluft eller vand. Dette betyder også, at der ikke kommer noget kølemiddel i kontakt med processen. Automatisk procesdokumentation understøtter sporbarhed og reproducerbarhed i reguleret produktion.

Kan ultralydsbehandling også inaktivere virusset til en inaktiveret vaccine?

Ja. Kraftfuld ultralyd anvendes til inaktivering af patogener såsom bakterier og vira. Med den rette dosis og intensitet af ultralydsbehandlingen kan celler og mikrober behandles i overensstemmelse med procesmålet, så den samme platform kan anvendes til både lysering med henblik på udvinding og inaktivering. Kombinationen af ultralyd og varme, kendt som termosonikering, giver en hurtigere sterilisering med betydeligt reduceret termisk intensitet og varighed, hvilket er en fordel for bevarelsen af varmefølsomme forbindelser såsom proteiner og antigener. Ultralydsinaktivering anvendes generelt i kombination med etablerede kemiske inaktiveringsmetoder, og den fulde inaktiveringskinetik skal valideres for hvert specifikt virus.

Kan det samme system anvendes til formuleringsfaserne efter høsten?

Ja. Den samme platform håndterer spredning af antigener i suspensioner, polymerer eller liposomale indkapslinger, deagglomerering og ensartet fordeling af antigener og aluminiumbaserede adjuvanser såsom Alhydrogel™, formulering af vacciner i liposomer og faste lipidnanopartikler med præcis kontrol over bærerens størrelse samt afgasningstrinnet før påfyldning i hætteglas eller sprøjter.