Extrakce proteinů z nádorové tkáně za pomoci sonikace – protokol

Tento protokol popisuje metodu extrakce proteinů z nádorové tkáně za pomoci sonikace, která rozšiřuje standardní pracovní postup lyze močovinou podle CPTAC o kontrolovaný krok sonikace sondou během dezintegrace tkáně. Tato modifikace, vycházející ze zavedené strategie CPTAC pro hloubkovou přípravu vzorků k analýze proteomu a fosfoproteomu, zlepšuje dezintegraci buněk a subcelulárních struktur, snižuje viskozitu vzorku a zvyšuje uvolňování proteinů, které se samotnou lyzí močovinou obvykle získávají obtížněji, zejména proteinů vázaných na membrány a proteinů vázajících DNA nebo asociovaných s jádrem. V podkladové studii zvýšil pracovní postup za pomoci sonikace detekci proteinů i fosfopeptidů a zároveň zachoval kompatibilitu s navazujícím postupem ve stylu CPTAC zahrnujícím digesci, značení TMT, frakcionaci, obohacení fosfopeptidů a analýzu LC-MS/MS.

Extrakce proteinů z nádorové tkáně za pomoci sonikace pro hloubkovou proteomickou a fosfoproteomickou analýzu

Následující protokol je optimalizován pro extrakci proteinů z kryopulverizované nádorové tkáně v lyzačním pufru s 8 M močovinou: Přidaný krok sonikace sondovým sonikátorem zlepšuje výtěžnost obtížně získatelných tříd proteinů, zejména proteinů asociovaných s membránami a s DNA/jádrem, před digescí a navazující analýzou LC-MS/MS. V podkladové studii Li et al. (2025) přidání sonikace zvýšilo detekci proteinů asociovaných s membránami a jádrem a v rámci jejich pracovního postupu podpořilo hloubkové pokrytí >12 000 proteinů a >25 000 fosfopeptidů.

Oblast použití protokolu

Tento postup použijte pro:

• čerstvě zmrazenou, kryopulverizovanou nádorovou tkáň
• buněčné pelety nebo jiné biologické vzorky, u nichž je extrakce na bázi močoviny již zavedena
• pracovní postupy globální proteomiky a fosfoproteomiky využívající tryptickou digesci a volitelné značení TMT

Studie Li et al. (2025) uvádí, že pracovní postup je použitelný i pro jiné typy vzorků, jako jsou buněčné linie, krev a moč, v závislosti na typu vzorku však může být nutná optimalizace.

Optimalizovaný pracovní postup přípravy vzorků se zavedeným krokem sonikace. Optimalizovaný pracovní postup a experimentální design vycházejí z protokolu CPTAC pro přípravu vzorků ke globální proteomické a fosfoproteomické analýze.
Studie a schéma: ©Li et al., 2025

Princip činnosti

Původní studie doplnila sonikaci do standardního pracovního postupu lyze močovinou podle CPTAC a zjistila zlepšenou detekci proteinů asociovaných s membránami a jádry. Autoři uvádějí, že parametry sonikace je nutné jemně vyladit s ohledem na velikost/koncentraci vzorku – volbou velikosti sonotrody, energetického vstupu a časování pulzů.

Pro Hielscher UP200Ht a UP200St to například znamená:

• používat amplitudu a pulzní režim jako hlavní řídicí proměnné
• udržovat vzorky po celou dobu v chladu (tj. na ledu)
• začít s konzervativním nastavením
• optimalizovat s ohledem na čirost vzorku, teplotu, výtěžek proteinů a kvalitu peptidů v navazujících krocích

Oba 200wattové sonikátory Hielscher, modely UP200Ht a UP200St, jsou navrženy pro malé a střední objemy vzorků a mají nastavitelnou amplitudu a pulzní režim; oba ultrazvukové homogenizátory nabízejí digitální ovládání dotykovou obrazovkou pro přesné nastavení parametrů, automatický záznam dat, připojitelný teplotní senzor, dálkové ovládání a osvětlení vzorku.

Činidla pro extrakci proteinů za pomoci sonikace

Lyzační pufr s močovinou

Připravte čerstvý bezprostředně před použitím:

• 8 M močovina
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Koktejl inhibitorů fosfatáz 2, 1:100 (v/v)
• Koktejl inhibitorů fosfatáz 3, 1:100 (v/v)

Močovina musí být před přidáním aditiv zcela rozpuštěna; inhibitory je třeba přidat bezprostředně před použitím; pufr je třeba udržovat na ledu; po přidání aditiv se doporučuje spíše krouživé promíchání než intenzivní vortexování.

Další činidla:

• činidla pro stanovení proteinů metodou BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodacetamid
• LysC
• Trypsin
• Kyselina mravenčí
• činidla TMT při použití multiplexní kvantitativní proteomiky
• činidla IMAC při provádění obohacení fosfopeptidů

Vybavení pro extrakci proteinů za pomoci sonikace

Nezbytné

Doporučený výběr sondy

Pro vzorky o objemu přibližně 200–1000 µL použijte sonotrodu malého průměru vhodnou pro přímé vysoce intenzivní zpracování malých objemů. Hielscher nabízí sonotrody různých průměrů, přičemž menší průměr hrotu poskytuje vyšší intenzitu na hrotu.

Praktická poznámka: Použijte nejmenší sondu, která zajistí účinné promíchání bez nadměrného pěnění nebo kontaktu se stěnou nádoby.

Pokud pracujete s více vzorky současně, můžete zvážit multizkumavkový sonikátor VialTweeter nebo sonikátor pro mikrotitrační destičky UIP400MTP!

Návod krok za krokem: postup extrakce proteinů za pomoci sonikace

A. Předchlazení a příprava

1. Vychlaďte centrifugu na 4°C.
2. Připravte čerstvý lyzační pufr s močovinou a udržujte jej na ledu.
3. Umístěte UP200Ht nebo UP200St na stojan uvnitř zvukotěsného krytu.
4. Připravte ledovou lázeň dostatečně velkou, aby v ní zkumavky se vzorky stály vzpřímeně a stabilně.

Příprava čerstvého pufru a práce za chladu jsou zásadní.

B. Počáteční extrakce močovinou

1. Kryopulverizovanou tkáň udržujte na ledu.
2. Přidejte 200 µL vychlazeného lyzačního pufru s močovinou na 50 mg vlhké tkáně.
3. Vortexujte 5–10 s při vysokých otáčkách.
4. Inkubujte 15 min při 4°C.
5. Krok vortexování a inkubace ještě jednou zopakujte.
6. Centrifugujte při 20 000g po dobu 10 min při 4°C.
7. Přeneste lyzát/supernatant do čisté zkumavky s nízkou vazebností (low-bind).

C. Sonikace pomocí UP200Ht nebo UP200St

Výchozí podmínky sonikace

• Amplituda: začněte na 20–30%
• Délka pulzu: 5 s ZAP
• Chlazení: 2 min na ledu mezi pulzy
• Počet cyklů: 4 cykly
• Celková doba aktivní sonikace: 20 s
• Celková doba procesu včetně chlazení: přibližně 8–10 min

Kroky sonikace

1. Přeneste lyzát do zkumavky vhodné pro sonikaci. Použijte úzkou tenkostěnnou zkumavku, která umožňuje dobrou výměnu tepla a bezpečné ponoření sondy.
2. Umístěte zkumavku do ledové lázně. Publikace označuje chlazení během sonikace za zásadní pro zabránění tepelnému poškození.
3. Ponořte hrot sondy do vzorku. Hrot udržujte ponořený dostatečně hluboko pro stabilní kavitaci, ale nedovolte, aby se dotýkal stěny nebo dna zkumavky.
4. Proveďte jeden pulz 5 s při výchozí amplitudě.
5. Vzorek ihned vraťte celý zpět na led na 2 min.
6. Opakujte, dokud nedokončíte 4 cykly.
7. Po cyklu lyzát zkontrolujte.
8. Pokračujte pouze v případě potřeby, vždy jedním dalším pulzem 5 s, po kterém vždy následuje úplné vychlazení.
9. Ukončete, jakmile se lyzát stane homogennějším a méně vláknitým/viskózním.
   Koncovým bodem je průsvitnější lyzát, který tvoří kapky namísto souvislého viskózního toku.
10. Centrifugujte přibližně při 16 000g po dobu 15 min při 4°C.
11. Přeneste vyčiřený supernatant do nové zkumavky a změřte koncentraci proteinů.

Srovnání globální proteomiky a fosfoproteomiky mezi sonikovanými a nesonikovanými vzorky.
a. Počet identifikovaných proteinů (globální proteomika) ve všech nádorových tkáních PDX se sonikací nebo bez ní. b. Počet identifikovaných fosfopeptidů (obohacení IMAC) ve všech nádorových tkáních PDX se sonikací nebo bez ní. Započítány byly pouze proteiny a fosfopeptidy s poměrem abundance větším nebo rovným 25. percentilu. Poměr abundance byl vypočten mezi vzorky stejného typu.
Studie a grafy: ©Li et al., 2025

Navazující digesce a analýza

Po sonikaci a vyčiření postupujte podle původního pracovního postupu ve stylu CPTAC:

1. Nařeďte lyzát v poměru 1:3 (v/v) 50 mM Tris-HCl pH 8,0, aby se koncentrace močoviny snížila na <2 M.
2. Přidejte LysC v množství 1 mAU na 50 µg proteinu a inkubujte 2 h při 25°C.
3. Přidejte trypsin v poměru enzym:substrát 1:49 (w/w) a nechte přes noc štěpit při 25°C.
4. Reakci zastavte přidáním kyseliny mravenčí na výslednou koncentraci 1%.
5. Podle potřeby pokračujte odsolením, značením TMT, frakcionací, obohacením fosfopeptidů a LC-MS/MS.

Diferenciální exprese fosfopeptidů z MS se značením TMT.
a. Bazální subtyp se zvýrazněním některých lidských fosfopeptidů (začátek a konec protein-sequence) upregulovaných v sonikovaných vzorcích ve srovnání s nesonikovanými vzorky. b. Luminální subtyp se zvýrazněním některých lidských fosfopeptidů (začátek a konec protein_sequence) upregulovaných v sonikovaných vzorcích ve srovnání s nesonikovanými vzorky. c. Obohacené dráhy KEGG na základě proteinů upregulovaných fosfopeptidů v sonikovaném bazálním subtypu nádorů. d. Obohacené dráhy KEGG na základě proteinů upregulovaných fosfopeptidů v sonikovaném luminálním subtypu nádorů.
Studie a grafy: ©Li et al., 2025

Design, výroba a poradenství – kvalita Made in Germany

Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou dobře známé svými nejvyššími standardy kvality a designu. Robustnost a snadná obsluha umožňují bezproblémovou integraci našich ultrazvukových přístrojů do průmyslových zařízení. Ultrazvukové přístroje Hielscher snadno zvládají drsné podmínky i náročná prostředí.

Hielscher Ultrasonics je společnost s certifikací ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrazvukové přístroje vyznačující se nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou samozřejmě ve shodě s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Literatura / Reference

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.