Extrakce proteinů z nádorové tkáně za pomoci sonikace – protokol

Tento protokol popisuje sonikací asistovanou metodu extrakce proteinů z nádorové tkáně, která zdokonaluje standardní pracovní postup lýzy močovinou CPTAC přidáním kontrolovaného kroku sonikace během rozrušení tkáně. Tato modifikace, která vychází ze zavedené strategie přípravy proteomu a fosfoproteomu pomocí CPTAC v hlubokém měřítku, zlepšuje narušení buněčné a subcelulární struktury, snižuje viskozitu vzorku a zlepšuje uvolňování proteinů, které se obvykle hůře získávají pouhou močovinovou lýzou, zejména proteinů vázaných na membrány a DNA nebo proteinů asociovaných s jádrem. V základní studii pracovní postup s asistencí sonikace zvýšil detekci proteinů i fosfopeptidů při zachování kompatibility s navazujícím rozkladem ve stylu CPTAC, značením TMT, frakcionací, obohacením fosfopeptidů a analytickým postupem LC-MS/MS.

Extrakce proteinů z nádorové tkáně za asistence sonikace pro hloubkovou proteomickou a fosfoproteomickou analýzu

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Oblast použití protokolu

Tento postup použijte pro:

• čerstvě zmrazená, kryopulverizovaná nádorová tkáň
• buněčné pelety nebo jiné biologické vzorky, u nichž je již zavedena extrakce na bázi močoviny.
• globální proteomické a fosfoproteomické pracovní postupy s použitím tryptického štěpení a volitelného značení TMT.

Studie Li et al. (2025) uvádí, že pracovní postup je použitelný i pro jiné typy vzorků, jako jsou buněčné linie, krev a moč, avšak může být nutná optimalizace podle typu vzorku.

Optimalizovaný pracovní postup přípravy vzorků s implementovaným krokem sonikace. Optimalizovaný pracovní postup a experimentální design jsou založeny na protokolu přípravy vzorků CPTAC pro globální proteomickou a fosfoproteomickou analýzu.
Studie a schéma: ©Li et al., 2025

Pracovní princip

Původní studie přidala sonikaci ke standardnímu pracovnímu postupu lýzy močovinou CPTAC a zjistila lepší detekci proteinů spojených s membránami a jádry. Autoři uvádějí, že parametry sonikace musí být přesně vyladěny s ohledem na velikost/koncentraci vzorku. – volbou velikosti sonotrody, příkonu energie a časování pulzů.

Například pro Hielscher UP200Ht a UP200St to znamená:

• jako hlavní řídicí veličiny se používají amplituda a režim pulzů.
• udržovat vzorky po celou dobu v chladu (tj. na ledu).
• začít s konzervativním nastavením
• optimalizovat podle čistoty vzorku, teploty, výtěžku proteinu a kvality peptidů v následném řetězci.

 
Oba modely sonikátorů Hielscher 200 W UP200Ht a UP200St jsou určeny pro malé a střední objemy vzorků, s nastavitelnou amplitudou a pulzním nastavením; oba ultrazvukové homogenizátory poskytují digitální dotykové ovládání pro přesné nastavení parametrů, automatické zaznamenávání dat, připojitelný teplotní senzor, dálkové ovládání, osvětlení vzorku.
 

Reagencie pro extrakci proteinů pomocí sonikace

Močovinový lyzační pufr

Připravujte čerstvé bezprostředně před použitím:

• 8 M močoviny
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml aprotininu
• 10 µg/ml leupeptinu
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Koktejl inhibitorů fosfatázy 2, 1:100 (v/v)
• Koktejl inhibitorů fosfatázy 3, 1:100 (v/v)

Močovina musí být před přidáním aditiv zcela rozpuštěna, inhibitory by měly být přidány bezprostředně před použitím, pufr by měl být uchováván na ledu a po přidání aditiv se doporučuje spíše víření než prudké víření.
 

Další činidla:

• Reagencie pro stanovení bílkovin BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• tripsin
• Kyselina mravenčí
• činidla TMT, pokud používáte multiplexovanou kvantitativní proteomiku
• činidla IMAC, pokud se provádí obohacení fosfopeptidů

Zařízení pro extrakci proteinů pomocí sonikace

Požadované

Doporučený výběr sondy

Pro vzorky o objemu přibližně 200-1000 µl použijte sonotrodu s malým průměrem vhodnou pro přímé zpracování malých objemů s vysokou intenzitou. Společnost Hielscher nabízí více průměrů sonotrod a menší průměry hrotů poskytují vyšší intenzitu na hrotu.

Praktická poznámka: Použijte nejmenší sondu, která zajistí účinné míchání bez nadměrného pěnění nebo kontaktu se stěnami nádoby.

Pokud pracujete s více vzorky najednou, můžete zvážit. vícetrubicový sonikátor VialTweeter nebo sonikátor mikrodestiček UIP400MTP!

Pokyny krok za krokem: Postup extrakce bílkovin pomocí sonikace

A. Předchlazení a příprava

1. Odstředivku zchlaďte na 4 °C.
2. Připravte si čerstvý lyzační pufr s močovinou a uchovávejte jej na ledu.
3. Nastavte UP200Ht nebo UP200St na stojan uvnitř zvukové skříně.
4. Připravte si dostatečně velkou ledovou lázeň, aby zkumavky se vzorky byly ve svislé poloze a stabilní.

Příprava čerstvého pufru a manipulace s ním za studena jsou velmi důležité.

B. Počáteční extrakce močoviny

1. Kryopulverizovanou tkáň uchovávejte v ledu.
2. Přidejte 200 µl vychlazeného lyzačního pufru močoviny na 50 mg mokré tkáně.
3. Vír 5-10 s vysokou rychlostí.
4. Inkubujte 15 minut při 4 °C.
5. Krok víření a inkubace zopakujte ještě jednou.
6. Odstřeďujte při 20 000 g po dobu 10 minut při 4 °C.
7. Přeneste lyzát/supernatant do čisté zkumavky s nízkou vazbou.

C. Sonikace pomocí UP200Ht nebo UP200St

Výchozí podmínky pro sonikaci

• Amplituda: začíná na 20-30 %
• Délka impulzu: 5 s ON
• Chlazení: 2 minuty na ledu mezi pulzy
• Počet cyklů: Počet cyklů: 4
• Celková doba aktivní sonikace: 20 s
• Celková doba zpracování včetně chlazení: asi 8-10 min.

Kroky sonikace

1. Přeneste lyzát do zkumavky vhodné pro sonikaci. Použijte úzkou, tenkostěnnou zkumavku, která umožňuje dobrou výměnu tepla a bezpečné ponoření sondy.
2. Vložte zkumavku do ledové lázně. V článku se uvádí, že chlazení během sonikace je kritické, aby se zabránilo poškození teplem.
3. Ponořte hrot sondy do vzorku. Udržujte hrot ponořený dostatečně, aby byla kavitace stabilní, ale nedotýkejte se stěny nebo dna zkumavky.
4. Proveďte jeden 5sekundový puls s počáteční amplitudou.
5. Vzorek ihned zcela uložte na 2 minuty do ledu.
6. Opakujte, dokud nedokončíte 4 cykly.
7. Po cyklu zkontrolujte lyzát.
8. Pokračujte pouze v případě potřeby, a to vždy jedním dalším 5sekundovým pulzem, po kterém vždy následuje úplné ochlazení.
9. Přestaňte, jakmile se lyzát stane rovnoměrnějším a méně vláknitým/viskózním.
   Konečným bodem je průsvitnější lyzát, který tvoří spíše kapky než souvislý viskózní tok.
10. Odstřeďujte při rychlosti 16 000 g po dobu 15 minut při 4 °C.
11. Přeneste vyčištěný supernatant do čerstvé zkumavky a změřte koncentraci bílkovin.

Srovnání globální proteomiky a fosfoproteomiky mezi sonikovanými a nesonikovanými vzorky.
a. Počet identifikovaných proteinů (globální proteomika) ve všech nádorových tkáních PDX se sonikací nebo bez ní. b. Počet identifikovaných fosfopeptidů (obohacení IMAC) ve všech nádorových tkáních PDX se sonikací nebo bez ní. Započítány byly pouze proteiny a fosfopeptidy s poměrem abundance větším nebo rovným 25. percentilu. Poměr abundance byl počítán mezi stejnými typy vzorků.
Studie a grafy: ©Li et al., 2025

Následná digesce a analýza

Po sonikaci a čiření postupujte podle původního pracovního postupu ve stylu CPTAC:

1. Lyzát zřeďte v poměru 1:3 (v/v) s 50 mM Tris-HCl pH 8,0, aby se močovina zredukovala na hodnotu <2 M.
2. Přidejte LysC v množství 1 mAU na 50 µg proteinu a inkubujte 2 h při 25 °C.
3. Přidejte trypsin v poměru 1:49 enzym:substrát (w/w) a trávte přes noc při 25 °C.
4. Chlaďte kyselinou mravenčí na 1 % konečné koncentrace.
5. Pokračujte v odsolování, značení TMT, frakcionaci, obohacování fosfopeptidů a LC-MS/MS podle potřeby.

Diferenciální exprese fosfopeptidů z MS značených TMT.
a. Bazální podtyp, zvýraznění některých lidských fosfopeptidů (začátek a konec proteinové sekvence), které jsou regulovány v sonikovaných vzorcích ve srovnání s nonsonikovanými vzorky. b. Luminální podtyp, zvýraznění některých lidských fosfopeptidů (začátek a konec proteinové sekvence), které jsou regulovány v sonikovaných vzorcích ve srovnání s nonsonikovanými vzorky. c. Obohacené dráhy KEGG založené na proteinech upregulovaných fosfopeptidů v sonikovaných nádorech bazálního podtypu. d. Obohacené dráhy KEGG založené na proteinech upregulovaných fosfopeptidů v sonikovaných nádorech luminálního podtypu.
Studie a grafy: ©Li et al., 2025

Projekce, výroba a poradenství – Kvalita Made in Germany

Hielscher ultrasonicators jsou dobře známí pro své nejvyšší standardy kvality a designu. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrazvukových zařízení do průmyslových zařízení. Drsné podmínky a náročná prostředí jsou snadno zvládnutelné Hielscher ultrasonikators.

Hielscher Ultrasonics je společnost certifikovaná ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrasonicators s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Samozřejmě, Hielscher ultrasonicators jsou v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Literatura / Reference