Proteomické pracovní postupy s vysoce výkonným trávením bílkovin

Proteomika je základním oborem pro pochopení biologických procesů a systémů, přičemž trávení bílkovin tvoří kritický krok v jejích pracovních postupech. Tradičně se trávení bílkovin provádí v roztoku pomocí proteolytických enzymů, jako je trypsin, který specificky hydrolyzuje peptidové vazby na lysinové a argininové zbytky. Tento proces generuje peptidy vhodné pro ionizaci a fragmentaci v aplikacích hmotnostní spektrometrie (MS). Konvenční metody rozkladu však vyžadují k dosažení dokončení 12–24 hodin, což vytváří významná úzká místa v proteomických pracovních postupech.
Ultrazvuku nabízí silnou alternativu, která dramaticky zkracuje dobu trávení z hodin na pouhých několik minut. V kombinaci s pokročilými vícevzorkovými sonikátory, jako je Hielscher CupHorn, VialTweeter a 96jamkový deskový sonikátor UIP400MTP, ultrazvuku umožňuje zrychlenou, vysoce výkonnou proteomiku. Tyto technologie zefektivňují pracovní postupy, zkracují dobu přípravy vzorků a zvyšují efektivitu, aniž by byla ohrožena reprodukovatelnost nebo kvalita dat.

Úloha ultrazvukové energie při trávení bílkovin

Ultrazvuku využívá fokusované ultrazvukové vlny k vytvoření kavitace - lokalizované mikrobubliny, které se zhroutí a vytvoří intenzivní smykové síly. Tento jev zvyšuje přenos hmoty, podporuje míchání enzymů se substráty a rozvíjí proteinové struktury, čímž vystavuje místa štěpení proteolytickým enzymům, jako je trypsin.
Výsledek? Výrazné zkrácení doby trávení bez ohrožení účinnosti nebo reprodukovatelnosti.

Ultrazvukem zesílené proteolytické trávení: Metodika a výsledky

Protokol zrychleného trávení

Ultrazvukem asistovaný rozklad kombinuje proteolytické enzymy a ultrazvukovou energii k urychlení pracovních postupů. Například při použití Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) probíhá pracovní postup trávení následovně:

1. Redukce: Vzorky proteinů (0,5 mg/ml, 20 μl) se zpracovávají DTT (2 μl, 110 mM) v pufru hydrogenuhličitanu amonného (12,5 mM). Sonikace se aplikuje při 50% amplitudě po dobu 5 minut.
2. Alkylace: Po přidání IAA (2 μl, 400 mM) se sonikace opakuje za stejných podmínek.
3. Trávení: Vzorky se zředí a inkubují s imobilizovanými nanočásticemi trypsinu. Poslední kolo sonikace (5 minut) dokončí trávení. Peptidy se oddělují, suší a skladují pro MS analýzu.

Tato ultrazvuková metoda zkracuje celkovou dobu přípravy z 12 hodin na méně než 30 minut. Navzdory zrychlenému procesu zůstává výtěžek a kvalita peptidů v souladu s tradičními metodami přes noc.

Účinnost ultrazvukového trávení bílkovin

Ve srovnávacích studiích s použitím proteomů E. coli:

• Identifikace proteinů: Ultrazvukem štěpené vzorky identifikovaly 777 proteinů za 5 minut ve srovnání s 817 za 12 hodin. Identifikace sdílených proteinů přesáhla 70 %.
• Reprodukovatelnost: Replikované analýzy ukázaly hodnoty korelace nad 98 % v rámci každé metody, což dokazuje spolehlivost.
• Volitelnost: Některé proteiny byly přednostně tráveny každou metodou, přičemž ultrazvukové trávení upřednostňovalo 65 proteinů a noční trávení 54 proteinů. Takové jemné rozdíly podtrhují jedinečný potenciál ultrazvuku pro specifické aplikace.

Výsledky kvantifikace proteinů bez značení sedmi proteinů s hrotem do E. coli
ukázka. Následující proteiny byly přidány na dvou různých úrovních, jak je uvedeno ve sloupci
pojmenovaný jako "Theo Ratio". Theo Ratio je teoretický poměr mezi dvěma úrovněmi použitými v tomto
experiment. hovězí sérový albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kasein (CASA1),
α-S2 kasein (CASA2), cytochrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) a karboanhydráza 2
(CAH2). Poměry byly vypočteny pomocí intenzit proteinů LFQ získaných z MaxQuantu
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studie a grafika: © Martins et al., 2019)

Nanočásticemi imobilizovaný trypsin

Integrace imobilizovaných nanočástic trypsinu (např. T-FMNP) s ultrazvukem dále zlepšuje proteomické pracovní postupy. Tyto nanočástice poskytují vysokou povrchovou plochu pro interakce enzym-substrát, což zvyšuje účinnost. Při aplikaci na komplexní proteomy, jako je E. coli, dosahuje kombinovaná metoda následujícího:

• Rychlost: Kompletní trávení do 5 minut.
• Přesnost: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Škálovatelnost: Přizpůsobení vícejamkovým platformám, jako je UIP400MTP umožňuje zpracování s vysokou propustností.

Kliknutím sem zobrazíte podrobný protokol s podrobnými pokyny!
(srov. Martins et al., 2019)

Proteolytické trávení při vysoké rychlosti a vysoké propustnosti s Hielscherovými sonikátory

Nejlepší modely sonikátoru pro proteomiku

Hielscher Ultrasonics nabízí různé modely sonikátorů pro současnou přípravu více vzorků, což usnadňuje pracovní postupy s vysokou propustností. Ať už pracujete s lahvičkami, zkumavkami, vícejamkovými destičkami (např. 6-, 24-, 96-jamkové destičky) nebo Petriho miskami – Nabízíme vám ideální sonikátory pro vaše experimenty.

UIP400MTP vícejamkový destičkový sonikátor

Pro maximální propustnost poskytuje UIP400MTP schopnost zpracovávat 96jamkové destičky ultrazvukem. Tato UIP400MTP je kompatibilní s jakoukoli standardní mikrodestičkou, nevyžaduje drahé proprietární jednorázové destičky a dává vám svobodu vybrat si nejlepší vícejamkovou destičku pro váš výzkum. Tím, že dodává rovnoměrnou energii po celé desce, umožňuje rychlou redukci, alkylaci a trávení až 200 komplexních proteomů za pouhou 1 hodinu. Tato úroveň automatizace a efektivity je zásadní pro vysoce výkonné proteomické a klinické aplikace. Zjistěte více o vícejamkovém dizátoru destiček!

VialTweeter

VialTweeter je přizpůsoben pro laboratoře vyžadující současnou sonikaci až 10 lahviček nebo zkumavek. Jeho neinvazivní přístup eliminuje rizika křížové kontaminace a zároveň zajišťuje reprodukovatelné trávení bílkovin. Toto zařízení je ideální pro výzkumné pracovníky pracující s omezeným objemem vzorků nebo různými typy vzorků.
Zjistěte více o vícetrubicovém sonikátoru VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikátor CupHorn je výkonné zařízení určené pro současné zpracování více vzorků v uzavřených nádobách. Zajišťuje rovnoměrné rozložení ultrazvukové energie a přesnou regulaci teploty. Schopnost zpracovávat až pět vzorků současně spolu s kompatibilitou s redukovanými, alkylovanými a štěpenými pracovními postupy činí z CupHornu spolehlivý nástroj pro proteomiku založenou na MS.
Zjistěte více o CupHorn SonoReactor!

Podrobný protokol pro ultrazvukem asistované proteolytické trávení pomocí trypsinu imobilizovaného nanočásticemi

Tento protokol Martinse et al. (2019) je optimalizován pro rychlé trávení bílkovin pomocí ultrazvukové energie a nanočásticemi imobilizovaného trypsinu (T-FMNP). Uvedené kroky zajišťují účinnou redukci, alkylaci a proteolýzu vhodnou pro aplikace hmotnostní spektrometrie (MS).
Kroky protokolu

1. Redukce disulfidových vazeb
   • Přidejte 2 μl roztoku DTT (110 mM) do 20 μl vzorku proteinu (0,5 mg/ml) v pufru AmBic.
   • Umístěte zkumavku se vzorkem do sonoreaktoru UP200St-CupHorn.
   • Sonikujte vzorek po dobu 2,5 minuty při 50% amplitudě (200 W, 26 kHz).
   • Zastavte se na krátký interval, aby se ochladilo, a poté sonikujte dalších 2,5 minuty za stejných podmínek.
2. Alkylace redukovaných zbytků cysteinu
   • Do vzorku redukovaného proteinu se přidá 2 μl roztoku IAA (400 mM).
   • Sonikujte po dobu 2,5 minuty při 50% amplitudě pro usnadnění alkylace.
   • Přestávka na ochlazení a poté sonikujte dalších 2,5 minuty.

   Poznámka: Minimalizujte vystavení alkylovaného vzorku světlu, aby se zabránilo degradaci IAA.

3. Ředění vzorku
   • Vzorek alkylovaného proteinu se zředí na konečný objem 100 μl pomocí 25 mM pufru AmBic obsahujícího 4 % acetonitrilu (v/v).
   • Důkladně promíchejte jemným pipetováním.
4. Proteolytický rozklad s trypsinem imobilizovaným nanočásticemi
   • Do zředěného vzorku proteinu se přidá 20 μl roztoku T-FMNP (3 mg/ml).
   • Sonikujte směs v sonoreaktoru po dobu 2,5 minuty při amplitudě 50%.
   • Přestávka na ochlazení a poté sonikace po dobu dalších 2,5 minuty za stejných podmínek.
5. Separace trypsinových nanočástic
   • Pomocí magnetu oddělte T-FMNP od supernatantu obsahujícího natrávené peptidy.
   • Přeneste supernatant do nové mikrocentrifugační zkumavky.
6. Příprava peptidů pro MS analýzu
   • Supernatant obsahující peptidy se suší ve vakuové odstředivce.
   • Sušené peptidy se skladují při teplotě -20 °C až do další analýzy hmotnostní spektrometrií.