Proteomické pracovní postupy s vysokokapacitním štěpením proteinů

Proteomika je zásadním oborem pro pochopení biologických procesů a systémů, přičemž štěpení proteinů představuje kritický krok jejích pracovních postupů. Tradičně se štěpení proteinů provádí v roztoku pomocí proteolytických enzymů, jako je trypsin, který specificky hydrolyzuje peptidové vazby u lysinových a argininových zbytků. Tímto procesem vznikají peptidy dobře vhodné pro ionizaci a fragmentaci v aplikacích hmotnostní spektrometrie (MS). Konvenční metody štěpení však k dokončení vyžadují 12–24 hodin, což v proteomických pracovních postupech vytváří významná úzká místa.
Sonikace nabízí výkonnou alternativu, která dramaticky zkracuje dobu štěpení z hodin na pouhých několik minut. V kombinaci s pokročilými sonikátory pro více vzorků, jako jsou Hielscher CupHorn, VialTweeter a sonikátor pro 96jamkové destičky UIP400MTP, umožňuje sonikace zrychlenou vysokokapacitní proteomiku. Tyto technologie zefektivňují pracovní postupy, zkracují dobu přípravy vzorků a zvyšují efektivitu bez kompromisů v reprodukovatelnosti nebo kvalitě dat.

Role ultrazvukové energie při štěpení proteinů

Sonikace využívá fokusované ultrazvukové vlny k vytvoření kavitace – lokalizovaných mikrobublin, které kolabují a generují intenzivní smykové síly. Tento jev zlepšuje přenos hmoty, podporuje mísení enzymů se substráty a rozvinuje struktury proteinů, čímž zpřístupňuje štěpná místa proteolytickým enzymům, jako je trypsin.
Výsledek? Výrazné zkrácení doby štěpení bez kompromisů v účinnosti nebo reprodukovatelnosti.

Ultrazvukem podpořené proteolytické štěpení: metodika a výsledky

Protokol zrychleného štěpení

Ultrazvukem asistované štěpení kombinuje proteolytické enzymy a ultrazvukovou energii k urychlení pracovních postupů. Například při použití zařízení Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) probíhá pracovní postup štěpení následovně:

1. Redukce: Vzorky proteinů (0,5 mg/mL, 20 µL) se zpracují s DTT (2 µL, 110 mM) v pufru hydrogenuhličitanu amonného (12,5 mM). Sonikace se provádí při 50% amplitudě po dobu 5 minut.
2. Alkylace: Po přidání IAA (2 µL, 400 mM) se sonikace opakuje za stejných podmínek.
3. Štěpení: Vzorky se naředí a inkubují s nanočásticemi s imobilizovaným trypsinem. Závěrečné kolo sonikace (5 minut) štěpení dokončí. Peptidy se oddělí, vysuší a uchovají pro MS analýzu.

Tato ultrazvuková metoda zkracuje celkovou dobu přípravy z 12 hodin na méně než 30 minut. Navzdory zrychlenému procesu zůstávají výtěžek a kvalita peptidů v souladu s tradičními metodami přes noc.

Účinnost ultrazvukového štěpení proteinů

Ve srovnávacích studiích s proteomy E. coli:

• Identifikace proteinů: Ve vzorcích štěpených ultrazvukem bylo za 5 minut identifikováno 777 proteinů ve srovnání s 817 za 12 hodin. Podíl společně identifikovaných proteinů přesáhl 70%.
• Reprodukovatelnost: Replikátní analýzy vykázaly v rámci každé metody korelační hodnoty nad 98%, což dokládá spolehlivost.
• Selektivita: Určité proteiny byly každou metodou štěpeny přednostně, přičemž ultrazvukové štěpení upřednostňovalo 65 proteinů a štěpení přes noc 54 proteinů. Takové jemné rozdíly podtrhují jedinečný potenciál sonikace pro specifické aplikace.

Výsledky bezznačkové kvantifikace sedmi proteinů přidaných do
vzorku E. coli. Následující proteiny byly přidány ve dvou různých úrovních, jak je uvedeno ve sloupci
označeném „Theo Ratio“. Theo Ratio je teoretický poměr mezi oběma úrovněmi použitými v tomto
experimentu. Hovězí sérový albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kasein (CASA1),
α-S2 kasein (CASA2), cytochrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) a karboanhydráza 2
(CAH2). Poměry byly vypočteny z intenzit proteinů LFQ získaných analýzou v programu MaxQuant.
Ke srovnání hodnot získaných každou metodou byl použit Studentův t-test (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Studie a graf: © Martins et al., 2019)

Trypsin imobilizovaný na nanočásticích

Integrace nanočástic s imobilizovaným trypsinem (např. T-FMNPs) se sonikací dále zlepšuje proteomické pracovní postupy. Tyto nanočástice poskytují velkou povrchovou plochu pro interakce enzym-substrát, což zvyšuje účinnost. Při aplikaci na komplexní proteomy, jako je E. coli, dosahuje kombinovaná metoda:

• Rychlost: Úplné štěpení do 5 minut.
• Přesnost: Kvantifikace proteinů srovnatelná s tradičními metodami (p > 0,01, n=3).
• Škálovatelnost: Přizpůsobení pro vícejamkové platformy, jako je UIP400MTP, umožňuje vysokokapacitní zpracování.

Klikněte zde pro podrobný protokol s návodem krok za krokem!
(srov. Martins et al., 2019)

Proteolytické štěpení s vysokou rychlostí a vysokou kapacitou pomocí sonikátorů Hielscher

Nejlepší modely sonikátorů pro proteomiku

Hielscher Ultrasonics nabízí různé modely sonikátorů pro současnou přípravu více vzorků, které usnadňují vysokokapacitní pracovní postupy. Ať už pracujete s lahvičkami, zkumavkami, vícejamkovými destičkami (např. 6-, 24-, 96-jamkovými destičkami) nebo Petriho miskami – nabízíme vám ideální sonikátory pro vaše experimenty.

Sonikátor pro vícejamkové destičky UIP400MTP

Pro maximální kapacitu zpracování nabízí UIP400MTP možnost ultrazvukově zpracovávat 96jamkové destičky. UIP400MTP je kompatibilní s jakoukoli standardní mikrodestičkou, nevyžaduje drahý proprietární spotřební materiál na jedno použití a dává vám svobodu zvolit si nejlepší vícejamkovou destičku pro váš výzkum. Díky rovnoměrnému přenosu energie po celé destičce umožňuje rychlou redukci, alkylaci a štěpení až 200 komplexních proteomů za pouhou 1 hodinu. Tato úroveň automatizace a efektivity je klíčová pro vysokokapacitní proteomiku a klinické aplikace. Zjistěte více o sonikátoru pro vícejamkové destičky!

VialTweeter

VialTweeter je přizpůsoben pro laboratoře, které vyžadují současnou sonikaci až 10 lahviček nebo zkumavek. Jeho neinvazivní přístup eliminuje riziko křížové kontaminace a zároveň zajišťuje reprodukovatelné štěpení proteinů. Toto zařízení je ideální pro výzkumníky pracující s omezenými objemy vzorků nebo s různorodými typy vzorků.
Zjistěte více o sonikátoru pro více zkumavek VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikátor CupHorn je výkonné zařízení navržené pro současné zpracování více vzorků v uzavřených nádobách. Zajišťuje rovnoměrné rozložení ultrazvukové energie a přesnou regulaci teploty. Schopnost zpracovat až pět vzorků současně ve spojení s kompatibilitou s pracovními postupy zahrnujícími redukci, alkylaci a štěpení činí CupHorn spolehlivým nástrojem pro proteomiku založenou na MS.
Zjistěte více o CupHorn SonoReactor!

Protokol krok za krokem pro proteolytické štěpení asistované sonikací s využitím trypsinu imobilizovaného na nanočásticích

Tento protokol podle Martins et al. (2019) je optimalizován pro rychlé štěpení proteinů pomocí ultrazvukové energie a trypsinu imobilizovaného na nanočásticích (T-FMNPs). Uvedené kroky zajišťují účinnou redukci, alkylaci a proteolýzu vhodnou pro aplikace hmotnostní spektrometrie (MS).
Kroky protokolu

1. Redukce disulfidických vazeb
   • Přidejte 2 µL roztoku DTT (110 mM) ke 20 µL vzorku proteinu (0,5 mg/mL) v pufru AmBic.
   • Vložte zkumavku se vzorkem do sonoreaktoru UP200St-CupHorn.
   • Sonikujte vzorek po dobu 2,5 minuty při 50% amplitudě (200 W, 26 kHz).
   • Udělejte krátkou přestávku, aby se vzorek mohl ochladit, a poté sonikujte další 2,5 minuty za stejných podmínek.
2. Alkylace redukovaných cysteinových zbytků
   • Přidejte 2 µL roztoku IAA (400 mM) k redukovanému vzorku proteinu.
   • Sonikujte po dobu 2,5 minuty při 50% amplitudě pro usnadnění alkylace.
   • Udělejte přestávku na ochlazení a poté sonikujte další 2,5 minuty.

   Poznámka: Minimalizujte vystavení alkylovaného vzorku světlu, abyste zabránili degradaci IAA.

3. Ředění vzorku
   • Nařeďte alkylovaný vzorek proteinu na konečný objem 100 µL pomocí 25 mM pufru AmBic obsahujícího 4% acetonitril (v/v).
   • Důkladně promíchejte jemným pipetováním.
4. Proteolytické štěpení trypsinem imobilizovaným na nanočásticích
   • Přidejte 20 µL roztoku T-FMNP (3 mg/mL) ke zředěnému vzorku proteinu.
   • Sonikujte směs v sonoreaktoru po dobu 2,5 minuty při 50% amplitudě.
   • Udělejte přestávku na ochlazení a poté sonikujte další 2,5 minuty za stejných podmínek.
5. Separace nanočástic s trypsinem
   • Pomocí magnetu oddělte T-FMNPs od supernatantu obsahujícího naštěpené peptidy.
   • Přeneste supernatant do nové mikrocentrifugační zkumavky.
6. Příprava peptidů pro MS analýzu
   • Supernatant obsahující peptidy vysušte ve vakuové centrifuze.
   • Vysušené peptidy uchovávejte při -20°C až do další analýzy hmotnostní spektrometrií.