Příprava vzorků pomocí ultrazvukového filtru (FASP): vylepšení proteomických pracovních postupů pomocí pokročilé sonikace

Ultrazvuková příprava vzorků pomocí filtru (FASP) se stává vysoce účinnou a reprodukovatelnou metodou v moderní proteomice. Začleněním řízené sonikace do zavedených pracovních postupů FASP mohou výzkumní pracovníci výrazně zlepšit extrakci proteinů, účinnost trávení a celkovou kvalitu dat. S rostoucí poptávkou po vysoce výkonné a reprodukovatelné přípravě vzorků získávají cílený sonikátor, jako je mikrodestičkový sonikátor UIP400MTP, vědecký i praktický význam.

Vědecký kontext: Proč je FASP v proteomice důležitý?

Příprava vzorků pomocí filtru (FASP) se stala zlatým standardem v proteomice "zdola nahoru" díky své schopnosti odstranit detergenty, soli a další kontaminanty a zároveň umožnit účinné enzymatické štěpení. Klasické protokoly FASP se však často potýkají s omezeními souvisejícími s neúplnou lýzou, nekonzistentním rozkladem a variabilitou vzorků. – especially when dealing with complex or resilient biological cells or tissues.
Zde je rozhodující výhodou fokusovaná ultrazvuková energie (sonikace). Vnášením mechanických smykových sil a kavitace sonikace zlepšuje několik kritických kroků v pracovním postupu FASP, aniž by byla narušena integrita bílkovin.

Pozitivní účinky sonikace při ultrazvukové FASP

Sonikace zavádí řízenou akustickou kavitaci – tvorba a kolaps mikroskopických bublin. – což vytváří lokální smykové síly a mikroproudění.
Sonikace zlepšuje alkylaci i rozklad v ultrazvukové FASP tím, že zlepšuje přenos hmoty a urychluje reakční kinetiku. Aplikace ultrazvukové energie vytváří kavitaci, což vede k lokalizovanému mikroproudění a přechodným smykovým silám, které podporují rychlé míchání a účinné pronikání činidel do proteinové matrice nebo prostředí filtru. Během alkylace to vede k rovnoměrnější a rychlejší modifikaci cysteinových zbytků jodoacetamidem. V kroku štěpení sonikace zvyšuje dostupnost proteolytických štěpných míst a zlepšuje interakce mezi enzymem a substrátem, čímž urychluje trypsinovou aktivitu a zvyšuje účinnost štěpení. Ultrazvuková úprava celkově zkracuje dobu zpracování při zachování nebo zlepšení úplnosti a reprodukovatelnosti reakce.

Při přípravě proteomických vzorků se ultrazvuková FASP promítá do:

• Účinnější rozrušování buněk a extrakce bílkovin, a to i v náročných tkáních nebo mikrobiálních vzorcích.
• Zvýšená solubilizace proteinů
• Lepší přístupnost enzymů během trávení
• Zkrácení doby zpracování a zvýšení reprodukovatelnosti

Na rozdíl od konvenčních mechanických nebo chemických metod lýzy je ultrazvukové zpracování vysoce kontrolovatelné a škálovatelné, takže je obzvláště vhodné pro standardizované proteomické pracovní postupy.

Výhody ultrazvukové FASP oproti konvenčním metodám

Integrace sonikace do protokolů FASP přináší měřitelné výhody, které přímo ovlivňují výsledky následné hmotnostní spektrometrie.
Ultrazvuková FASP umožňuje úplnější obnovu proteinů, zejména z náročných vzorků, jako jsou vláknité tkáně nebo biofilmy. Rovnoměrné rozložení energie zajišťuje konzistentní ošetření napříč replikáty, čímž se snižuje variabilita. – základní požadavek pro kvantitativní proteomiku.
Sonikace navíc urychluje kinetiku trávení tím, že zlepšuje interakci enzymu se substrátem. To často vede ke zkrácení doby trávení a vyššímu výtěžku peptidů při zachování pokrytí sekvence.
Z hlediska pracovního postupu ultrazvukové systémy omezují manuální zásahy a eliminují potřebu agresivního chemického ošetření, čímž zachovávají integritu vzorku a zjednodušují standardizaci protokolu.

Vennův diagram znázorňující zvýšený počet identifikovaných proteinů pomocí ultrazvukové FASP ve srovnání s noční FASP
Obrázek a studie: ©Carvalho et al., 2020

Protokol: Vysoce výkonná ultrazvuková FASP s UIP400MTP

For laboratories processing large sample cohorts, the UIP400MTP microplate sonicator enables simultaneous sonication of standard multi-well plates (e.g., 96-well plates), significantly increasing throughput and reproducibility.
V tomto formátu se vzorky (obvykle 50-200 µl na jamku) připravují přímo v mikrotitračních destičkách kompatibilních s ultrafiltrací nebo následným zpracováním. Lyzační pufry jsou podobné těm, které se používají ve standardních protokolech FASP.

UIP400MTP aplikuje rovnoměrnou ultrazvukovou energii na všechny jamky. Sonikace se obvykle provádí při amplitudě 60-80 % po dobu 2-4 minut v závislosti na typu vzorku. Monitorujte teplotu pomocí připojitelného teplotního čidla. Použití pulzní sonikace a volitelně laboratorního chlazení.

Vzorový protokol:

1. For the alkylation step, samples are sonicated using the microplate sonicator (UIP400MTP) at 40% amplitude for 7 cycles (30 s ON, 15 s OFF; total sonication time: 5 min 45 s).
2. Po sonikaci se roztok jodoacetamidu (IAA) odstředí. Před trávením trypsinem se vzorky musí propláchnout, aby se odstranila zbytková močovina, silné chaotropní činidlo, které inhibuje enzymatickou aktivitu. Proto se vzorky dvakrát promyjí 200 μl 25 mM hydrogenuhličitanu amonného (AmBic).
3. Následně se přidá 100 μl roztoku trypsinu (poměr enzymu k proteinu 1:30) připraveného v 12,5 mM hydrogenuhličitanu amonném. Poté se provede štěpení proteinů pomocí UIP400MTP za stejných sonikačních podmínek (40% amplituda, 7 cyklů, 30 s ON / 15 s OFF; celkový čas: 5 min 45 s).
4. Po sonikaci se vzorky přenesou na filtrační destičky nebo se zpracují pomocí destičkových systémů FASP. Redukční a alkylační kroky se provádějí přímo na destičce, čímž se zachovává zjednodušený pracovní postup.
5. Trypsinové štěpení probíhá za kontrolovaných podmínek (např. 37 °C, 4-16 hodin) s možností krátké ultrazvukové stimulace pro urychlení enzymatické aktivity a zvýšení výtěžnosti peptidů.
6. Peptidy se získají centrifugací a jsou připraveny k analýze LC-MS/MS.

Klíčovou výhodou tohoto systému je jeho schopnost zajistit identické podmínky zpracování ve všech jamkách, což minimalizuje dávkové efekty a umožňuje robustní kvantitativní srovnání v rozsáhlých proteomických studiích.

Projekce, výroba a poradenství – Kvalita Made in Germany

Hielscher ultrasonicators jsou dobře známí pro své nejvyšší standardy kvality a designu. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrazvukových zařízení do průmyslových zařízení. Drsné podmínky a náročná prostředí jsou snadno zvládnutelné Hielscher ultrasonikators.

Hielscher Ultrasonics je společnost certifikovaná ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrasonicators s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Samozřejmě, Hielscher ultrasonicators jsou v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Literatura / Reference