Ultrazvuková filtrem podporovaná příprava vzorků (FASP): zlepšení proteomických pracovních postupů pomocí pokročilé sonikace

Ultrazvuková filtrem podporovaná příprava vzorků (FASP) se prosazuje jako vysoce účinná a reprodukovatelná metoda moderní proteomiky. Začleněním řízené sonikace do zavedených pracovních postupů FASP mohou výzkumníci výrazně zlepšit extrakci proteinů, účinnost štěpení a celkovou kvalitu dat. S rostoucí poptávkou po vysokokapacitní a reprodukovatelné přípravě vzorků získávají fokusované sonikátory, jako je mikrodestičkový sonikátor UIP400MTP, na vědeckém i praktickém významu.

Vědecký kontext: proč je FASP v proteomice důležitá

Filtrem podporovaná příprava vzorků (FASP) se stala zlatým standardem v proteomice typu bottom-up díky své schopnosti odstraňovat detergenty, soli a další kontaminanty a zároveň umožňovat účinné enzymatické štěpení. Klasické protokoly FASP však často narážejí na omezení související s neúplnou lyzí, nekonzistentním štěpením a variabilitou vzorků – zejména při práci se složitými nebo odolnými biologickými buňkami či tkáněmi.
Právě zde poskytuje fokusovaná ultrazvuková energie (sonikace) rozhodující výhodu. Působením mechanických smykových sil a kavitace zlepšuje sonikace několik kritických kroků pracovního postupu FASP, aniž by narušila integritu proteinů.

Pozitivní účinky sonikace při ultrazvukové FASP

Sonikace vyvolává řízenou akustickou kavitaci – vznik a kolaps mikroskopických bublin –, která generuje lokální smykové síly a mikroproudění.
Sonikace zlepšuje krok alkylace i krok štěpení při ultrazvukové FASP tím, že zlepšuje přenos hmoty a urychluje reakční kinetiku. Působení ultrazvukové energie vytváří kavitaci, která vede k lokálnímu mikroproudění a přechodným smykovým silám, jež podporují rychlé promíchání a účinné pronikání činidel do proteinové matrice nebo do prostředí filtru. Při alkylaci to vede k rovnoměrnější a rychlejší modifikaci cysteinových zbytků jodacetamidem. V kroku štěpení zvyšuje sonikace dostupnost proteolytických štěpných míst a zlepšuje interakce enzym–substrát, čímž urychluje aktivitu trypsinu a zvyšuje účinnost štěpení. Celkově ultrazvukové ošetření zkracuje dobu zpracování a přitom zachovává nebo zlepšuje úplnost reakcí a reprodukovatelnost.

Při přípravě vzorků v proteomice přináší ultrazvuková FASP:

• Účinnější dezintegraci buněk a extrakci proteinů, a to i u odolných tkání nebo mikrobiálních vzorků
• Lepší solubilizaci proteinů
• Lepší přístupnost pro enzym během štěpení
• Kratší dobu zpracování a vyšší reprodukovatelnost

Na rozdíl od konvenčních mechanických nebo chemických metod lyze je ultrazvukové zpracování vysoce řiditelné a škálovatelné, a proto je obzvláště vhodné pro standardizované proteomické pracovní postupy.

Výhody ultrazvukové FASP oproti konvenčním přístupům

Začlenění sonikace do protokolů FASP přináší měřitelné výhody, které přímo ovlivňují výsledky navazující hmotnostní spektrometrie.
Ultrazvuková FASP umožňuje úplnější výtěžnost proteinů, zejména z náročných vzorků, jako jsou vláknité tkáně nebo biofilmy. Rovnoměrné rozložení energie zajišťuje konzistentní ošetření napříč replikáty a snižuje variabilitu – což je zásadní požadavek kvantitativní proteomiky.
Sonikace navíc urychluje kinetiku štěpení tím, že zlepšuje interakci enzym–substrát. To často vede ke kratším dobám štěpení a vyššímu výtěžku peptidů při zachování pokrytí sekvence.
Z hlediska pracovního postupu ultrazvukové systémy omezují manuální zásahy a odstraňují potřebu agresivních chemických ošetření, čímž zachovávají integritu vzorků a zjednodušují standardizaci protokolů.

Vennův diagram znázorňující zvýšený počet proteinů identifikovaných ultrazvukovou FASP ve srovnání s FASP přes noc
Obrázek a studie: ©Carvalho et al., 2020

Protokol: vysokokapacitní ultrazvuková FASP se sonikátorem UIP400MTP

Pro laboratoře zpracovávající velké kohorty vzorků umožňuje mikrodestičkový sonikátor UIP400MTP současnou sonikaci standardních vícejamkových destiček (např. 96jamkových destiček), čímž výrazně zvyšuje kapacitu zpracování vzorků a reprodukovatelnost.
V tomto formátu se vzorky (typicky 50–200 µL na jamku) připravují přímo v mikrodestičkách kompatibilních s ultrafiltrací nebo navazujícím zpracováním. Lyzační pufry jsou podobné těm, které se používají ve standardních protokolech FASP.

UIP400MTP aplikuje rovnoměrnou ultrazvukovou energii do všech jamek. Sonikace se obvykle provádí při amplitudě 60–80% po dobu 2–4 minut v závislosti na typu vzorku. Teplotu sledujte pomocí připojitelného teplotního senzoru. Použijte pulzní sonikaci a volitelně laboratorní chladič.

Ukázkový protokol:

1. Pro krok alkylace se vzorky sonikují mikrodestičkovým sonikátorem (UIP400MTP) při amplitudě 40% po dobu 7 cyklů (30 s zapnuto, 15 s vypnuto; celková doba sonikace: 5 min 45 s).
2. Po sonikaci se roztok jodacetamidu (IAA) odstraní centrifugací. Před štěpením trypsinem je nutné vzorky promýt, aby se odstranila zbytková močovina, silné chaotropní činidlo, které inhibuje enzymatickou aktivitu. Vzorky se proto dvakrát promyjí 200 μL 25 mM hydrogenuhličitanu amonného (AmBic).
3. Následně se přidá 100 μL roztoku trypsinu (poměr enzymu k proteinu 1:30) připraveného ve 12,5 mM hydrogenuhličitanu amonného. Štěpení proteinů se poté provádí pomocí UIP400MTP za stejných podmínek sonikace (amplituda 40%, 7 cyklů, 30 s zapnuto / 15 s vypnuto; celková doba: 5 min 45 s).
4. Po sonikaci se vzorky přenesou na filtrační destičky nebo se zpracují pomocí systémů FASP na bázi destiček. Kroky redukce a alkylace se provádějí přímo v destičce, což zachovává zjednodušený pracovní postup.
5. Štěpení trypsinem se provádí za řízených podmínek (např. 37°C, 4–16 hodin) s možností krátké ultrazvukové stimulace pro urychlení enzymatické aktivity a zvýšení výtěžku peptidů.
6. Peptidy se získají centrifugací a jsou připraveny k analýze LC-MS/MS.

Klíčová výhoda tohoto systému spočívá v jeho schopnosti zajistit identické podmínky zpracování ve všech jamkách, což minimalizuje vliv šarží a umožňuje robustní kvantitativní srovnání v rozsáhlých proteomických studiích.

Design, výroba a poradenství – kvalita Made in Germany

Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou proslulé svou nejvyšší kvalitou a konstrukčními standardy. Robustnost a snadná obsluha umožňují bezproblémovou integraci našich ultrazvukových přístrojů do průmyslových zařízení. Drsné podmínky a náročná prostředí ultrazvukové přístroje Hielscher snadno zvládají.

Hielscher Ultrasonics je společnost s certifikací ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrazvukové přístroje s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Ultrazvukové přístroje Hielscher samozřejmě vyhovují požadavkům CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Literatura / reference

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).