Ultrazvukové stříhání DNA

Během stříhání DNA a RNA jsou dlouhé molekuly DNA fragmentovány na menší kousky, což je zásadní krok při přípravě vzorků pro konstrukci knihovny sekvenování nové generace (NGS). Ultrazvukové stříhání DNA využívá akustické kavitační síly k rozbití DNA nebo RNA na fragmenty v rozmezí od 100 bp do 5 kb. Tato metoda umožňuje přesnou kontrolu nad velikostí fragmentů, což usnadňuje přizpůsobení na požadovanou délku DNA pro optimální výsledky sekvenování.

Stříhání DNA pomocí ultrazvuku

Hielscher Ultrasonics nabízí různá ultrazvuková řešení pro stříhání DNA, RNA a chromatinu. Vyberte si mezi ultrazvukovými přístroji typu sondy (např. UP100H) pro přímou sonikaci pomocí mikrošpičky, nebo použijte VialTweeeter nebo ultrazvukový cuphorn pro nepřímou přípravu DNA různých vzorků současně. Hielscher nabízí ideální zařízení s ohledem na vaše potřeby: ať už máte 1 nebo až 10 vzorků, objemy od mikrolitrů po litry – Hielscher sonicators splní vaše požadavky na přípravu fragmentů DNA, RNA a chromatinu ve správné délce. Reprodukovatelnost, snadná obsluha a přesné řízení umožňují spolehlivou knihovnu pro sekvenování nové generace.
Na rozdíl od enzymatické fragmentace DNA aplikuje ultrazvukové stříhání čisté mechanické smykové síly bez přidání jakýchkoli chemikálií. Přesným nastavením procesních parametrů produkuje ultrazvukové stříhání fragmenty DNA s vysokou molekulovou hmotností (plazmidová a genomová DNA).
Purifikované nukleové kyseliny mohou být amplifikovány před nebo po fragmentačním kroku.
Parametry ultrazvuku (výkon, pulzní cyklus / dávky, čas a teplota) lze bezpečně ovládat pomocí nastavení softwaru.

Protokoly pro ultrazvukové stříhání DNA

Pro stanovení imunoprecipitace chromatinu

Stručně řečeno, články byly pokoveny v miskách o průměru 60 mm (400 000 na misku) a transfekovány RhoA siRNA (jak je popsáno); po 72 hodinách byly inkubovány s formaldehydem (konečná koncentrace 1 %) po dobu 10 minut při teplotě 37 °C, aby se proteiny zesíťovaly s DNA. Zesíťovací reakce byla uhašena přidáním jedné desetiny objemu 1,25 mol/l glycinu, čímž se získala konečná koncentrace 125 mmol/l. Buňky byly dvakrát promyty ledově vychlazeným PBS, resuspendovány v radioimunoprecipitačním pufru [150 mmol/l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholát, 0,1% SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0)] obsahující 1 mmol/l fenylmethylsulfonylfluoridu, 1 Ag/ml aprotininu a 1 Ag/ml pepstatinu A a ponechány na ledu po dobu 30 minut. Poté byly buněčné lyzáty sonikovány na ledu s a Hielscher UP200S ultrazvukový sonikátor (3 x 40 s, amplituda 40%, cyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), dokud nebyly zesíťované chromatiny stříhány za vzniku fragmentů DNA mezi 200 a 1 000 bp. Jedna desetina celého lyzátu byla použita ke kvantifikaci množství DNA přítomné v různých vzorcích a považovala se za “celková vstupní DNA”. Supernatanty byly inkubovány s DNA/proteinem agarózou-50% suspenzí spermií lososa, aby se snížilo nespecifické pozadí. Imunoprecipitace byla poté provedena přes noc při 4 °C s 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) nebo bez protilátek (negativní kontrola). Tyto supernatanty byly doplněny o 5 mol/l NaCl a přes noc zahřáty na 65 °C, aby se zvrátily křížové vazby protein-DNA. Imunokomplexy byly dále ošetřeny proteinázou K bez DNázy a RNázy a DNA byla purifikována extrakcí fenolem/chloroformem a srážením ethanolu. PCR byla provedena se specifickými primery odpovídajícími sekvenci v promotorové oblasti lidského genu iNOS (p1 primer: 5¶-GAGGGCTCTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studie exprese EGFP

Pro studie exprese byl rekombinantní kmen L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Německo) s genem pro EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromozomálně ssu integrovaný, kultivován v různých médiích, jak bylo popsáno výše, a navíc doplněn o 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Německo). Během kultivace byly odebrány vzorky o objemu 1 ml, které byly odstředěny (2000 × g, 20 °C, 10 min) a promyty 0,9% roztokem NaCl. Peleta byla resuspendována v pufru (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) a dezintegrována sonifikací s ultrazvukovým procesorem UP400S (aplikace energie ∼ 400 Ws). Buněčné zbytky byly odstraněny centrifugací (6000 × g, 4°C, 5 min) a analyzovány elektroforézou dodecylsulfátu sodného – polyakrylamidového gelu (SDS-PAGE) za redukčních podmínek podle metody Laemmliho (1970) s 12,5% polyakralamidovými gely. Exprese EGFP byla zkoumána v rozrušené kultuře. (Fritsche et al. 2007)

imunoprecipitace chromatinu

Stanovení imunoprecipitace chromatinu bylo provedeno pomocí ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Karlovy Vary, CA, USA) dle návodu výrobce s určitými úpravami. Stručně řečeno, diferencované lidské podocyty byly zesíťovány 1% formaldehydem po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Buňky byly promyty ledově studeným PBS a fixační reakce byla zastavena přidáním 0,125 M glycinu po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Buňky byly znovu omyty ledově vychlazeným PBS a seškrábnuty z misky. Články byly peletovány centrifugací a resuspendovány v lyzačním pufru. Po centrifugaci byla peletovaná jádra resuspendována ve smykovém pufru, inkubována na ledu po dobu 30 minut a chromatin byl střižen sonikací, např. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Německo) při 25% napájení 5 pulzů po 20 sekundách na ledu na fragmenty přibližně 200–600 bp. Střižený chromatin byl poté odstředěn a supernatant byl odebrán. Pro imunoprecipitace bylo 60 μl chromatinu inkubováno s 1 μg protilátek Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) nebo NF-κB p50 (Abcam) nebo s králičím IgG (Zymed Laboratories), jako negativní kontrola, přes noc při 4 °C s mírnou rotací. Imunokomplexy navázané na magnetické kuličky byly shromážděny pomocí magnetického stojanu, rozsáhle promyty a příčné vazby protein/DNA byly obráceny a DNA eluována pro analýzu PCR v reálném čase. (Ristola et al. 2009)

Příprava EHEC DNA pro analýzu čipového pole

Uspořádání buněčných lyzátů a extrahovaných DNA
Bakteriální pelety suspendované v PBS na požadovanou konečnou koncentraci byly ošetřeny ultrazvukový disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Německo) vybavený mikrohrotem MS1 (průměr 1 mm). Pracovní frekvence byla 30 kHz a efektivní výstupní výkon byl 100 W. Během operace byly vzorky chlazeny v ledové vodní lázni, promíchány a odstředěny. Vzorky byly použity pro studie průtokovou cytometrií, zatímco pro pozdější manipulaci byly vzorky podrobeny tepelnému zpracování (95 °C, 5 min). Surové buněčné lyzáty byly zpracovány směsí fenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Stejný objem této směsi byl přidán do vzorku lyzátu, roztok byl intenzivně vířen po dobu 15 s a centrifugován při 15 000 x g po dobu 2 minut při pokojové teplotě (RT) kolem 22 °C. Vrchní vodná fáze obsahující genomovou DNA byla pečlivě oddělena a odebrána do nové sterilní Eppendorfovy zkumavky.
Následně byly vzorky sonikovány, aby se fragmentovala DNA. Krok sonikace byl realizován za stejných podmínek, jak je popsáno výše. Pro vyhodnocení fragmentačních účinků na genomovou DNA byly vzorky analyzovány pomocí elektroforézy na agarózovém gelu.
(…) Vzorky sonikované dříve po dobu 2,5 minuty byly podrobeny extrakčnímu kroku po tepelném zpracování a centrifugaci. Uvolněná DNA byla extrahována dvakrát směsí fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu a poté podrobena druhé sonikaci po dobu 0 – 15 minut. Agarózová gelová elektroforéza byla použita ke stanovení distribuce velikosti DNA vystavené ultrazvukové fragmentaci po extrakci (obr. vpravo nahoře). Vysoce fragmentovaná DNA byla zřejmá z přítomnosti nátěru DNA spíše než pásů s vysokou molekulovou hmotností, které byly odstraněny ze vzorků sonikovaných po dobu 2,5 minuty nebo déle. Delší sonikace postupně snižovala délku fragmentů na přibližně 150 – 600 bp a sonikace po dobu 15 minut dále degradovala tyto fragmenty, jak je vidět především na horní části nátěru. Průměrná velikost fragmentu DNA se tedy postupně snižovala s dobou ultrazvuku a 5minutová léčba umožnila získat velikosti fragmentů DNA, které jsou nejvhodnější pro testy čipového pole. Nakonec byl zaveden postup přípravy DNA analytu zahrnující první 2 minuty ultrazvukového ošetření, extrakci DNA (2×) a následnou 5minutovou sonikaci. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitace chromatinu (ChIP)

Buňky HEK293 byly kultivovány, jak je popsáno výše, a fixovány 2 mM disuccinimidyl-glutarátem po dobu 45 minut při pokojové teplotě. Následně byly buňky dvakrát promyty PBS. Chromatin byl zesíťován po dobu 10 minut při pokojové teplotě za použití 1% (v/v) formaldehydu a dvakrát promyt ledově studeným PBS. Zesíťovací reakce byla zastavena inkubací s glycinem v konečné koncentraci 0,125 M po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Po inkubaci s trypsinem byly buňky seškrábnuty z misky pro buněčnou kulturu a dvakrát promyty PBS. Buněčná peleta byla resuspendována v lyzačním pufru (5 mM trubky, pH 8,0, 85 mM KCl a 0,5 % (v/v) Nonidet P-40), inkubována na ledu po dobu 10 minut a homogenizována homogenizátorem Dounce. Následně byla jádra peletována centrifugací (3500 x g, 5 min, 4 °C) a resuspendována v pufru jader (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA a 1 % (w/v) SDS). Jádra byla narušena sonikací třemi 20sekundovými pulzy v a UP50H sonikátor (Hielscher Ultraschall Technologie) při nastavení cyklu 0,5 a amplitudy 30%, čímž se získají fragmenty genomové DNA o objemové velikosti 200 - 1000 bp. Pro ChIP bylo 50 g DNA 4krát zředěno v imunoprecipitačním pufru (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1 % (v/v) Triton X-100 a 0,01 % (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analýza modifikace histonů pomocí imunoprecipitace chromatinu (ChIP)

Krátce, 6 x 10⁶ Buňky byly dvakrát promyty PBS a zesíťovány na kultivační destičce po dobu 15 minut při pokojové teplotě v přítomnosti 0,5% formaldehydu. Zesíťovací reakce byla zastavena přidáním 0,125 M glycinu. Všechny následující kroky probíhaly při teplotě 48 °C. Všechny pufry byly předchlazeny a obsahovaly inhibitory proteázy (Complete Mini, Roche). Buňky byly dvakrát promyty PBS a poté seškrábnuty. Shromážděné pelety byly rozpuštěny v 1 ml lyzačního pufru (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) a byly sonikovány ve studené ethanolové lázni po dobu 10 cyklů při 100% amplitudě pomocí a UP50H sonikátor (Hielscher, Teltow, Německo). Fragmentace chromatinu byla vizualizována v 1% agarózovém gelu. Získané fragmenty se pohybovaly v rozmezí 200–500 pb. Rozpustný chromatin byl získán odstředěním sonikovaných vzorků při 14 000 g po dobu 10 minut při 48 ° C. Rozpustná frakce byla zředěna v poměru 1/10 v ředicím pufru (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), poté alikvotována a skladována při teplotě 80 °C až do použití. (Rodriguez et al. 2008)