Ultrazvukové stříhání DNA

Při stříhání DNA a RNA se dlouhé molekuly DNA fragmentují na menší úseky, což je klíčový krok při přípravě vzorků pro konstrukci knihoven pro sekvenování nové generace (NGS). Ultrazvukové stříhání DNA využívá síly akustické kavitace k rozštěpení DNA nebo RNA na fragmenty o velikosti od 100 bp do 5 kb. Tato metoda umožňuje přesnou kontrolu velikosti fragmentů, a tím přizpůsobení požadované délce DNA pro optimální výsledky sekvenování.

Stříhání DNA pomocí ultrazvuku

Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení založená na ultrazvuku pro stříhání DNA, RNA a chromatinu. Vyberte si mezi ultrazvukovými přístroji sondového typu (např. UP100H) pro přímou sonikaci pomocí mikrohrotu, nebo použijte VialTweeeter či ultrazvukový cuphorn pro nepřímou přípravu DNA z různých vzorků současně. Hielscher nabízí ideální přístroj s ohledem na vaše potřeby: ať už máte 1 nebo až 10 vzorků, objemy od mikrolitrů po litry – sonikátory Hielscher splní vaše požadavky na přípravu fragmentů DNA, RNA a chromatinu o správné délce. Reprodukovatelnost, snadná obsluha a přesná kontrola umožňují vytvořit spolehlivou knihovnu pro sekvenování nové generace.
Na rozdíl od enzymatické fragmentace DNA využívá ultrazvukové stříhání čistě mechanické smykové síly bez přidání jakýchkoli chemikálií. Díky přesnému nastavení procesních parametrů vytváří ultrazvukové stříhání fragmenty DNA s vysokou molekulovou hmotností (plazmidová a genomová DNA).
Purifikované nukleové kyseliny lze amplifikovat před fragmentačním krokem nebo po něm.
Parametry sonikace (výkon, pulzní cyklus / pulzy, čas a teplota) lze bezpečně řídit prostřednictvím nastavení softwaru.

Protokoly pro ultrazvukové stříhání DNA

Pro test imunoprecipitace chromatinu

Stručně: buňky byly vysety do misek o průměru 60mm (400 000 na misku) a transfekovány siRNA RhoA (jak bylo popsáno); po 72 h byly inkubovány s formaldehydem (výsledná koncentrace 1%) po dobu 10 min při 37°C za účelem zesítění proteinů s DNA. Zesíťovací reakce byla zastavena přidáním jedné desetiny objemu 1,25 mol/L glycinu, čímž byla dosažena výsledná koncentrace 125 mmol/L. Buňky byly dvakrát promyty ledově vychlazeným PBS, resuspendovány v pufru pro radioimunoprecipitační test [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholát, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] obsahujícím 1 mmol/L fenylmethylsulfonylfluoridu, 1 Ag/mL aprotininu a 1 Ag/mL pepstatinu A a ponechány na ledu 30 min. Poté byly buněčné lyzáty sonikovány na ledu ultrazvukovým sonikátorem Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplituda 40%, cyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), dokud nebyly zesítěné chromatiny nastříhány na fragmenty DNA o velikosti 200 až 1 000 bp. Jedna desetina celkového lyzátu byla použita ke kvantifikaci množství DNA přítomné v jednotlivých vzorcích a považována za „celkovou vstupní DNA“. Supernatanty byly inkubovány s 50% suspenzí DNA z lososího spermatu/proteinové agarózy ke snížení nespecifického pozadí. Imunoprecipitace pak probíhala přes noc při 4°C s 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) nebo bez protilátky (negativní kontrola). Tyto supernatanty byly doplněny 5 mol/L NaCl a zahřívány přes noc při 65°C za účelem zrušení zesítění protein-DNA. Imunokomplexy byly dále ošetřeny proteinázou K prostou DNáz a RNáz a DNA byla purifikována fenol/chloroformovou extrakcí a precipitací ethanolem. PCR byla provedena se specifickými primery odpovídajícími sekvenci v promotorové oblasti lidského genu iNOS (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studie exprese EGFP

Pro studie exprese byl rekombinantní kmen L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Německo) s genem pro EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromozomálně integrovaným do ssu, kultivován v různých médiích, jak bylo popsáno dříve, s dodatečným přídavkem 100 mg l^-1 nourseothricinu (Jena Bioscience, Německo). Během kultivace byly odebírány 1 ml vzorky, centrifugovány (2000 × g, 20°C, 10 min) a promyty 0,9% roztokem NaCl. Pelet byl resuspendován v pufru (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) a dezintegrován sonikací ultrazvukovým procesorem UP400S (aplikovaná energie ∼ 400 Ws). Buněčné zbytky byly odstraněny centrifugací (6000 × g, 4°C, 5 min) a analyzovány elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) za redukujících podmínek podle metody Laemmliho (1970) ve 12,5% polyakrylamidových gelech. Exprese EGFP byla zkoumána v třepané kultuře. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitace chromatinu

Test imunoprecipitace chromatinu byl proveden pomocí soupravy ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) podle pokynů výrobce s určitými úpravami. Stručně: diferencované lidské podocyty byly zesítěny 1% formaldehydem po dobu 10 min při pokojové teplotě. Buňky byly promyty ledově vychlazeným PBS a fixační reakce byla zastavena přidáním 0,125 M glycinu na 5 min při pokojové teplotě. Buňky byly znovu promyty ledově vychlazeným PBS a seškrábnuty z misky. Buňky byly peletovány centrifugací a resuspendovány v lyzačním pufru. Po centrifugaci byla peletovaná jádra resuspendována ve stříhacím pufru, inkubována na ledu 30 min a chromatin byl nastříhán sonikací, např. přístrojem UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Německo) při 25% výkonu 5 pulzy po 20 s na ledu na fragmenty o velikosti přibližně 200–600 bp. Nastříhaný chromatin byl poté centrifugován a supernatant byl odebrán. Pro imunoprecipitace bylo 60 μl chromatinu inkubováno s 1 μg protilátek Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) nebo NF-κB p50 (Abcam) nebo s králičím IgG (Zymed Laboratories) jako negativní kontrolou přes noc při 4°C za mírné rotace. Imunokomplexy navázané na magnetické kuličky byly zachyceny pomocí magnetického stojanu, důkladně promyty, zesítění protein/DNA byla zrušena a DNA byla eluována pro analýzu real-time PCR. (Ristola et al. 2009)

Příprava DNA EHEC pro analýzu na čipových polích

Příprava buněčných lyzátů a extrahovaných DNA
Bakteriální pelety suspendované v PBS na požadovanou výslednou koncentraci byly ošetřeny ultrazvukovým dezintegrátorem UP100H (Hielscher GmbH, Německo) vybaveným mikrohrotem MS1 (o průměru 1mm). Pracovní frekvence byla 30 kHz a efektivní výstupní výkon 100 W. Během provozu byly vzorky chlazeny v lázni s ledovou vodou, míchány a centrifugovány. Vzorky byly použity pro studie průtokové cytometrie, zatímco pro pozdější zpracování byly vzorky podrobeny tepelnému ošetření (95°C, 5 min). Surové buněčné lyzáty byly zpracovány směsí fenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Ke vzorku lyzátu byl přidán stejný objem této směsi, roztok byl intenzivně vortexován 15 s a centrifugován při 15 000 x g po dobu 2 min při pokojové teplotě (RT) kolem 22°C. Horní vodná fáze obsahující genomovou DNA byla opatrně oddělena a přenesena do nové sterilní zkumavky Eppendorf.
Následně byly vzorky sonikovány za účelem fragmentace DNA. Krok sonikace byl proveden za stejných podmínek, jak je popsáno výše. K vyhodnocení účinků fragmentace na genomovou DNA byly vzorky analyzovány agarózovou gelovou elektroforézou.
(…) Vzorky dříve sonikované po dobu 2,5 min byly po tepelném ošetření a centrifugaci podrobeny extrakčnímu kroku. Uvolněná DNA byla dvakrát extrahována směsí fenol:chloroform:isoamylalkohol a poté podrobena druhé sonikaci po dobu 0 – 15 min. Agarózová gelová elektroforéza byla použita ke stanovení distribuce velikostí DNA podrobené ultrazvukové fragmentaci po extrakci (obr. vpravo nahoře). Vysoce fragmentovaná DNA byla patrná z přítomnosti šmouhy DNA namísto pruhů s vysokou molekulovou hmotností, které ze vzorků sonikovaných 2,5 min nebo déle vymizely. Delší sonikace postupně zkracovala délky fragmentů na přibližně 150 – 600 bp a sonikace po dobu 15 min tyto fragmenty dále degradovala, jak je patrné především na horní části šmouhy. Průměrná velikost fragmentů DNA tedy s dobou ultrazvukové sonikace postupně klesala a 5min ošetření umožnilo získat velikosti fragmentů DNA nejvhodnější pro testy na čipových polích. Nakonec byl stanoven postup přípravy analytu DNA zahrnující nejprve 2 min ultrazvukového ošetření, extrakci DNA (2×) a následnou 5min sonikaci. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitace chromatinu (ChIP)

Buňky HEK293 byly kultivovány, jak je popsáno výše, a fixovány 2 mM disukcinimidyl-glutarátem po dobu 45 min při pokojové teplotě. Následně byly buňky dvakrát promyty PBS. Chromatin byl zesítěn po dobu 10 min při pokojové teplotě pomocí 1% (v/v) formaldehydu a dvakrát promyt ledově vychlazeným PBS. Zesíťovací reakce byla zastavena inkubací s glycinem o výsledné koncentraci 0,125 M po dobu 5 min při pokojové teplotě. Po inkubaci s trypsinem byly buňky seškrábnuty z misky pro buněčnou kulturu a dvakrát promyty PBS. Buněčný pelet byl resuspendován v lyzačním pufru (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl a 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubován na ledu 10 min a homogenizován Dounceovým homogenizátorem. Následně byla jádra peletována centrifugací (3500 x g, 5 min, 4 °C) a resuspendována v jaderném pufru (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA a 1% (w/v) SDS). Jádra byla rozrušena sonikací třemi 20sekundovými pulzy v sonikátoru UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) při nastavení cyklu 0,5 a amplitudy 30%, čímž byly získány fragmenty genomové DNA o převažující velikosti 200 – 1000 bp. Pro ChIP bylo 50g DNA zředěno 4násobně v imunoprecipitačním pufru (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 a 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analýza modifikací histonů pomocí imunoprecipitace chromatinu (ChIP)

Stručně: 6 x 10⁶ buněk bylo dvakrát promyto PBS a zesítěno na kultivační destičce po dobu 15 min při pokojové teplotě v přítomnosti 0,5% formaldehydu. Zesíťovací reakce byla zastavena přidáním 0,125 M glycinu. Všechny následující kroky byly prováděny při 48°C. Všechny pufry byly předem vychlazené a obsahovaly inhibitory proteáz (Complete Mini, Roche). Buňky byly dvakrát promyty PBS a poté seškrábnuty. Získané pelety byly rozpuštěny v 1 ml lyzačního pufru (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) a sonikovány v chladné ethanolové lázni po dobu 10 cyklů při 100% amplitudě pomocí sonikátoru UP50H (Hielscher, Teltow, Německo). Fragmentace chromatinu byla vizualizována v 1% agarózovém gelu. Získané fragmenty byly v rozmezí 200–500pb. Rozpustný chromatin byl získán centrifugací sonikovaných vzorků při 14 000g po dobu 10 min při 48°C. Rozpustná frakce byla zředěna 1/10 v ředicím pufru (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), poté rozdělena na alikvoty a až do použití uchovávána při 80°C. (Rodriguez et al. 2008)