Hielscher ultrazvuková technologie

Ultrazvukové DNA Stříhání

  • Během DNA a RNA stříhání, molekuly DNA jsou rozděleny na menší kousky. DNA fragmentace / RNA je jedním z důležitých vzorek prep kroky potřebné vytvářet knihovny pro příští generace sekvenování (NGS).
  • Ultrazvukové DNA stříhání využívá síly akustické kavitace rozbít DNA nebo RNA do kusů 100 – 5kilobajt bp.
  • Ultrazvuková stříhání umožňuje přesné fragmentace DNA a přizpůsobení na požadovanou délku DNA.

Ultrazvukové DNA Stříhání

Hielscher Ultrazvuk nabízí různá řešení ultrazvukové založené na DNA, RNA a chromatinu stříhání. Vyberte si mezi sondu typu ultrasonicators (např. UP100H) pro přímé působení ultrazvuku za použití mikrošpičky, nebo pomocí VialTweeeter nebo ultrazvukový cuphorn pro nepřímý přípravu DNA různých vzorků současně. Hielscher nabízí ideální zařízení s ohledem na vaše potřeby: wether máte 1, nebo až 10 vzorků, svazky z mikrolitru do svazků litrových – Hielscher ultrazvukové procesory jsou k dispozici pro splnění své požadavky na přípravu DNA, RNA a chromatinu fragmenty na správnou délku. Reprodukovatelnost, snadná obsluha a přesné ovládání umožňují spolehlivé knihovny pro sekvenování nové generace.
Na rozdíl od enzymatické fragmentace DNA, ultrazvukové stříhání platí čisté mechanické střižné síly bez přidání chemických látek. V přesné nastavení procesních parametrů, ultrazvukový stříhání produkuje fragmenty DNA s vysokou molekulovou hmotností (plazmidové a genomové DNA).
Purifikované nukleové kyseliny mohou být amplifikovány před nebo po fragmentačního kroku.
Parametry sonikaci (síla, impulz / praskne, čas a teplota) lze ovládat bezpečně pomocí nastavení softwaru.

Výhody:

  • přesná regulace
  • sonikaci cyklů a doba přesně lze přizpůsobit požadované velikosti DNA
  • Fragmenty DNA s vysokou molekulovou hmotností
  • regulace teploty
  • Rychle
  • reprodukovatelné výsledky
  • autoklávovatelná
  • různá řešení: Sondy typu, VialTweeter a CupHorn

Protokoly pro ultrazvukové DNA stříhání

Pro imunoprecipitace chromatinu Assay

Stručně, buňky byly umístěny do misky s průměrem 60 mm (400 000 na misku) a transfekovány RhoA siRNA (jak je popsáno); po 72 hodinách byly inkubovány s formaldehydem (konečná koncentrace, 1%) po dobu 10 minut při teplotě 37 ° C k zesíťování proteinů na DNA. Zesíťovací reakce byla ukončena přidáním jedné desetiny objemu 1,25 mol / l glycinu, což poskytlo konečnou koncentraci 125 mmol / l. Buňky byly dvakrát promyty ledově chladným PBS, resuspendovány v pufru pro stanovení radioimunoprecipitačního testu (150 mmol / 1 NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholát, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl ) obsahující 1 mmol / l fenylmethylsulfonylfluoridu, 1 Ag / ml aprotininu a 1 Ag / ml pepstatinu A a udržuje se na ledu po dobu 30 minut. Poté byly buněčné lyzáty sonikovány na ledu a Hielscher UP200S ultrazvuk sondou (3 x 40 s, amplituda 40%, cyklus 1, Hielscher Ultrasonics GmbH) do zesítěných chromatins byly stříhané, čímž se získá DNA fragmentů mezi 200 a 1000 bp. Jedna desetina celého lyzátu byla použita pro kvantifikaci množství DNA přítomné v různých vzorcích a jsou považovány za “celkový příkon DNA”, Supernatanty se inkubují s DNA ze spermatu lososa / protein agarosa-50% suspenze pro snížení nespecifické pozadí. Imunoprecipitace se pak provádí přes noc při teplotě 4 ° C s 5 Ag anti-NF-NB p65 (Upstate) nebo bez protilátky (negativní kontrola). Tyto supernatanty byly doplněny 5 mol / l chloridu sodného a směs se zahřívá přes noc při teplotě 65 ° C, aby se vrátit protein-DNA příčné vazby. Imunokomplexy byly dále léčeni DNase- a RNasy proteinázy K, a DNA byla čištěna fenol / extrakcí chloroformem a srážením ethanolem. PCR byla provedena s specifickými primery, které odpovídají sekvenci v oblasti promotoru lidského genu pro iNOS (P1 primeru: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶ P2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-expresní studie

Pro studie exprese rekombinantní kmen L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Německo) s genem pro EGFP (zesílený zelený fluorescenční protein), chromozomální SSU integrované, byly kultivovány v různých médiích, jak je popsáno výše, a navíc doplněna 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Německo). V průběhu kultivace 1 ml byly odebrány vzorky, centrifugovány (2000 x g, 20 ° C, 10 min) a promyje se 0,9% roztokem chloridu sodného. Peleta byla resuspendována v pufru (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) a rozpadaly se sonikací s ultrazvukovým procesorem UP400S (Aplikace energie ~ 400 Ws). Buněčné zbytky byly odstraněny centrifugací (6000 x g, 4 ° C, 5 min) a analyzovány pomocí dodecylsulfát sodný - polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) za redukčních podmínek, podle způsobu, který popsal Laemmli (1970) s 12,5% polyacralamide gely , EGFP-exprese byla zkoumána v míchané kultuře. (Fritsche et al., 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Elektroforetická analýza genomové DNA E. coli EDL933 podrobené 0-15 min ultrazvuku. L označuje DNA Ladder. (Basselet et al., 2008)

Žádost o informace





imunoprecipitace chromatinu

Ultrazvukové buněk disruptor UP100H (100 W) pro lýzu, narušení buněk a DNA stříhání.Test imunoprecipitace chromatinu byla provedena za použití na čipové ITTm Expresní (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) podle instrukcí výrobce s některými modifikacemi. Stručně, diferencovaných lidských podocyty byly zesítěné 1% formaldehydu po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Buňky se promyjí ledově chladným PBS a fixační reakce byla zastavena přidáním 0,125 M glycin po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Buňky byly opět promyty ledovým PBS a vyjme z misky. Buňky byly peletovány odstředěním a resuspendovány v lyzačním pufru. Po odstředění se peletované jádra byly resuspendovány v stříhacího pufru, inkubovány na ledu po dobu 30 minut a chromatin se prořezává ultrazvuku, např. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Německo) při 25% výkonu 5 impulzů po 20 s na ledu na fragmenty přibližně 200-600 bp. Nakrájený chromatin byl potom centrifugován a supernatant byl shromážděn. Pro imunoprecipitace bylo 60 ul chromatinu inkubováno s 1 ug Spl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), protilátky NF-kB B65 (Abcam, Cambridge, UK) nebo NF-κB p50 (Abcam) IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), jako negativní kontrola, přes noc při 4 ° C s jemnou rotací. Imunokomplexy navázané na magnetické kuličky byly shromážděny za použití magnetického stojanu, důkladně promyty a křížové vazby protein / DNA byly obráceny a DNA byla eluována pro PCR v reálném čase. (Ristola a kol., 2009)

EHEC Příprava DNA pro analýzu čipu pole

Uspořádání buněčných lyzátů a extrahované DNA
Bakteriální pelety suspendované v PBS na požadovanou konečnou koncentraci byly ošetřeny ultrazvuk disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Německo) vybavené mikroprocesorem MS1 (průměr 1 mm). Pracovní frekvence byla 30 kHz a účinný výkon byl 100 W. Během operace byly vzorky ochlazeny v lázni s ledem a vodou, smíchány a centrifugovány. Vzorky byly použity pro studie průtokové cytometrie, zatímco pro pozdější manipulaci byly vzorky podrobeny tepelnému zpracování (95 ° C, 5 min). Surové buněčné lyzáty byly zpracovány směsí fenolu: chloroformu a isoamylalkoholu (25: 24: 1). Do vzorku lyzátu byl přidán stejný objem této směsi, roztok byl intenzivně promícháván po dobu 15 s a centrifugován při 15 000 xg po dobu 2 min při pokojové teplotě (RT) kolem 22 ° C. Horní vodná fáze obsahující genomovou DNA byla pečlivě oddělena a zachycena v nové sterilní eppendorfní zkumavce.
Následně byly vzorky sonikovány k fragmentaci DNA. Sonikační krok byl realizován za stejných podmínek, jak bylo popsáno výše. Za účelem vyhodnocení fragmentačních účinků na genomovou DNA byly vzorky analyzovány pomocí elektroforézy na agarosovém gelu.
(…) Vzorky ultrazvukově zpracované po dobu 2,5 min byly podrobeny extrakčnímu kroku po tepelném zpracování a centrifugaci. Uvolněná DNA se dvakrát extrahuje směsí fenol: chloroform: isoamylalkohol a poté se podrobí druhé sonikaci po dobu 0 až 15 minut. Agarosová gelová elektroforéza byla použita pro stanovení distribuce velikosti DNA, která byla vystavena ultrazvukové fragmentaci po extrakci (obr. Vpravo nahoře). Vysoce fragmentovaná DNA byla patrná z přítomnosti DNA nátěru spíše než pásů s vysokou molekulovou hmotností, které byly vyloučeny ze vzorků sonikovaných po dobu 2,5 min nebo déle. Dlouhodobá sonikace postupně snižovala délku fragmentů přibližně na 150-600 bp a ultrazvukem po dobu 15 minut dále tyto fragmenty degradovaly, jak je patrné hlavně v horní části nátěru. Takže průměrná velikost fragmentu DNA postupně klesá s ultrazvukovým časem a 5 min ošetření umožňuje získat velikosti fragmentů DNA, které jsou nejvhodnější pro testy na čipových sadách. Nakonec byl stanoven postup přípravy analytu DNA zahrnující první 2 min ultrazvukového ošetření, extrakci DNA (2x) a následnou 5 minutovou sonikaci. (Basselet a kol., 2008)

Imunoprecipitace chromatinu (čipu)

Ultrazvukový procesor UP100H pro DNA, RNA a chromatické zkosení. (Klepnutím zvětšíte!)Buňky HEK293 byly kultivovány, jak je popsáno výše, a fixovány 2 mM disukcinimidylglutarátem po dobu 45 minut při teplotě místnosti. Následně byly buňky promyty dvakrát PBS. Chromatin se zesíťoval 10 minut při teplotě místnosti za použití 1% (obj./obj.) Formaldehydu a dvakrát se promyl ledově chladným PBS. Zesíťovací reakce byla zastavena inkubací s glycinem v konečné koncentraci 0,125 M po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Po inkubaci s trypsinem byly buňky zškrceny z kultivační misky a promyty dvakrát PBS. Buněčná peleta byla resuspendována v lyzačním pufru (5 mM potrubí, pH 8,0, 85 mM KC1 a 0,5% (obj./obj.) Nonidet P-40), inkubovány na ledu po dobu 10 minut a homogenizovány homogenizátorem Dounce. Následně byly jádra peletovány centrifugací (3500 xg, 5 min, 4 ° C) a resuspendovány v jádrovém pufru (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA a 1% (hmotn./obj.) SDS). Jádra byla přerušena sonikací se třemi 20-ti pulzy v a UP50H sonikátor (Hielscher Ultraschall Technologie) při nastavení cyklu 0,5 a amplitudě 30%, čímž se získá fragmentů genomové DNA s velikostí objemové 200 - 1000 bp. Pro třískové, 50g DNA se zředí 4-násobně v imunoprecipitačním pufru (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100, a 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al., 2006)

modifikace histonů analýza chromatinové imunoprecipitace (ChIP)

Stručně, 6 x 106 buňky byly dvakrát promyty PBS a zesíťovány na kultivační desce po dobu 15 minut při teplotě místnosti v přítomnosti 0,5% formaldehydu. Zesíťovací reakce byla zastavena přidáním 0,125 M glycinu. Všechny následující kroky byly provedeny při 48 ° C. Všechny pufry byly předchladeny a obsahovaly inhibitory proteázy (Complete Mini, Roche). Buňky byly dvakrát promyty PBS a potom byly oškrábány. Shromážděné pelety byly rozpuštěny v 1 ml lýzovacího pufru (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) a sonikovány ve studeném etanolovém lázni po dobu 10 cyklů při 100% amplitudě za použití UP50H sonikátor (Hielscher, Teltow, Německo). Chromatinu fragmentace byl vizualizován v 1% agarózovém gelu. Získané fragmenty byly v 200-500pb rozsahu. Rozpustný chromatin byla získána odstředěním působení ultrazvuku vzorků při 14,000g po dobu 10 minut při teplotě 48 ° C. Rozpustná frakce byla naředěna 1/10 v ředicím pufru (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) a poté rozdělen na alikvoty a uchováván při teplotě 80 ° C až do použití. (Rodriguez et al., 2008)

přístroj Výkon [W] Typ Objem [ml]
VialTweeter 200 samostatný 00,5 1,5
UP50H 50 handheld nebo standmounted 0.01 250
UP100H 100 handheld nebo standmounted 0.01 500
Uf200 ः t 200 handheld nebo standmounted 00,1 1000
UP200St 200 stojící 00,1 1000
UP400St 400 stojící 5,0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreherec 10 200
GDmini2 200 bez kontaminace toku buněk

Žádost o informace





Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter pro ultrazvukové vzorku prep

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Požádejte o další informace

Použijte formulář níže, pokud chcete požádat o další informace o ultrazvukové homogenizace. Budeme rádi Vám nabídnout ultrazvukový systém plnění vašich požadavků.









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


Literatura / Reference

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): zpracování vzorků pro DNA čip založená na poli analýzy enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Mikrobiální buněčné továrny 7:29. 2008.
  • . Doublier S., Riganti Ch, Voena C, Costamagna C, Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Umlčení Obnoví Odolnost vůči doxorubicinu v lidských nádorových buněk tlustého střeva. Cancer Molecular Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NNH, Simonsson M. (2008): vyhodnocení Způsob extrakce Fusarium DNA od mycelia a pšenice na po proudu real-time PCR kvantifikace a korelace s mykotoxinů , Journal of mikrobiologické metody 2008.
  • Fritsche C, Sedací M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Charakterizace chování růstu Leishmania tarentolae - nového expresního systému pro rekombinantní proteiny. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulace Neph3 genu v podocytech - klíčové role transkripčních faktorů NF-kB a SP1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C, Munoz M., E. Vendrell, Peinado M. A. (2008): Genome-Wide sledování nemethylované DNA Alu opakuje v normálních a nádorových buněk. Nucleic Acids Research, sv. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): histidin Triáda Protein Hint1 spouští apoptózu nezávislá na její enzymatickou aktivitu. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, č 37, 2006. 27356-27366.


Fakta Worth Knowing

Ultrazvuková / akustické kavitace vytváří vysoce intenzivní síly, které podporuje krystalizace a srážkové procesy (Klikněte pro zvětšení!)

Ultrazvukové DNA stříhání je založena na akustické kavitace a jeho hydrodynamické střižné síly