Ultrazvuková příprava vzorků pro testy ELISA

Testy jako ELISA se široce používají v diagnostice in vitro, k detekci proteinů souvisejících s onemocněními a při kontrole kvality (např. při monitorování potravinových alergenů). Ultrazvuková příprava vzorků je rychlá, spolehlivá a reprodukovatelná technika k lyzi buněk a izolaci intracelulárních proteinů, DNA, RNA a organel. Hielscher Ultrasonics nabízí různá ultrazvuková řešení pro pohodlnou přípravu jednotlivých vzorků, více lahviček i mikrotitračních destiček a 96jamkových destiček.

ELISA – enzymově vázaný imunosorbentní test

ELISA je zkratka pro enzymově vázaný imunosorbentní test (enzyme-linked immunosorbent assay) a jde o široce používanou biochemickou analytickou techniku z kategorie testů založených na vazbě ligandu. Při metodě ELISA se kapalný vzorek nanáší na stacionární pevnou fázi se speciálními vazebnými vlastnostmi. Stacionární pevná fáze se obvykle nanáší jako povlak na jamkovou destičku neboli destičku ELISA. Poté se postupně přidávají různá kapalná činidla, inkubují se a promývají, takže nakonec v konečné kapalině v jamce dojde k optické změně (např. ke vzniku zbarvení produktem enzymatické reakce). Optická změna umožňuje měřit množství analytu pomocí tzv. kvantitativního „odečtu“. Pro kvantitativní odečet se používá spektrofotometr, fluorometr nebo luminometr, který detekuje a měří intenzitu procházejícího světla. Citlivost detekce je ovlivněna zesílením signálu během analytických reakcí. Protože enzymové reakce jsou dobře prozkoumané a spolehlivé zesilovací procesy, používají se k vytvoření signálu enzymy. Enzymy jsou navázány na detekční činidla v pevně daných poměrech, aby bylo možné přesné kvantitativní stanovení, což vysvětluje i název „enzymově vázaný“ imunosorbentní test.
Protože se testy ELISA provádějí v mikrotitračních destičkách / 96jamkových destičkách, označuje se tato metoda jako technika testů na destičkách a používá se např. v klinické diagnostice in vitro, ve výzkumu, při vývoji léčiv atd. k detekci a kvantifikaci protilátek, peptidů, proteinů a hormonů.
Technika ELISA se často používá jako diagnostický nástroj v medicíně, biotechnologiích a fytopatologii a je také důležitým měřením v rámci kontroly kvality v mnoha průmyslových odvětvích.

Ultrazvuková příprava vzorků před testem ELISA

Před provedením testu ELISA vyžadují vzorky přípravné kroky, jako je lyze buněk a extrakce intracelulárních proteinů, DNA, RNA atd. Výhodou ultrazvukové lyze buněk a izolace proteinů je její vysoká účinnost, spolehlivost a reprodukovatelnost. Všechny tyto faktory jsou důležité pro dosažení vysoce kvalitních diagnostických a výzkumných výsledků

Protokol ultrazvukové lyze buněk před testem ELISA

• Pro buněčné kultury: Před ultrazvukovou lyzí buněk centrifugujte buňky 5 min při 270 x g v mikrocentrifuze. Odstraňte supernatant odsátím a resuspendujte buňky v 30 – 100 μL pufru RIPA. Poté inkubujte buněčný pelet 30 min na ledu.
• Nyní je vzorek buněk připraven k ultrazvukové lyzi:
  Použijte ultrazvukový přístroj sondového typu (např. UP200Ht se sondou S26d2) nebo ultrazvukové zařízení pro více vzorků (např. VialTweeter pro současnou sonikaci až 10 lahviček nebo UIP400MPT pro mikrotitrační destičky / 96jamkové destičky) v závislosti na počtu vzorků, které potřebujete připravit.
  Pro sonikaci jednotlivého vzorku sondou umístěte buňky do 1,5 mL mikrocentrifugačních zkumavek.
• Předem nastavte dobu ultrazvukového působení, celkový energetický vstup, cyklický režim a/nebo teplotní limity v digitálním menu ultrazvukového přístroje. To zajišťuje vysoce spolehlivou sonikaci a opakovatelnost.
• Vložte sonotrodu a zapněte ultrazvukové zařízení. Mikrohrotem ultrazvukové sondy jemně pohybujte vzorkem, aby byl vzorek sonikován rovnoměrně.
  U většiny buněk je ultrazvuková lyze dokončena po 2–4 cyklech sonikace po 10 s.
• Po sonikaci vyjměte sonotrodu ze vzorku. Vzorky by měly být inkubovány 5 min na ledu. Poté centrifugujte při 10 000 x g po dobu 20 min, aby se buněčné zbytky usadily do peletu. Přeneste supernatanty do nové mikrocentrifugační zkumavky. Označte analyty a uchovávejte je při -20°C.
• Ultrazvukovou sonotrodu lze vyčistit důkladným otřením alkoholem nebo sonikací v kádince naplněné alkoholem, např. 70% ethanolem. Všechny ultrazvukové sondy vyrobené z titanu jsou autoklávovatelné.

• Opláchněte tkáň ledově studeným PBS (0,01M, pH=7,4), abyste důkladně odstranili přebytečnou hemolyzovanou krev.
• Zvažte tkáň (ledviny, srdce, plíce, slezina atd.) a rozmělněte ji na malé kousky, které se homogenizují v PBS. Potřebný objem PBS závisí na hmotnosti tkáně. Podle orientačního pravidla vyžaduje 1g tkáně přibližně 9mL PBS. Doporučuje se přidat do PBS trochu inhibitoru proteáz. (Alternativně lze použít pufr RIPA nebo hypotonický lyzační pufr obsahující koktejl inhibitorů proteáz a fosfatáz.)
• V závislosti na velikosti tkáně může být k předúpravě tkáně užitečné krátké vortexování (přibližně 1–2 min. v pulzech po 15 s).
• Nasaďte na ultrazvukový přístroj mikrohrot, např. S26d2. Umístěte zkumavku se vzorkem tkáně do ledové lázně.
• Sonikujte vzorek ultrazvukovým přístrojem, např. UP200St (80% amplituda), po dobu 1 min. v pulzním režimu (15 s zapnuto, 15 s pauza). Udržujte vzorek v ledové lázni.
• Homogenáty se poté centrifugují, aby se získaly specifické frakce (cytosolová, jaderná, mitochondriální nebo lyzozomální) za účelem obohacení proteinu pro analýzu. Centrifugací vzorku po dobu 5 minut při 5000×g se získá supernatant.

Spolehlivá regulace teploty během sonikace

Teplota je klíčovým faktorem ovlivňujícím proces, který je zvláště důležitý při zpracování biologických vzorků, např. aby se zabránilo tepelné degradaci proteinů. Stejně jako všechny mechanické techniky přípravy vzorků vytváří sonikace teplo. Teplotu vzorků však lze při použití zařízení Hielscher Ultrasonics dobře regulovat. Představujeme vám různé možnosti, jak monitorovat a regulovat teplotu vašich vzorků při jejich preanalytické přípravě pomocí ultrazvukového přístroje sondového typu nebo zařízení VialTweeter.

1. Monitorování teploty vzorku: Všechny digitální ultrazvukové procesory Hielscher jsou vybaveny inteligentním softwarem a připojitelným teplotním senzorem. Zapojte teplotní senzor do ultrazvukového zařízení (např. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonikátor pro vícejamkové destičky UIP400MTP) a vložte hrot teplotního senzoru do jedné ze zkumavek se vzorky. Prostřednictvím digitálního barevného dotykového displeje můžete v menu ultrazvukového procesoru nastavit konkrétní teplotní rozsah pro sonikaci vzorku. Ultrazvukový přístroj se automaticky zastaví po dosažení maximální teploty a zůstane pozastaven, dokud teplota vzorku neklesne na spodní hodnotu nastaveného teplotního ∆. Poté se sonikace automaticky znovu spustí. Tato chytrá funkce zabraňuje degradaci vyvolané teplem.
2. U ultrazvukové jednotky pro více vzorků VialTweeter lze předem zchladit titanový blok, který drží zkumavky se vzorky. Vložení bloku VialTweeter (pouze sonotrody bez měniče!) do chladničky nebo mrazničky k předchlazení titanového bloku pomáhá oddálit nárůst teploty ve vzorku. Je-li to možné, lze předchladit i samotný vzorek.
3. K chlazení během sonikace použijte ledovou lázeň nebo suchý led. Během sonikace umístěte zkumavku (zkumavky) se vzorkem do ledové lázně. U zařízení VialTweeter použijte mělkou misku naplněnou suchým ledem a umístěte VialTweeter na suchý led, aby se teplo mohlo rychle odvádět.

Zákazníci po celém světě používají ultrazvukové přístroje sondového typu Hielscher i jednotky pro sonikaci více vzorků VialTweeter a UIP400MTP pro každodenní přípravu vzorků v biologických, biochemických, lékařských a klinických laboratořích. Díky inteligentnímu softwaru a regulaci teploty procesorů Hielscher je teplota spolehlivě regulována a je zabráněno degradaci vzorků vyvolané teplem. Ultrazvuková příprava vzorků s ultrazvukovými řešeními Hielscher přináší vysoce spolehlivé a reprodukovatelné výsledky!
Přečtěte si více o vysokokapacitní sonikaci pomocí sonikátoru pro vícejamkové destičky UIP400MTP pro testy!