Ultrazvuková příprava vzorku pro testy ELISA

Testy, jako je ELISA, jsou široce používány pro diagnostiku in vitro, detekci proteinů souvisejících s onemocněním a kontrolu kvality (např. sledování potravinových alergenů). Ultrazvuková příprava vzorku je rychlá, spolehlivá a reprodukovatelná technika pro lýzu buněk a izolaci intracelulárních proteinů, DNA, RNA a organel. Hielscher Ultrasonics nabízí různá ultrazvuková řešení pro pohodlnou přípravu jednotlivých vzorků, více lahviček, stejně jako pro mikrotitrační desky a 96jamkové desky.

ELISA – Enzymový imunosorbentní test

ELISA je zkratka pro enzym-linked immunosorbent assay a je široce používanou technikou biochemické analýzy v kategorii testů vázajících ligand. V testu ELISA se kapalný vzorek přidá na stacionární pevnou fázi se speciálními vazebnými vlastnostmi. Za normálních okolností se stacionární pevná fáze nanáší jako povlak na destičku jamky nebo destičku ELISA. Poté se postupně přidávají, inkubují a promývají různá kapalná činidla, takže nakonec dojde k optické změně (např. vývoji barvy produktem enzymatické reakce) v konečné kapalině v jamce. Optická změna umožňuje měřit množství analytu tzv. kvantitativním měřením “čtení". Pro kvantitativní odečet se používá spektrofotometr, fluorometr nebo luminometr k detekci a měření intenzity procházejícího světla. Citlivost detekce je ovlivněna zesílením signálu během analytických reakcí. Vzhledem k tomu, že enzymové reakce jsou dobře prozkoumány a spolehlivé amplifikační procesy, používají se k vytvoření signálu enzymy. Enzymy jsou spojeny s detekčními činidly v pevných poměrech, aby bylo možné přesnou kvantifikaci, což také vysvětluje název "enzymově vázaný" imunosorbentní test.
Vzhledem k tomu, že testy ELISA se provádějí na mikrotitračních destičkách / 96jamkových destičkách, je známá jako technika stanovení na destičkách a používá se např. v klinické diagnostice in vitro, výzkumu, vývoji léčiv atd. pro detekci a kvantifikaci protilátek, peptidů, proteinů a hormonů.
Technika ELISA se často používá jako diagnostický nástroj v medicíně, biotechnologiích, patologii rostlin a je také důležitým měřením kontroly kvality v mnoha průmyslových odvětvích.

Ultrazvuková příprava vzorku před ELISA

Před provedením testu ELISA vyžadují vzorky kroky přípravy, jako je lýza buněk a extrakce intracelulárních proteinů, DNA, RNA atd. Výhodou ultrazvukové lýzy buněk a izolace proteinů je její vysoká účinnost, spolehlivost a reprodukovatelnost. Všechny tyto faktory jsou důležité pro získání kvalitní diagnostiky a výsledků výzkumu

Protokol pro ultrazvukovou lýzu buněk Pre-ELISA

• Pro buněčné kultury: Před ultrazvukovou lýzou buněk centrifugujte buňky po dobu 5 minut při 270 x g v mikrocentrifuze. Odstraňte supernatant aspirací a resuspendujte buňky v 30 – 100 μl pufru RIPA. Poté buněčnou peletu inkubujte na ledu po dobu 30 minut.
• Nyní je vzorek buňky připraven k ultrazvukové lýze:
  Použijte ultrazvukový přístroj typu sondy (např. UP200Ht se sondou S26d2) nebo ultrazvukové zařízení pro více vzorků (např. VialTweeter pro současnou sonikaci až 10 lahviček nebo UIP400MPT pro mikrotitrační destičky / 96jamkové destičky) v závislosti na množství vzorků, které potřebujete připravit.
  Pro soniku typu sondy jednoho vzorku umístěte buňky do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek.
• Přednastavte dobu trvání ultrazvuku, celkový příkon energie, režim cyklu a/nebo teplotní limity v digitální nabídce ultrasonicatoru. To zajišťuje vysoce spolehlivou sonikaci a opakovatelnost.
• Vložte sonotrodu a zapněte ultrazvukové zařízení. Jemně pohybujte mikrohrotem ultrazvukové sondy vzorkem, aby se vzorek rovnoměrně sonikoval.
  U většiny buněk bude ultrazvuková lýza dokončena po 2 -4 cyklech po 10 sekundách sonikace.
• Po sonikaci odstraňte sonotrodu ze vzorku. Vzorky by měly být inkubovány na ledu po dobu 5 minut. Poté odstřeďujte při 10 000 x g po dobu 20 minut, aby se zbytky peletovaly. Přeneste supernatanty do nové mikrocentrifugační zkumavky. Analyty označte a skladujte při teplotě -20 °C.
• Ultrazvukovou sonotrodu lze vyčistit tak, že ji řádně otřete alkoholem nebo sonikátem v kádince naplněné alkoholem, např. 70% ethanolem. Všechny ultrazvukové sondy vyrobené z titanu jsou autoklávovatelné.

• Opláchněte tkáň ledově studeným PBS (0,01 M, pH=7,4), abyste důkladně odstranili přebytečnou hemolýzu krve.
• Tkáň (ledvina, srdce, plíce, slezina atd.) se zváží a maceruje na malé kousky, které se homogenizují v PBS. Potřebný objem PBS souvisí s hmotností tkáně. Obecně platí, že 1 g tkáně vyžaduje přibližně 9 ml PBS. Doporučuje se přidat do PBS nějaký inhibitor proteázy. (Alternativně lze použít RIPA nebo hypotonický lytický pufr obsahující koktejl inhibitorů proteázy a fosfatázy.)
• V závislosti na velikosti tkáně může být pro předléčbu tkáně užitečné krátké ošetření vírem (cca 1-2 min. v 15sekundových pulzech).
• Namontujte mikrohrot, např. S26d2, na váš ultrasonicator. Zkumavku se vzorkem s ubrouskem se umístí do ledové lázně.
• Sonikujte vzorek pomocí ultrazvuku, např. UP200St (80% amplituda) po dobu 1 min. v pulzním režimu (15 sekund zapnuto, 15 sekund pauza). Vzorek se uchovává v ledové lázni.
• Homogenáty se poté odstředí, aby se získaly specifické skupiny (cytosolické, jaderné, mitochondriální nebo lysozomální), aby se obohatil protein pro analýzu. Odstředěním vzorku po dobu 5 minut při 5000 ×g se získá supernatant.

Spolehlivá regulace teploty během sonikace

Teplota je rozhodujícím faktorem ovlivňujícím proces, který je zvláště důležitý při zpracování biologických vzorků, např. aby se zabránilo tepelné degradaci proteinů. Stejně jako všechny techniky mechanické přípravy vzorků, sonikace vytváří teplo. Teplota vzorků však může být dobře kontrolována při použití zařízení Hielscher Ultrasonics. Představujeme vám různé možnosti sledování a řízení teploty vašich vzorků při jejich přípravě pomocí ultrazvuku typu sondy nebo VialTweeter preanalyticky.

1. Sledování teploty vzorku: Všechny digitální ultrazvukové procesory Hielscher jsou vybaveny inteligentním softwarem a zásuvným teplotním senzorem. Zapojte teplotní čidlo do ultrazvukového zařízení (např. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) a vložte špičku teplotního čidla do jedné ze vzorkových zkumavek. Prostřednictvím digitálního barevného dotykového displeje můžete v nabídce ultrazvukového procesoru nastavit konkrétní teplotní rozsah pro sonikaci vzorku. Ultrasouckator se automaticky zastaví, když je dosaženo maximální teploty, a pozastaví se, dokud teplota vzorku neklesne na nižší hodnotu nastavené teploty ∆. Poté se sonikace spustí automaticky znovu. Tato chytrá funkce zabraňuje degradaci vyvolané teplem.
2. Pokud jde o ultrazvukovou jednotku pro více vzorků VialTweeter, titanový blok, který drží vzorkovací trubice, může být předchlazen. Vložte blok VialTweeter (pouze sonotroda bez převodníku!) do lednice nebo mrazničky, aby se titanový blok předchladil, což pomáhá odložit nárůst teploty ve vzorku. Pokud je to možné, lze předchladit i samotný vzorek.
3. Použijte ledovou lázeň nebo suchý led k chlazení během sonikace. Umístěte zkumavku (zkumavky) se vzorkem během sonikace do ledové lázně. Pro VialTweeter použijte mělký podnos naplněný suchým ledem a umístěte VialTweeter na suchý led, aby se teplo mohlo rychle rozptýlit.

Zákazníci po celém světě používají Hielscher sondy-ultrazvukové přístroje, stejně jako vícevzorkové sonikační jednotky VialTweeter a UIP400MTP pro své každodenní práce na přípravě vzorků v biologických, biochemických, lékařských a klinických laboratořích. Díky inteligentnímu softwaru a řízení teploty procesorů Hielscher je teplota spolehlivě řízena a je zabráněno degradaci vzorku vyvolané teplem. Ultrazvuková příprava vzorků pomocí ultrazvukových řešení Hielscher poskytuje vysoce spolehlivé a reprodukovatelné výsledky!