Ultrazvuková lyze vzorků Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster je v laboratořích široce využívána jako modelový organismus. Proto je nutné často provádět preanalytické kroky přípravy vzorků Drosophila melanogaster, jako je lyze, dezintegrace buněk, extrakce proteinů a smykové štěpení DNA. Ultrazvukové dismembrátory jsou spolehlivé a účinné a lze je snadno použít k provádění různých úloh, jako je lyze, extrakce proteinů nebo fragmentace DNA, pouze úpravou parametrů ultrazvukového procesu. Ultrazvukové homogenizátory jsou tak flexibilními nástroji se širokým spektrem aplikací.

Ultrazvuková lyze a extrakce proteinů

Lyze, solubilizace buněk, homogenizace tkání a extrakce proteinů jsou typickými úlohami ultrazvukových dismembrátorů v biologických laboratořích. Ultrazvukové dismembrátory a dezintegrátory buněk jsou velmi vhodné k homogenizaci živočišných tkání, hmyzu (např. Drosophila melanogaster, C. elegans) nebo rostlinných vzorků. Dalšími aplikacemi ultrazvuku jsou lyze buněčných suspenzí a pelet a také extrakce intracelulárních proteinů.
Ultrazvuková lyze a extrakce proteinů jsou vysoce spolehlivé a reprodukovatelné procesy, které lze provádět na základě zavedených protokolů. Protože intenzitu ultrazvukového procesu lze přesně nastavit pomocí parametrů sonikace, jako je amplituda, cyklický / pulzní režim, teplota a objem vzorku, lze jednou ověřené protokoly opakovat stále znovu se stejným výsledkem.

Ultrazvuková fragmentace DNA a RNA

Po lyzi buněk a extrakci proteinů je běžně vyžadovaným krokem při přípravě vzorků smykové štěpení a fragmentace DNA, RNA a chromatinu, např. před imunoprecipitací chromatinu (ChIP). Fragmentace DNA a RNA lze spolehlivě dosáhnout rozrušením kovalentních vazeb, které drží DNA pohromadě, pomocí fyzikálních sil. Při fyzikálním smykovém štěpení, jako je sonikace, se nejprve přeruší vlákna DNA a poté se DNA fragmentuje na menší kousky.
Ultrazvuková fragmentace DNA je spolehlivá a účinná při smykovém štěpení DNA na cílovou délku, např. 500bp (párů bází). Mezi hlavní výhody ultrazvukové fragmentace DNA patří přesné řízení parametrů a intenzity ultrazvukového procesu. Parametry ultrazvukového procesu lze upravit přesným nastavením intenzity sonikace, cyklů a času. Díky tomu je možné vytvářet požadované velikosti DNA a cílovou délku DNA lze spolehlivě vytvořit i reprodukovat. Ultrazvukové smykové štěpení DNA je také ideální pro vytváření fragmentů DNA s vysokou molekulovou hmotností.

Protokoly pro ultrazvukovou lyzi Drosophila melanogaster

Níže naleznete různé protokoly pro ultrazvukem asistovanou lyzi, extrakci proteinů a fragmentaci DNA nebo chromatinu ze vzorků Drosophila.

Ultrazvuková lyze pro test imunoprecipitace se zesíťováním (CLIP)

Test CLIP byl proveden podle dříve publikovaného postupu s některými úpravami. Přibližně 20 mg vaječníků z 0 až 1 den starých samic divokého typu bylo zesíťováno UV zářením (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizováno na ledu v 1 mL pufru RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacharóza, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA, 1 mM PMSF) doplněného 300 U RNAseOUT a ponecháno na ledu 30 min. Homogenát byl sonikován na ledu při 80% výkonu pětkrát v 20 s pulzech s 60 s přestávkou mezi nimi pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) a centrifugován (16 000 × g po dobu 5 min při 4°C). Rozpustný extrakt byl předčištěn 20 μl dynabeads Protein-G po dobu 20 min při 4°C. Po odebrání vzorků pro imunoblotting a kvantifikaci vstupní RNA (1%) byl HP1 imunoprecipitován protilátkou anti-HP1 9A9 ze 450 μl předčištěného extraktu inkubací po dobu 4 h s 50 μl dynabeads Protein-G. Imunoprecipitáty byly 4krát promyty RCB. K eluci imunoprecipitovaných RNA byly peletované kuličky povařeny ve 100 μL vody UltraPure ošetřené DEPC po dobu 5 min. K supernatantu získanému pro přípravu RNA bylo přidáno 900 μL činidla Qiazol Reagent. Purifikovaná RNA byla použita jako templát pro syntézu cDNA s použitím oligo dT, náhodných hexamerů a reverzní transkriptázy SuperScript III podle protokolu výrobce.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvuková lyze pro test imunoprecipitace chromatinu

Imunoprecipitace chromatinu byla provedena podle metody popsané Menetem s drobnými úpravami. Přibližně 20 mg vaječníků z 0 až 1 den starých samic divokého typu bylo homogenizováno v 1 mL pufru NEB (10 mM HEPES-Na při pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na při pH 8, 0,5 mM EDTA-Na při pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA) pomocí homogenizátoru / ponorného dispergátoru po dobu 1 min (při 3000 rpm). Homogenát byl převeden do předchlazeného skleněného homogenizátoru Dounce a bylo provedeno 15 plných tahů těsným pístem. Volná jádra pak byla centrifugována při 6000xg po dobu 10 min při 4°C. Pelety obsahující jádra byly resuspendovány v 1 mL NEB a centrifugovány při 20 000 × g po dobu 20 min na sacharózovém gradientu (0,65 mL 1,6 M sacharózy v NEB, 0,35 mL 0,8 M sacharózy v NEB). Peleta byla resuspendována v 1 mL NEB a formaldehydu do výsledné koncentrace 1%. Jádra byla zesíťována po dobu 10 min při pokojové teplotě a reakce byla ukončena přidáním 1/10 objemu 1,375 M glycinu. Jádra byla shromážděna centrifugací při 6000 × g po dobu 5 min. Jádra byla dvakrát promyta v 1 mL NEB a resuspendována v 1 mL lyzačního pufru (15 mM HEPES-Na při pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA při pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-deoxycholát, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarkosin a 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA). Jádra byla sonikována pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) šestkrát po 20 s zapnutí a 1 min na ledu. Sonikovaná jádra byla centrifugována při 13 000 × g po dobu 4 min při 4°C. Většina sonikovaného chromatinu měla délku 500 až 1000 párů bází (bp). Pro každou imunoprecipitaci bylo 15 μg chromatinu inkubováno v přítomnosti 10 μg monoklonální protilátky HP1 9A9 (3 h při 4°C v rotačním kole). Poté bylo přidáno 50 μl dynabeads protein G a inkubace pokračovala přes noc při 4°C. Supernatanty byly odstraněny a vzorky byly dvakrát promyty v lyzačním pufru (každé promytí 15 min při 4 °C) a dvakrát v pufru TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl při pH 8). Chromatin byl eluován z kuliček ve dvou krocích; nejprve ve 100 μl elučního pufru 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl při pH 8) při 65°C po dobu 15 min, s následnou centrifugací a odebráním supernatantu. Materiál kuliček byl znovu extrahován ve 100 μl TE + 0,67% SDS. Spojený eluát (200 μl) byl inkubován přes noc při 65°C ke zvrácení zesíťování a ošetřen 50 μg/ml RNaseA po dobu 15 min při 65°C a 500 μg/ml proteinázy K po dobu 3 h při 65°C. Vzorky byly extrahovány fenol–chloroformem a vysráženy ethanolem. DNA byla resuspendována ve 25 μl vody. Pro maximalizaci molekulárních analýz s imunoprecipitovanou DNA byly kandidátní geny amplifikovány v párech pomocí optimalizovaného protokolu duplex-PCR s použitím dvou různých sad primerů s podobnými teplotami tání v jedné reakci.
(Casale et al. 2019)

Vysoce výkonné ultrazvukové dezintegrátory buněk pro biologické vzorky

Hielscher Ultrasonics je vaším dlouholetým zkušeným partnerem, pokud jde o vysoce výkonné sonikátory pro dezintegraci buněk, lyzi, extrakci proteinů, fragmentaci DNA, RNA a chromatinu i další preanalytické kroky přípravy vzorků. Díky ucelenému portfoliu ultrazvukových laboratorních homogenizátorů a jednotek pro přípravu vzorků má Hielscher ideální ultrazvukové zařízení pro vaši biologickou aplikaci a požadavky.
Klasický sonikátor sondového typu s mikrohrotem, jako je UP200St (200W; viz obrázek vlevo), nebo jedna z ultrazvukových jednotek pro přípravu vzorků VialTweeter nebo UP200ST_TD_CupHorn s držákem VialHolder patří k oblíbeným modelům ve výzkumných a analytických laboratořích. Klasická ultrazvuková sonda je ideální, když je třeba lyzovat, extrahovat nebo fragmentovat menší počet vzorků. Jednotky pro přípravu vzorků VialTweeter a UP200St_TD_CupHorn umožňují současnou sonikaci až 10, resp. 5 lahviček.
Pokud je třeba zpracovat velký počet vzorků (např. 96jamkové destičky, mikrotitrační destičky atd.), UIP400MTP je ideální sestavou pro sonikaci. UIP400MTP funguje jako větší cuphorn, který je naplněn vodou a má dostatek prostoru pro umístění mikrojamkových destiček. Díky výkonnému ultrazvukovému procesoru o výkonu 400 wattů zajišťuje UIP400MTP velmi rovnoměrnou a intenzivní sonikaci multijamkových destiček za účelem dezintegrace buněk, lyze vzorků, solubilizace pelet, extrakce proteinů nebo smykového štěpení DNA.

Přesné řízení pomocí chytrého softwaru

Všechna sonikační řešení Hielscher od 200 wattů výše jsou vybavena digitální barevnou dotykovou obrazovkou a inteligentním softwarem. Díky chytrému protokolování dat se všechny parametry ultrazvukového procesu automaticky ukládají jako soubor CSV na vestavěnou SD kartu, jakmile je sonikátor spuštěn. Výzkum a protokolování jsou tak mnohem pohodlnější. Po sonikačních pokusech nebo přípravě vzorků můžete jednoduše zkontrolovat parametry sonikace každého sonikačního běhu a porovnat je.
Pomocí intuitivního menu lze před sonikací předem nastavit řadu parametrů: Například pro řízení teploty ve vzorku a zabránění jeho tepelné degradaci lze nastavit horní mez teploty vzorku. Zásuvný teplotní senzor, který je dodáván s ultrazvukovou jednotkou, poskytuje ultrazvukovému procesoru zpětnou vazbu o skutečné teplotě při sonikaci. Při dosažení horní teplotní meze se ultrazvukové zařízení pozastaví, dokud není dosaženo dolní meze nastaveného ∆T, a poté automaticky znovu zahájí sonikaci.
Pokud je vyžadována sonikace se specifickým energetickým vstupem, můžete předem nastavit konečnou ultrazvukovou energii sonikačního běhu. Samozřejmě lze individuálně nastavit také ultrazvukovou pulzaci a cyklický režim.
Abyste mohli znovu použít své nejúspěšnější parametry sonikace, můžete uložit různé režimy sonikace (např. dobu sonikace, intenzitu, cyklický režim atd.) jako přednastavené režimy, aby je bylo možné snadno a rychle znovu spustit.
Pro větší pohodlí obsluhy lze všechny digitální ultrazvukové jednotky ovládat dálkově přes prohlížeč v jakémkoli běžném prohlížeči (např. InternetExplorer, Safari, Chrome atd.). Připojení LAN je jednoduché nastavení typu plug-n-play a nevyžaduje instalaci žádného dalšího softwaru.
My ve společnosti Hielscher víme, že úspěšná sonikace biologických vzorků vyžaduje přesnost a opakovatelnost. Proto jsme naše sonikátory navrhli jako chytrá zařízení se všemi funkcemi, které umožňují efektivní, spolehlivou, reprodukovatelnou a pohodlnou přípravu vzorků.

Níže uvedená tabulka udává přibližnou zpracovatelskou kapacitu našich ultrazvukových systémů od ultrazvukových mikrohrotů a klasických ultrazvukových homogenizátorů po ultrazvukové přístroje MultiSample pro pohodlnou a spolehlivou přípravu velkého počtu vzorků: