Ultrazvuková lýza vzorků Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster je široce používána v laboratořích jako modelový organismus. Proto musí být často prováděny preanalytické přípravné kroky, jako je lýza, narušení buněk, extrakce proteinů a stříhání DNA vzorků Drosophila melanogaster. Ultrazvukové demembrátory jsou spolehlivé a efektivní a lze je snadno použít k provádění různých úkolů, jako je lýza, extrakce proteinů nebo fragmentace DNA, pouze úpravou parametrů ultrazvukového procesu. Ultrazvukové homogenizátory jsou tedy flexibilní nástroje s širokou škálou aplikací.
Ultrazvuková lýza a extrakce proteinů
Lýza, buněčná solubilizace, homogenizace tkání a extrakce proteinů jsou typickými úkoly pro ultrazvukové demembrátory v biologických laboratořích. Ultrazvukové rozprašovače a buněčné disruptory jsou vhodné pro homogenizaci živočišných tkání, hmyzu (např. Drosophila melanogaster, C. elegans) nebo rostlinných vzorků. Následnými aplikacemi ultrazvuku jsou lýza buněčných suspenzí a pelet, jakož i extrakce intracelulárních proteinů.
Ultrazvuková lýza a extrakce proteinů jsou vysoce spolehlivé a reprodukovatelné procesy, které lze provádět na základě zavedených protokolů. Vzhledem k tomu, že intenzita ultrazvukového procesu může být přesně nastavena pomocí parametrů sonikace, jako je amplituda, režim cyklu / pulzu, teplota a objem vzorku, lze jednou osvědčené protokoly opakovat se stejným výsledkem znovu a znovu.
- Vysoká efektivita
- Nastavitelné pro konkrétní materiál vzorku
- Vhodné pro jakýkoli objem
- netepelná úprava
- Reprodukovatelné výsledky
- Jednoduché a bezpečné
Ultrazvuková fragmentace DNA a RNA
Po buněčné lýze a extrakci proteinů je běžným požadovaným krokem při přípravě vzorku střih a fragmentace DNA, RNA a chromatinu, např. před imunoprecipitací chromatinu (ChIP). Fragmentace DNA a RNA lze spolehlivě dosáhnout rozbitím kovalentních vazeb, které drží DNA pohromadě, fyzickými silami. Při použití fyzického střihu, jako je sonikace, se nejprve rozbijí řetězce DNA, poté se DNA roztříští na menší kousky.
Ultrazvuková fragmentace DNA je spolehlivá a účinná při stříhání DNA na cílovou délku, např. 500 bp (páry bází). Mezi hlavní výhody ultrazvukové fragmentace DNA patří přesné řízení parametrů a intenzity ultrazvukového procesu. Parametry ultrazvukového procesu lze upravit přesným laděním intenzity sonikace, cyklů a času. To umožňuje vytvořit požadované velikosti DNA a cílová délka DNA může být spolehlivě vyrobena i reprodukována. Ultrazvukové stříhání DNA je také ideální pro vytváření fragmentů DNA s vysokou molekulovou hmotností.
Protokoly pro ultrazvukovou lýzu Drosophila melanogaster
Níže naleznete různé protokoly pro ultrazvukem asistovanou lýzu, extrakci proteinů a fragmentaci DNA nebo chromatinu ve vzorcích octomilky.
Ultrazvuková lýza pro stanovení zesíťování imunoprecipitace (CLIP)
CLIP test byl proveden tak, jak bylo dříve oznámeno, s určitými úpravami. Přibližně 20 mg vaječníků od 0 do 1 dne starých samic divokého typu bylo UV zesíťováno UV zářením (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizováno na ledu v 1 ml RCB pufru (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacharóza, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Proteas Inhibitors, 1 mM PMSF) doplněno 300 U RNAseOUT a umístěno na led po dobu 30 min. Homogenát byl sonikován na ledu, při 80% výkonu, pětkrát v 20 s dávkách s 60 s přestávkou mezi použitím Hielscher ultrazvukový procesor UP100H (100 W, 30 kHz) a odstředěné (16000 × g po dobu 5 minut při 4 °C). Rozpustný extrakt byl předem vyčištěn 20 μl Protein-G dynabeads po dobu 20 minut při 4 °C. Po odebrání vzorků pro imunoblotting a kvantifikaci vstupu RNA (1 %) byl HP1 imunoprecipitován anti-HP1 9A9 protilátkou ze 450 μl předčištěného extraktu inkubací po dobu 4 hodin s 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecipitáty byly 4krát promyty RCB. Pro eluaci imunoprecipitovaných RNA se peletované kuličky vařily ve 100 μl vody upravené UltraPure DEPC po dobu 5 minut. 900 μl činidla Qiazol bylo přidáno k supernatantu získanému pro přípravu RNA. Purifikovaná RNA byla použita jako templát pro syntézu cDNA pomocí oligo dT, náhodných hexamerů a SuperScript reverzní transkriptázy III podle protokolu výrobce.
(Cassale et al. 2019)
Ultrazvuková lýza pro stanovení imunoprecipitace chromatinu
Imunoprecipitace chromatinu byla provedena podle metody popsané Menetem s drobnými modifikacemi. Přibližně 20 mg vaječníků od 0 až 1 den starých samic divokého typu bylo homogenizováno v 1 ml pufru NEB (10 mM HEPES-Na při pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na při pH 8, 0,5 mM EDTA-Na při pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA- free kompletní inhibitory proteázy) pomocí homogenizátoru / ponorného dispergátoru 1 min (při 3000 ot./min). Homogenát se přenesl do předem vychlazené sklenice a pomocí těsné tloučku se aplikovalo 15 plných tahů. Volná jádra byla poté centrifugována při 6000xg po dobu 10 minut při 4 °C. Pelety obsahující jádra byly resuspendovány v 1 ml NEB a centrifugovány při 20000 × g po dobu 20 minut na sacharózovém gradientu (0,65 ml 1,6 M sacharózy v NEB, 0,35 ml 0,8 M sacharózy v NEB). Peleta byla resuspendována v 1 ml NEB a formaldehydu na konečnou koncentraci 1 %. Jádra byla zesíťována po dobu 10 minut při pokojové teplotě a zchlazena přidáním 1/10 obj. 1,375 M glycinu. Jádra byla získána centrifugací při 6000 × g po dobu 5 minut. Jádra byla dvakrát promyta v 1 ml NEB a resuspendována v 1 ml lyzačního pufru (15 mM HEPES-Na při pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA při pH 8, 1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1 % Na deoxycholát, 0,1 % SDS, 0,5 % N-lauroylsarkosinu a 1× EDTA-free kompletní inhibitory proteázy). Jádra byla sonikována pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) Šestkrát po dobu 20 s a 1 min na ledě. Sonikovaná jádra byla centrifugována při 13000 × g po dobu 4 minut při 4 °C. Většina sonikovaného chromatinu byla 500 až 1000 párů bází (bp) na délku. Pro každou imunoprecipitaci bylo inkubováno 15 μg chromatinu v přítomnosti 10 μg monoklonální protilátky HP1 9A9 (3 h při 4 °C v rotujícím kole). Poté bylo přidáno 50 μl proteinu G dynabeads a inkubace pokračovala přes noc při teplotě 4 °C. Supernatanty byly zlikvidovány a vzorky byly dvakrát promyty v lyzačním pufru (každé promytí 15 minut při 4 °C) a dvakrát v TE pufru (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl při pH 8). Chromatin byl eluován z kuliček ve dvou krocích; nejprve ve 100 μl eluitionového pufru 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl při pH 8) při 65 °C po dobu 15 minut, poté centrifugace a zpětné získávání supernatantu. Materiál kuliček byl znovu extrahován ve 100 μl TE + 0,67 % SDS. Kombinovaný eluát (200 μl) byl inkubován přes noc při 65 °C, aby se zvrátily příčné vazby, a byl zpracován 50 μg/ml RNázy A po dobu 15 minut při 65 °C a 500 μg/ml proteinázy K po dobu 3 hodin při 65 °C. Vzorky byly extrahovány fenolem a chloroformem a vysrážen ethanol. DNA byla resuspendována ve 25 μl vody. Pro maximalizaci molekulárních analýz s imunoprecipitovanou DNA byly kandidátní geny amplifikovány v párech pomocí optimalizovaného duplex-PCR protokolu s použitím dvou různých sad primerů s podobnými teplotami tání v jedné reakci.
(Casale et al. 2019)
Vysoce výkonné ultrazvukové buněčné disruptory pro biologické vzorky
Hielscher Ultrasonics je váš dlouholetý zkušený partner, pokud jde o vysoce výkonné ultrasonicators pro narušení buněk, lýzu, extrakci proteinů, fragmentaci DNA, RNA a chromatinu, jakož i další kroky přípravy vzorků před analýzou. Nabízí komplexní portfolio ultrazvukových laboratorních homogenizátorů a jednotek pro přípravu vzorků, Hielscher má ideální ultrazvukové zařízení pro vaši biologickou aplikaci a požadavky.
Klasický ultrazvukový přístroj typu sondy s mikrohrotem, jako je UP200St (200 W; viz obrázek vlevo) nebo jedna z ultrazvukových jednotek pro přípravu vzorků VialTweeter nebo UP200ST_TD_CupHorn s VialHolder jsou oblíbené modely ve výzkumných a analytických laboratořích. Klasická ultrazvuková sonda je ideální, když je třeba připravit méně vzorků, které je třeba lyzovat, extrahovat nebo fragmentovat. Jednotky pro přípravu vzorků VialTweeter a UP200St_TD_CupHorn umožňují současnou sonikaci až 10 nebo 5 lahviček.
Pokud je nutné zpracovat velké množství vzorků (např. 96jamkové destičky, mikrotitrační destičky atd.), UIP400MTP je ideální nastavení ultrazvuku. UIP400MTP funguje jako větší cuphorn, který je naplněn vodou a má dostatek prostoru pro uložení mikrojamkových destiček. Poháněn 400 wattovým výkonným ultrazvukovým procesorem, UIP400MTP poskytuje velmi rovnoměrnou a intenzivní sonikaci vícejamkových destiček s cílem narušit buňky, lyzovat vzorky, solubilizovat pelety, extrahovat proteiny nebo stříhat DNA.
Přesné ovládání pomocí chytrého softwaru
Všechna řešení Hielscher sonikace od 200 wattů výše jsou vybavena digitálním barevným dotykovým displejem a inteligentním softwarem. Prostřednictvím inteligentního datového protokolu se všechny parametry ultrazvukového procesu automaticky ukládají jako soubor CSV na vestavěnou SD kartu, jakmile je ultrasonicator spuštěn. Díky tomu je výzkum a protokolování mnohem pohodlnější. Po zkouškách sonikace nebo přípravě vzorku můžete jednoduše zkontrolovat parametry sonikace každého běhu ultrazvuku a porovnat je.
Prostřednictvím intuitivního menu lze před ultrazvukem přednastavit řadu parametrů: Například pro řízení teploty ve vzorku a pro zabránění jeho tepelné degradace lze nastavit horní mez teploty vzorku. Zásuvný teplotní senzor, který je dodáván s ultrazvukovou jednotkou, poskytuje ultrazvukovému procesoru zpětnou vazbu o skutečné teplotě ultrazvuku. Když je dosaženo horního teplotního limitu, ultrazvukové zařízení se pozastaví, dokud není dosaženo dolní hranice nastavené ∆T, a poté se znovu automaticky sonikuje.
Pokud je vyžadována sonikace se specifickým energetickým vstupem, můžete přednastavit konečnou ultrazvukovou energii běhu ultrazvuku. Ultrazvukovou pulzaci a cyklický režim lze samozřejmě také individuálně nastavit.
Chcete-li znovu použít své nejúspěšnější parametry sonikace, můžete uložit různé režimy sonikace (např. Čas sonikace, intenzita, režim cyklu atd.) jako přednastavené režimy, takže je lze snadno a rychle znovu spustit.
Pro větší pohodlí obsluhy lze všechny digitální ultrazvukové jednotky ovládat pomocí dálkového ovládání prohlížeče v jakémkoli běžném prohlížeči (např. InternetExplorer, Safari, Chrome atd.). Připojení k síti LAN je jednoduché nastavení plug-n-play a nevyžaduje žádnou další instalaci softwaru.
My v Hielscher víme, že úspěšná sonikace biologických vzorků vyžaduje přesnost a opakovatelnost. Proto jsme navrhli naše ultrasonikátory jako inteligentní zařízení se všemi funkcemi, které umožňují efektivní, spolehlivou, reprodukovatelnou a pohodlnou přípravu vzorků.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližnou kapacitu zpracování našich ultrazvukových systémů od ultrazvukových mikrošpiček a klasických ultrazvukových homogenizátorů až po ultrazvukové ultrazvukové zesilovače MultiSample pro pohodlnou a spolehlivou přípravu mnoha vzorků:
Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
---|---|---|
96-jamkové / mikrotitrační destičky | Není k dispozici | UIP400MTP |
10 lahviček à 0,5 až 1,5 ml | Není k dispozici | VialTweeter na UP200St |
CupHorn pro nepřímou sonikaci, např. až 5 lahviček | Není k dispozici | UP200ST_TD_CupHorn |
0.01 až 250 ml | 5 až 100 ml/min | UP50H |
001 až 500 ml | 10 až 200 ml / min | UP100H |
0.02 až 1L | 20 až 400 ml/min | UP200Ht / UP200St |
10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
0.25 až 5L | 005 až 1 l / min | UIP500hdT |
Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!
Fakta, která stojí za to vědět
Metabolomika
Metabolomika je studium malých molekul, známých jako metabolity, přítomných v buňkách, biotekutinách, tkáních nebo organismech. Tyto malé molekuly a jejich interakce v rámci biologického systému jsou shrnuty pod zastřešujícím pojmem "metabolom" a oblast výzkumu se nazývá metabolomika. Výzkum metabolomů je úzce spjat s rychle se rozvíjejícím oborem precizní medicíny. Pochopení metabolomu a jeho vztahu k různým onemocněním pomáhá rozvíjet strategie prevence onemocnění a klinické péče, zatímco individuální variabilita v prostředí, životním stylu, genetice a molekulárním fenotypu. Aby se uvolnily molekuly metabolitů z buněk, ultrazvuku se často používá v biologických laboratořích pro preanalytickou přípravu vzorků, jako je narušení buněk, lýza a extrakce proteinů, lipidů a dalších molekul.
Literatura / Reference
- Casale, A.M.; Cappucci, U.; Fanti, L.; Piacentini, L. (2019): Heterochromatin protein 1 (HP1) is intrinsically required for post-transcriptional regulation of Drosophila Germline Stem Cell (GSC) maintenance. Sci Rep 9, 4372 (2019).
- Ristola, M.; Arpiainen, S., Saleem, M.A.; Mathieson, P.W.; Welsh, G.I.; Lehtonen, S.; Holthöfer, H.(2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biol 10, 83 (2009).
- Kharchenko, P.V: et al. (2011): Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila. Nature. 2011 Mar 24; 471(7339): 480–485.