Ultrazvuková lýza vzorků Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster se široce používá v laboratořích jako modelový organismus. Proto musí být často prováděny kroky předanalyzační přípravy, jako je lýza, narušení buněk, extrakce bílkovin a stříhání DNA vzorků Drosophila melanogaster. Ultrazvukové dismembratory jsou spolehlivé a efektivní a mohou být použity k provádění různých úkolů, jako je lýza, extrakce bílkovin nebo fragmentace DNA v klidu pouze úpravou ultrazvukových parametrů procesu. Ultrazvukové homogenizátory jsou tak flexibilní nástroje s širokou škálou aplikací.

Ultrazvuková lýza a extrakce bílkovin

Drosophila melanogaster is widely used as model organism in biological labs. Find here protocols for lysis, protein extracion and DNA shearing of D. melanogaster samples.Lýza, solubilizace buněk, homogenizace tkání a extrakce bílkovin jsou typické úkoly pro ultrazvukové dismembrators v biologických laboratořích. Ultrazvukové dismembrators a buněčné disruptory jsou vhodné pro homogenizaci zvířecích tkání, hmyzu (např. drosophila melanogaster, C. elegans) nebo rostlinných vzorků. Následné aplikace ultrazvuku jsou lýza buněčných suspenzí a pelet, stejně jako extrakce intracelulárních proteinů.
Ultrazvuková lýza a extrakce bílkovin jsou vysoce spolehlivé a reprodukovatelné procesy, které lze provádět na základě zavedených protokolů. Vzhledem k tomu, ultrazvukové intenzity procesu lze přesně nastavit pomocí parametrů použití ultrazvuku, jako je amplituda, cyklus / pulzní režim, teplota a objem vzorku, jakmile osvědčené protokoly mohou být opakovány se stejným výsledkem znovu a znovu.

Výhody ultrazvukové přípravy vzorků

  • vysoce účinný
  • Nastavitelná podle specifického materiálu vzorku
  • Vhodné pro jakýkoli objem
  • Nete termické ošetření
  • reprodukovatelné výsledky
  • Jednoduché a bezpečné

Ultrazvuková fragmentace DNA a RNA

Po buněčné lýze a extrakci bílkovin je běžným požadovaným krokem při přípravě vzorku stříhání a fragmentace DNA, RNA a chromatinu, např. před imunoprecipitací chromatinu (ChIP). Fragmentace DNA a RNA může být spolehlivě dosažena rozbitím kovalentních vazeb, které drží DNA pohromadě fyzickými silami. Pomocí fyzického stříhání, jako je použití ultrazvuku, jsou nejprve vlákna DNA rozbita, pak je DNA fragmentována na menší kousky.
Ultrazvuková fragmentace DNA je spolehlivá a účinná při střízání DNA na cílovou délku, například 500bp (párů bází). Mezi hlavní výhody ultrazvukové fragmentace DNA patří přesná kontrola ultrazvukových procesních parametrů a intenzity. Ultrazvukové parametry procesu lze přesně upravit laděním intenzity použití ultrazvuku, cyklů a času. To umožňuje vytvářet požadované velikosti DNA a cílenou délku DNA lze spolehlivě vytvářet a reprodukovat. Ultrazvukové stříhací DNA je také ideální pro vytvoření fragmentů DNA s vysokou molekulovou hmotností.

Ultrasonicator UP200Ht with microtip S26d2 for ultrasonic lysis of Drosophila samples

ultrazvukovač Uf200 ः t s 2mm mikrotipem S26d2 pro použití ultrazvuku vzorků Drosophila

Žádost o informace





Protokoly pro ultrazvukové lýzy Drosophila melanogaster

Níže najdete různé protokoly pro ultrazvukem asistované lýzy, extrakce bílkovin, a DNA nebo chromatin fragmentace vzorků Drosophila.

Ultrazvuková lýza pro cross-propojení imunoprecipitace (CLIP) Test

Test CLIP byl proveden, jak bylo dříve hlášeno, s některými úpravami. Přibližně 20 mg vaječníků od 0 do 1 dne starých samic divokého typu bylo UV zkříženo (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizováno na ledu v 1 ml RCB pufru (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacharóza, 1 mM DTT, 1× EDTA bez kompletních inhibitorů proteázy, 1 mM PMSF) doplněné 300 U RNAseOUT a umístěné na led po dobu 30 minut. Homogenát byl sonikován na ledu, při 80% výkonu, pětkrát za 20 s výbuchy s 60 s odpočinkem mezi použitím ultrazvukového procesoru Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) a odstřeďovat (16000 × g po dobu 5 minut při 4 °C). Rozpustný extrakt byl předem odčasován 20 μl protein-g dynabeád po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. Po odstranění vzorků pro imunoblagramikátu a kvantifikaci vstupu RNA (1 %) byl HP1 imunoprecipitován protilátkou proti HP1 9A9 z 450 μl předčasného extraktu inkubací po dobu 4 hodin s dynabeádami proteinu G 50 μl. Imunoúměry byly promyty 4krát RCB. K elulování imunoprecipitovaných RNA byly granulované kuličky vařeny ve 100 μl vody ošetřené ultrapurem DEPC po dobu 5 min. 900 μL Qiazol reagent byl přidán do supernatantu získaného pro přípravek RNA. RNA purified byl použit jako šablona pro syntézu cDNA pomocí oligo dT, náhodné hexamátory a SuperScript reverzní transkripce III podle protokolu výrobce.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvuková lýza pro chromatin imunoprecipitační test

Chromatinová imunoprecipitace byla provedena metodou popsanou společností Menet s menšími úpravami. Přibližně 20 mg vaječníků od samic 0- do 1 dne divokého typu bylo homogenizováno v 1 ml PUFRu NEB (10 mM HEPES-Na při pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na při pH 8, 0,5 mM EDTA-Na při pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermie, 1× EDTA bez inhibitorů kompletní proteázy) s homogenizátorem / ponorný dispergátor 1 min (při 3000 ot/min). Homogenát byl přenesen do předem chlazeného skleněného dounce a 15 plných zdvihů bylo aplikováno těsnou palicí. Volná jádra byla poté odstředěna při 6000xg po dobu 10 minut při 4 °C. Pelety obsahující jádra byly resuspendovány v 1 ml NEB a odstředěny při 20000 × g po dobu 20 minut na gradientu sacharózy (0,65 ml 1,6 M sacharózy v NEB, 0,35 ml 0,8 M sacharózy v NEB). Peleta byla resuspendována v 1 ml NEB a formaldehydu na konečnou koncentraci 1%. Jádra byla zkřížena po dobu 10 minut při pokojové teplotě a uhašena přidáním 1/10 vol 1.375 M glycinu. Jádra byla shromažďována odstředivky při 6000 × g po dobu 5 minut. Jádra byla dvakrát omyta v 1 ml NEB a resuspendována v 1 ml lýzového pufru (15 mM HEPES-Na při pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA při pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosin a 1× inhibitory kompletní proteázy bez EDTA). Jádra byla sonikována pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) šestkrát za 20 s a 1 min na ledě. Sonikovaná jádra byla odstřeďována při 13000 × g po dobu 4 minut při 4 °C. Většina sonicated chromatin byl 500 do 1000 párů bází (bp) na délku. Pro každou imunoprecipitaci bylo inkubováno 15 μg chromatinu za přítomnosti 10 μg monoklonální protilátky HP1 9A9 (3 h při 4 °C v rotujícím kole). Poté bylo přidáno 50 μl proteinu G dynabeád a inkubace pokračovala přes noc při teplotě 4 °C. Supernatanty byly vyřazeny a vzorky byly dvakrát promyty v lyzovém pufru (každé promytí 15 minut při 4 °C) a dvakrát v TE bufferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl při pH 8). Chromatin byl eluován z korálků ve dvou krocích; nejprve ve 100 μl Eluičního pufru 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl při pH 8) při 65°C po dobu 15 minut, následované odstředěním a rekuperací supernatantu. Materiál korálků byl znovu extrahován ve 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinovaný eluát (200 μl) byl inkubován přes noc při teplotě 65 °C, aby se obrátily příčné spoje, a ošetřen 50 μg/ml RNaseA po dobu 15 minut při 65 °C a 500 μg/ml proteinázy K po dobu 3 h při 65 °C. Vzorky byly extrahovány fenolem a chloroformem a ethanol vysrážen. DNA byla resuspendována ve 25 μl vody. Pro maximalizaci molekulárních analýz s imunoprecipitovanou DNA byly kandidátské geny zesíleny ve dvojicích pomocí optimalizovaného duplex-PCR protokolu pomocí dvou různých sad primerů s podobnou teplotou tání v jedné reakci.
(Casale et al. 2019)

UP200St TD_CupHorn pro nepřímou použití ultrazvuku vzorků

UP200St TD_CupHorn pro nepřímou použití ultrazvuku vzorků, jako je stříkaní DNA a chromatinu

Vysoce výkonné ultrazvukové buněčné disruptory pro biologické vzorky

Hielscher Ultrazvuk je váš dlouholetý partner, pokud jde o vysoce výkonné ultrasonicators pro narušení buněk, lýza, extrakce bílkovin, DNA, RNA, a chromatin fragmentace, stejně jako další pre-analytické kroky přípravy vzorku. Nabízí komplexní portfolio ultrazvukových laboratorních homogenizátorů a jednotek přípravy vzorků, Hielscher má ideální ultrazvukové zařízení pro vaše biologické aplikace a požadavky.
Sondy typu insonifier UP200St pro lýzuKlasický ultrazvukový systém sondy s mikro-špičkou, jako je UP200St (200W; viz obrázek vlevo) nebo jedna z ultrazvukových jednotek přípravy vzorků VialTweeter nebo UP200ST_TD_CupHorn s VialHolder jsou oblíbené modely ve výzkumných a analytických laboratořích. Klasická ultrazvuková sonda je ideální, když připravit méně vzorků musí být lysed, extrahované nebo roztříštěné. Jednotky pro přípravu vzorků VialTweeter a UP200St_TD_CupHorn umožňují současnou použití ultrazvuku až 10 nebo 5 lahviček.
Pokud musí být zpracovány vysoké počty vzorků (např. desky s 96 vrty, mikrotitrační destičky atd.), UIP400MTP je ideální nastavení použití ultrazvuku. UIP400MTP funguje jako větší cuphorn, který je naplněn vodou a má dostatek prostoru pro držení mikro-dobře desky. Běží na 400 wattů výkonný ultrazvukový procesor, UIP400MTP přináší velmi rovnoměrné a intenzivní použití ultrazvuku multi-well desky s cílem narušit buňky, lyzové vzorky, rozpustné pelety, extrahovat proteiny nebo smykové DNA.

Přesné ovládání pomocí inteligentního softwaru

Hielscher je průmyslové procesory řady HDT může být pohodlné a uživatelsky přívětivé ovládat pomocí dálkového ovládání prohlížeče.Všechna řešení hielscherské ultrazvuku od 200 wattů nahoru jsou vybavena digitální barevnou dotykovou obrazovkou a inteligentním softwarem. Prostřednictvím inteligentního datového protokolu jsou všechny ultrazvukové parametry procesu automaticky uloženy jako soubor CSV na vestavěné SD kartě, jakmile je ultrazvukový systém spuštěn. Díky tomu je výzkum a protokolování mnohem pohodlnější. Po použití ultrazvuku zkoušek nebo přípravy vzorku, můžete jednoduše zkontrolovat sonikace parametry každé použití ultrazvuku spustit a porovnat je.
Prostřednictvím intuitivní nabídky lze před sonikací nastavit řadu parametrů: Například pro kontrolu teploty ve vzorku a pro zabránění jeho tepelné degradaci lze nastavit horní hranici teploty vzorku. Připojitelný teplotní senzor, který je dodáván s ultrazvukovou jednotkou, poskytuje ultrazvukovému procesoru zpětnou vazbu o skutečné teplotě ultrazvuku. Když je dosaženo horního teplotního limitu, ultrazvukové zařízení se pozastaví, dokud není dosaženo spodní hranice ∆T a začne automaticky sonikovat znovu.
Pokud je vyžadována sonikace s konkrétním energetickým vstupem, můžete přednastavit konečnou ultrazvukovou energii ultrazvuku. Samozřejmě, ultrazvukové pulzace a cyklu režim může být individuálně nastavit, taky.
Chcete-li znovu použít nejúspěšnější parametry použití ultrazvuku, můžete uložit různé režimy použití ultrazvuku (např. čas použití ultrazvuku, intenzita, režim cyklu atd.) jako předinstalovaných režimů, takže mohou být snadno a rychle zahájeny znovu.
Pro větší provozní pohodlí mohou být všechny digitální ultrazvukové jednotky ovládány pomocí dálkového ovládání prohlížeče v jakémkoli běžném prohlížeči (např. Připojení LAN je jednoduché nastavení plug-n-play a nevyžaduje žádnou další instalaci softwaru.
My v Hielscheru víme, že úspěšná sonikace biologických vzorků vyžaduje přesnost a opakovatelnost. Proto jsme navrhli naše ultrasonicators jako inteligentní zařízení se všemi funkcemi, které umožňují efektivní, spolehlivé, reprodukovatelné a pohodlné přípravy vzorků.

Kontaktujte nás a řekněte nám o svých biologických vzorcích a požadovaných přípravných krocích. Navrhneme vám nejvhodnější ultrazvukové zařízení pro přípravu vzorků a pomůžeme vám s dalšími informacemi, jako jsou protokoly a doporučení.

Níže uvedená tabulka vám dává indikaci přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrazvukových systémů od ultrazvukových mikro-tipů a klasických ultrazvukových homogenizátorů až po ultrasonicators MultiSample pro pohodlnou a spolehlivou přípravu mnoha vzorků:

Hromadná dávka průtok Doporučené Devices
96-well / mikrotitrační desky na UIP400MTP
10 lahviček à 0,5 až 1,5 ml na VialTweeter na UP200St
CupHorn pro nepřímou použití ultrazvuku, např. na UP200ST_TD_CupHorn
0.01 až 250 ml 5 až 100 ml/min UP50H
0.01 až 500 ml 10 až 200 ml / min UP100H
0.02 až 1l 20 až 400 ml / min Uf200 ः t / UP200St
10 až 2000ml 20 až 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
0.25 až 5l 0.05 až 1L/min UIP500hdT

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Požádejte o další informace

Použijte prosím níže uvedený formulář a vyžádejte si další informace o ultrazvukových procesorech, aplikacích a ceně. Rádi s vámi probereme váš proces a nabídneme vám ultrazvukový systém splňující vaše požadavky!









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků VialTweeter umožňuje současnou použití ultrazvuku až 10 lahviček. S upnutým zařízením VialPress lze pro intenzivní použití ultrazvuku přitlačit až 4 další trubky dopředu.

Literatura / Reference



Hielscher Ultrasonics supplies high-performance ultrasonic homogenizers from lab to industrial size.

Vysoce výkonný ultrazvuk! Hielscher je produktová řada pokrývá celé spektrum od kompaktní laboratoře ultrasonicator přes bench-top jednotky na full-průmyslové ultrazvukové systémy.


Fakta Worth Knowing

Metabolomika

Metabolomika je studium malých molekul, známých jako metabolity, přítomných v buňkách, biofluidech, tkáních nebo organismech. Tyto malé molekuly a jejich interakce v rámci biologického systému jsou shrnuty pod zastřešujícím termínem "metabolom" a výzkumné pole se nazývá metabolomika. Výzkum metabolomu úzce souvisí s rychle se rozvíjejícím oborem přesné medicíny. Pochopení metabolomu a jeho vztahu k různým onemocněním pomáhá rozvíjet strategie prevence onemocnění a klinické péče při individuální variabilitě prostředí, životního stylu, genetiky a molekulárního fenotypu. Za účelem uvolnění molekul metabolitu z buněk se ultrazvuku často používá v biologických laboratořích pro přípravu preanalytických vzorků, jako je narušení buněk, lýza a extrakce bílkovin, lipidů a dalších molekul.