Protokol pro sars-cov-2 koronavirové inaktivace s ultrazvukem

Hielscher VialTweeter je unikátní ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků, která se používá k inaktivaci koronaviru SARS-COV-2. VialTweeter umožňuje připravit až 10 vzorkových lahviček současně a je tak ideální jednotkou pro zpracování hmotnostních vzorků.

Inaktivace coronaviru SARS-CoV-2 pomocí VialTweeteru

Po odstranění fixační, monolayers byly omyty třikrát s fosfát-pufrovaný fyziologický roztok (PBS) před škrábání buněk do 1mL MEM / 5% FBS a sonicated (3 × 10 sekund, 10 sekund off na 100% energie a amplituda) pomocí Hielscher ultrazvukový procesor UP200St s VialTweeter Přílohu. Supernatanty byly objasněny odstřeďováním při 3000 × g po dobu 10 minut. 

Přečtěte si celý protokol zde pro SARS-CoV-2 koronavirové inaktivace Welch et al. (2020) níže:

Buňky a virus

Buňky Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) byly kultivovány v modifikovaném Eagleho minimálním esenciálním médiu (MEM) doplněné 10% (v/v) plodovým telecím sérem (FCS). Použitý virus byl kmen SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolovaný PHE od prvního klastru pacientů ve Velké Británii dne 29.01.2020. Tento virus byl získán v průchodu 1 a použit pro inaktivační studie v průchodu 2 nebo 3.
Pokud jde o činidla a chemické látky používané pro inaktivaci SARS-CoV-2 a odstranění cytotoxicity činidla, viz vědecká zpráva welch et al. (2020).

Inaktivace virem detergenty – SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivační protokol welch et al. 2020

Inaktivace SARS-Cov-2

U komerčních produktů jsou virové přípravky (tkáňová kultivační tekutina, titry v rozmezí od 1 × 10⁶ až 1 × 10⁸ PFU/ml) byly ošetřeny ve trojím vyhotoveném činidly v koncentracích a v době styku doporučené v návodu výrobce k použití, jsou-li k dispozici, nebo pro koncentrace a časy výslovně požadované zkušebními laboratořemi. Pokud výrobce uvedl řadu koncentrací, byl zkoušen nejnižší poměr výrobku ke vzorku (tj. nejnižší doporučená koncentrace zkušebního výrobku). Činidla pro transportní trubice vzorku byla testována s poměrem jednoho objemu tekutiny tkáňové kultury k deseti objemům činidla, pokud výrobce neupřesnil objemový poměr vzorkové tekutiny k činidlu. Detergenty, fixační prostředky a rozpouštědla byly testovány v uvedených koncentracích pro uvedené časy. Všechny inaktivační kroky byly provedeny při pokojové teplotě (18 – 25 °C). Pro testování alternativních typů vzorků byl virus obohacen do indikované matrice vzorku v poměru 1:9 a poté ošetřen zkoušenými činidly, jak je uvedeno výše. Všechny experimenty zahrnovaly zetěhotněné vzorky s kontrolou trojího vyhotovování s ekvivalentním objemem PBS namísto zkušebního činidla. Bezprostředně po požadované době kontaktu bylo zpracováno 1 ml zpracovaného vzorku za použití vhodně zvolené filtrační matrice. Odstranění činidla pro testování inaktivace bylo provedeno ve větším formátu odstřeďovací kolony pomocí pierce 4mL čisticích otvorů pro odstranění pracího prostředku (Thermo Fisher) nebo vyplněním prázdných odstředivek pierce 10mL (Thermo Fisher) s SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR nebo Sephadex LH-20, aby se daly 4mL balené korálky / resin. Pro čištění pomocí filtrů Amicon byly 2 × 500μl vzorků čištěny dvěma odstředivými filtry dříve popsanou metodou a poté sloučeny. Pro formaldehyd a formaldehyd s odstraněním glutaraldehydu byl použit jeden filtr s objemem vzorku 1× 500 μl, resuspendován po zpracování v 500μl PBS a přidán do 400ul MEM/5% FBS. Pro inaktivaci infikovaných jednovrstla, 12,5 cm² baňky buněk Vero E6 (2,5 × 10⁶ buňky/baňka v 2,5 ml MEM/5% FBS) byly infikovány při MOI 0,001 a inkubovány při 37 °C/5 % CO₂ po dobu 24 hodin. Supernatant byl odstraněn a buňky fixovány pomocí 5 ml formaldehydu nebo formaldehydu a glutaraldehydu při pokojové teplotě po dobu 15 nebo 60 minut. Fixační přípravek byl odstraněn a jednovrstvé prány třikrát umyly PBS před škrábáním buněk do 1ml MEM / 5% FBS a sonicated (3 × 10 sekund, 10 sekund off na 100% výkon a amplituda) pomocí UP200St s VialTweeter přílohu (Hielscher Ultrazvuk technologie). Supernatanty byly objasněny odstřeďováním při 3000 × g po dobu 10 minut.

Podrobnosti o činidle používaném pro inaktivaci koronaviru SARS-CoV-2 s ultrazvukovým VialTweeter podle protokolu Welch et al. 2020

Úplný protokol včetně použití Hielscher VialTweeter naleznete zde:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikované ultrazvukové disembrátory a buněčné disruptory

Vícesměnný ultrasonicator VialTweeter je jen jedním z mnoha ultrazvukových roztoků pro přípravu vzorků v biologických, biochemických a klinických laboratořích. Hielscher Ultrasonics nabízí ideální ultrazvukový dismembrator pro vaši aplikaci, například lýzu buněk, extrakci buněk, homogenizaci tkání, solubilizaci lyzau, rozpouštění, odplynění vzorků atd.
Dejte nám vědět, kolik vzorků budete muset zpracovat za hodinu a den, pokud dáváte přednost přímé nebo nepřímé použití ultrazvuku a co je cílem ultrazvukové ošetření vzorku. Doporučíme vám nejvhodnější ultrazvukovou jednotku pro každodenní pracovní rutinu!
Hielscher Ultrazvuk 'digitální ultrazvukové procesory jsou vybaveny inteligentní software, automatické nahrávání dat, snadné pre-nastavení možnosti pro regulaci teploty, doba použití ultrazvuku, cyklus / pulzní režim, stejně jako osvětlení vzorku a dálkové ovládání prohlížeče. Snažíme se, aby naše ultrazvukové přístroje byly co nejchodnější, aby se vaše výzkumná a pracovní rutina stala co nejpohodlnější a nejúspěšnější.
Klikněte zde, najít další aplikace, včetně protokolů ultrazvukové přípravy vzorku s VialTweeter!