Protokol pro inaktivaci koronaviru SARS-CoV-2 se sonikací

Hielscher VialTweeter je unikátní ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků, která se používá k inaktivaci koronaviru SARS-COV-2. VialTweeter umožňuje připravit až 10 lahviček se vzorky současně a je tak ideální jednotkou pro hromadné zpracování vzorků.

Inaktivace koronaviru SARS-CoV-2 pomocí VialTweeter

Po odstranění fixačního prostředku byly monovrstvy třikrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) před seškrábnutím buněk do 1 ml MEM / 5% FBS a sonikovány (3 × 10 sekund zapnuto, 10 sekund vypnuto při 100% výkonu a amplitudě) pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP200St s vialTweeterem příloha. Supernatanty byly čiřeny odstředěním při 3000 × g po dobu 10 minut. 

Přečtěte si celý protokol pro inaktivaci koronaviru SARS-CoV-2 od Welch et al. (2020) níže:

Buňky a viry

Články Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) byly kultivovány v modifikovaném minimálním esenciálním médiu (MEM) Eagle doplněném 10% (v/v) fetálním telecím sérem (FCS). Použitým virem byl kmen SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolovaný pomocí PHE z prvního shluku pacientů ve Velké Británii dne 29. 1. 2020. Tento virus byl získán v pasáži 1 a použit pro inaktivační studie v pasáži 2 nebo 3.
Reagencie a chemikálie používané k inaktivaci SARS-CoV-2 a k odstranění cytotoxicity činidel naleznete ve vědecké zprávě Welch et al. (2020).

Inaktivace virů čisticími prostředky – Protokol inaktivace koronaviru SARS-CoV-2 od Welch et al. 2020

Inaktivace SARS-CoV-2

U komerčních produktů virové přípravky (tkáňová kultivační tekutina, titry v rozmezí od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) byly zpracovány třikrát činidly při koncentracích a po dobu kontaktu doporučenou v návodu k použití výrobce, jsou-li k dispozici, nebo pro koncentrace a doby výslovně požadované zkušebními laboratořemi. Pokud výrobce uváděl rozmezí koncentrací, zkoušel se nejnižší poměr výrobku ke vzorku (tj. nejnižší doporučená koncentrace zkoušeného výrobku). Reagencie pro transportní zkumavky vzorků byly testovány s poměrem jednoho objemu tkáňové kultivační tekutiny k deseti objemům činidla, pokud výrobce nespecifikoval objemový poměr vzorkové tekutiny k činidlu. Detergenty, fixační prostředky a rozpouštědla byly testovány v uvedených koncentracích po uvedené časy. Všechny kroky inaktivace byly prováděny při pokojové teplotě (18 – 25 °C). Pro testování alternativních typů vzorků byl virus vložen do indikované matrice vzorku v poměru 1:9 a poté ošetřen testovacími činidly, jak je uvedeno výše. Všechny experimenty zahrnovaly trojnásobné kontrolní vzorky ošetřené simulovaným způsobem s ekvivalentním objemem PBS místo testovacího činidla. Bezprostředně po požadované době kontaktu byl zpracován 1 ml ošetřeného vzorku pomocí vhodně zvolené filtrační matrice. Odstranění činidla pro testování inaktivace bylo provedeno ve větším formátu spinové kolony pomocí Pierce 4mL detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) nebo naplněním prázdných centrifugačních kolon Pierce o kapacitě 10 ml (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR nebo Sephadex LH-20, aby se získaly 4 ml balené kuličky/pryskyřice. Pro čištění pomocí filtrů Amicon byly vzorky 2 × 500 μl vyčištěny pomocí dvou odstředivých filtrů výše popsanou metodou a poté sloučeny dohromady. Pro formaldehyd a formaldehyd s odstraněním glutaraldehydu byl použit jeden filtr s objemem vzorku 1× 500 μl, který byl po zpracování resuspendován v 500 μl PBS a přidán do 400 ul MEM/5% FBS. Pro inaktivaci infikovaných jednovrstvé, 12,5 cm² baňky buněk Vero E6 (2,5 × 10⁶ buňky/baňka v 2,5 ml MEM/5% FBS) byly infikovány při MOI 0,001 a inkubovány při 37 °C/5 % CO₂ po dobu 24 hodin. Supernatant byl odstraněn a buňky fixovány pomocí 5 ml formaldehydu nebo formaldehydu a glutaraldehydu při pokojové teplotě po dobu 15 nebo 60 minut. Fixační prostředek byl odstraněn a monovrstvy byly třikrát promyty PBS před škrábnutím buněk do 1 ml MEM / 5% FBS a sonikovány (3 × 10 sekund zapnuto, 10 sekund vypnuto při 100% výkonu a amplitudě) pomocí UP200St s nástavcem VialTweeter (Hielscher ultrazvuková technologie). Supernatanty byly čiřeny odstředěním při 3000 × g po dobu 10 minut.

Podrobnosti o činidle použitém pro inaktivaci koronaviru SARS-CoV-2 pomocí ultrazvukového VialTweeteru podle protokolu Welch et al. 2020

Úplný protokol včetně použití Hielscher VialTweeter lze nalézt zde:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikované ultrazvukové demembrátory a buněčné disruptory

Vícevzorkový ultrasonikator VialTweeter je jen jedním z mnoha ultrazvukových řešení pro přípravu vzorků v biologických, biochemických a klinických laboratořích. Hielscher Ultrasonics nabízí ideální ultrazvukový dismembrator pro vaši aplikaci, např. lýza buněk, extrakce buněk, homogenizace tkání, solubilizace lyzátu, rozpouštění, odplyňování vzorku atd.
Dejte nám vědět, kolik vzorků musíte zpracovat za hodinu a den, zda dáváte přednost přímé nebo nepřímé sonikaci a jaký je cíl ultrazvukové úpravy vzorku. Doporučíme vám nejvhodnější ultrazvukovou jednotku pro vaši každodenní pracovní rutinu!
Digitální ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics jsou vybaveny inteligentním softwarem, automatickým záznamem dat, snadnými možnostmi přednastavení pro regulaci teploty, délkou sonikace, režimem cyklu / pulzu, stejně jako osvětlením vzorku a dálkovým ovládáním prohlížeče. Snažíme se, aby naše ultrazvuková zařízení byla co nejchytřejší, aby se vaše výzkumná a pracovní rutina stala co nejpohodlnější a nejúspěšnější.
Klikněte zde, abyste našli další aplikace včetně protokolů pro přípravu ultrazvukových vzorků pomocí VialTweeter!