Protokol pro inaktivaci koronaviru SARS-CoV-2 pomocí sonikace

Hielscher VialTweeter je unikátní ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků, která se používá k inaktivaci koronaviru SARS-COV-2. VialTweeter umožňuje připravit až 10 vzorkových vialek současně, a je proto ideální jednotkou pro hromadné zpracování vzorků.

Inaktivace koronaviru SARS-CoV-2 pomocí zařízení VialTweeter

Po odstranění fixativa byly monovrstvy třikrát promyty fosfátovým pufrem (PBS), poté byly buňky seškrábnuty do 1mL MEM/5% FBS a sonikovány (3 × 10 sekund zapnuto, 10 sekund vypnuto při 100% výkonu a amplitudě) pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP200St s VialTweeter jako nástavcem. Supernatanty byly vyčiřeny centrifugací při 3000 × g po dobu 10 min. Celý protokol inaktivace koronaviru SARS-CoV-2 podle Welch et al. (2020) si přečtěte zde níže:

Buňky a virus

Buňky Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) byly kultivovány v modifikovaném Eagleově minimálním esenciálním médiu (MEM) doplněném 10% (v/v) fetálním telečím sérem (FCS). Použitým virem byl kmen SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolovaný PHE z prvního klastru pacientů ve Spojeném království dne 29/01/2020. Tento virus byl získán v pasáži 1 a použit pro inaktivační studie v pasáži 2 nebo 3.
Reagencie a chemikálie použité pro inaktivaci SARS-CoV-2, jakož i odstranění cytotoxicity reagencií naleznete ve vědecké zprávě Welch et al. (2020).

Inaktivace viru detergenty – protokol inaktivace koronaviru SARS-CoV-2 podle Welch et al. 2020

Inaktivace SARS-CoV-2


U komerčních produktů byly virové preparace (tkáňová kultivační tekutina, titry v rozmezí od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) ošetřeny v triplikátu reagenciemi v koncentracích a po kontaktní doby doporučené v pokynech výrobce k použití, pokud byly dostupné, nebo v koncentracích a dobách specificky požadovaných testujícími laboratořemi. Pokud výrobce uvedl rozmezí koncentrací, byl testován nejnižší poměr produktu ke vzorku (tj. nejnižší doporučená koncentrace testovaného produktu). Reagencie transportních zkumavek na vzorky byly testovány v poměru jednoho objemu tkáňové kultivační tekutiny k deseti objemům reagencie, pokud výrobce nespecifikoval objemový poměr vzorkové tekutiny k reagencii. Detergenty, fixativa a rozpouštědla byly testovány v uvedených koncentracích po uvedené doby. Všechny inaktivační kroky byly provedeny při okolní pokojové teplotě (18 – 25°C). Pro testování alternativních typů vzorků byl virus přidán do uvedené vzorkové matrice v poměru 1:9 a poté ošetřen testovacími reagenciemi jako výše. Všechny experimenty zahrnovaly triplikátní kontrolní vzorky ošetřené naslepo s ekvivalentním objemem PBS místo testovací reagencie. Bezprostředně po požadované kontaktní době byl 1mL ošetřeného vzorku zpracován pomocí vhodně zvolené filtrační matrice. Odstranění reagencií pro inaktivační testování bylo provedeno ve větším formátu spin kolon pomocí Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) nebo naplněním prázdných centrifugačních kolon Pierce o kapacitě 10mL (Thermo Fisher) kuličkami SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR nebo Sephadex LH-20 tak, aby vzniklo 4mL sbalených kuliček/pryskyrice. Pro purifikaci pomocí filtrů Amicon byly 2 × 500μl vzorky purifikovány dvěma centrifugačními filtry dříve popsanou metodou a poté spojeny dohromady. Pro odstranění formaldehydu a formaldehydu s glutaraldehydem byl použit jeden filtr s objemem vzorku 1× 500μl, který byl po zpracování resuspendován v 500μl PBS a přidán do 400ul MEM/5% FBS. Pro inaktivaci infikovaných monovrstev byly kultivační nádoby o ploše 12,5 cm² s buňkami Vero E6 (2,5 × 10⁶ buněk/nádobu ve 2,5mL MEM/5% FBS) infikovány při MOI 0,001 a inkubovány při 37°C/5% CO₂ po dobu 24 hodin. Supernatant byl odstraněn a buňky byly fixovány 5mL formaldehydu nebo formaldehydu a glutaraldehydu při pokojové teplotě po dobu 15 nebo 60 min. Fixativum bylo odstraněno a monovrstvy byly třikrát promyty PBS, poté byly buňky seškrábnuty do 1mL MEM/5% FBS a sonikovány (3 × 10 sekund zapnuto, 10 sekund vypnuto při 100% výkonu a amplitudě) pomocí UP200St s nástavcem VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanty byly vyčiřeny centrifugací při 3000 × g po dobu 10 min.


Podrobnosti o reagencii použité pro inaktivaci koronaviru SARS-CoV-2 pomocí ultrazvukového zařízení VialTweeter podle protokolu Welch et al. 2020

Celý protokol včetně použití zařízení Hielscher VialTweeter naleznete zde:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Vyspělé ultrazvukové dismembrátory a dezintegrátory buněk

Ultrazvukový sonikátor pro více vzorků VialTweeter je jen jedním z mnoha ultrazvukových řešení pro přípravu vzorků v biologických, biochemických a klinických laboratořích. Hielscher Ultrasonics nabízí ideální ultrazvukový dismembrátor pro vaši aplikaci, např. lýzu buněk, extrakci z buněk, homogenizaci tkání, solubilizaci lyzátu, rozpouštění, odplyňování vzorků atd.
Dejte nám vědět, kolik vzorků musíte zpracovat za hodinu a za den, zda preferujete přímou nebo nepřímou sonikaci a co je cílem ultrazvukového zpracování vzorků. Doporučíme vám nejvhodnější ultrazvukovou jednotku pro vaši každodenní práci!
Digitální ultrazvukové procesory společnosti Hielscher Ultrasonics jsou vybaveny inteligentním softwarem, automatickým zaznamenáváním dat, snadnými možnostmi předvolby regulace teploty, doby sonikace, cyklického/pulzního režimu, jakož i osvětlením vzorku a dálkovým ovládáním přes prohlížeč. Snažíme se, aby naše ultrazvuková zařízení byla co nejinteligentnější, aby váš výzkum a pracovní rutina byly co nejpohodlnější a nejúspěšnější.
Klikněte zde a najděte další aplikace včetně protokolů ultrazvukové přípravy vzorků se zařízením VialTweeter!