Hielscher ultrazvuková technologie

Protokol pro sars-cov-2 koronavirové inaktivace s ultrazvukem

Hielscher VialTweeter je unikátní ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků, která se používá k inaktivaci koronaviru SARS-COV-2. VialTweeter umožňuje připravit až 10 vzorkových lahviček současně a je tak ideální jednotkou pro zpracování hmotnostních vzorků.

Inaktivace coronaviru SARS-CoV-2 pomocí VialTweeteru

Po odstranění fixační, monolayers byly omyty třikrát s fosfát-pufrovaný fyziologický roztok (PBS) před škrábání buněk do 1mL MEM / 5% FBS a sonicated (3 × 10 sekund, 10 sekund off na 100% energie a amplituda) pomocí Hielscher ultrazvukový procesor UP200St s VialTweeter Přílohu. Supernatanty byly objasněny odstřeďováním při 3000 × g po dobu 10 minut. 

Přečtěte si celý protokol zde pro SARS-CoV-2 koronavirové inaktivace Welch et al. (2020) níže:

Buňky a virus

Buňky Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) byly kultivovány v modifikovaném Eagleho minimálním esenciálním médiu (MEM) doplněné 10% (v/v) plodovým telecím sérem (FCS). Použitý virus byl kmen SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolovaný PHE od prvního klastru pacientů ve Velké Británii dne 29.01.2020. Tento virus byl získán v průchodu 1 a použit pro inaktivační studie v průchodu 2 nebo 3.
Pokud jde o činidla a chemické látky používané pro inaktivaci SARS-CoV-2 a odstranění cytotoxicity činidla, viz vědecká zpráva welch et al. (2020).

The ultrasonic sample preparation unit VialTweeter is used for the inactivation of SARS-CoV-2 coronavirus

Inaktivace virem detergenty – SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivační protokol welch et al. 2020

Inaktivace SARS-Cov-2

U komerčních produktů jsou virové přípravky (tkáňová kultivační tekutina, titry v rozmezí od 1 × 106 až 1 × 108 PFU/ml) byly ošetřeny ve trojím vyhotoveném činidly v koncentracích a v době styku doporučené v návodu výrobce k použití, jsou-li k dispozici, nebo pro koncentrace a časy výslovně požadované zkušebními laboratořemi. Pokud výrobce uvedl řadu koncentrací, byl zkoušen nejnižší poměr výrobku ke vzorku (tj. nejnižší doporučená koncentrace zkušebního výrobku). Činidla pro transportní trubice vzorku byla testována s poměrem jednoho objemu tekutiny tkáňové kultury k deseti objemům činidla, pokud výrobce neupřesnil objemový poměr vzorkové tekutiny k činidlu. Detergenty, fixační prostředky a rozpouštědla byly testovány v uvedených koncentracích pro uvedené časy. Všechny inaktivační kroky byly provedeny při pokojové teplotě (18 – 25 °C). Pro testování alternativních typů vzorků byl virus obohacen do indikované matrice vzorku v poměru 1:9 a poté ošetřen zkoušenými činidly, jak je uvedeno výše. Všechny experimenty zahrnovaly zetěhotněné vzorky s kontrolou trojího vyhotovování s ekvivalentním objemem PBS namísto zkušebního činidla. Bezprostředně po požadované době kontaktu bylo zpracováno 1 ml zpracovaného vzorku za použití vhodně zvolené filtrační matrice. Odstranění činidla pro testování inaktivace bylo provedeno ve větším formátu odstřeďovací kolony pomocí pierce 4mL čisticích otvorů pro odstranění pracího prostředku (Thermo Fisher) nebo vyplněním prázdných odstředivek pierce 10mL (Thermo Fisher) s SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR nebo Sephadex LH-20, aby se daly 4mL balené korálky / resin. Pro čištění pomocí filtrů Amicon byly 2 × 500μl vzorků čištěny dvěma odstředivými filtry dříve popsanou metodou a poté sloučeny. Pro formaldehyd a formaldehyd s odstraněním glutaraldehydu byl použit jeden filtr s objemem vzorku 1× 500 μl, resuspendován po zpracování v 500μl PBS a přidán do 400ul MEM/5% FBS. Pro inaktivaci infikovaných VialTweeter at the ultrasonic processor UP200STjednovrstla, 12,5 cm2 baňky buněk Vero E6 (2,5 × 106 buňky/baňka v 2,5 ml MEM/5% FBS) byly infikovány při MOI 0,001 a inkubovány při 37 °C/5 % CO2 po dobu 24 hodin. Supernatant byl odstraněn a buňky fixovány pomocí 5 ml formaldehydu nebo formaldehydu a glutaraldehydu při pokojové teplotě po dobu 15 nebo 60 minut. Fixační přípravek byl odstraněn a jednovrstvé prány třikrát umyly PBS před škrábáním buněk do 1ml MEM / 5% FBS a sonicated (3 × 10 sekund, 10 sekund off na 100% výkon a amplituda) pomocí UP200St s VialTweeter přílohu (Hielscher Ultrazvuk technologie). Supernatanty byly objasněny odstřeďováním při 3000 × g po dobu 10 minut.

VialTweeter pro intenzivní Sonikaci uzavřených LAHVIK

VialTweeter pro intenzivní použití ultrazvuku uzavřených lahviček

Žádost o informace





Various reagents have been tested for the inactivation of the SARS-CoV-2 coronavirus using the ultrasonic sample prep unit VialTweeter.

Podrobnosti o činidle používaném pro inaktivaci koronaviru SARS-CoV-2 s ultrazvukovým VialTweeter podle protokolu Welch et al. 2020

Úplný protokol včetně použití Hielscher VialTweeter naleznete zde:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

The multi-sample ultrasonicator VialTweeter allows for simultaneous sample preparation of up to 10 vials under same process conditions. The VialTweeter is an established ultrasonic device used for the inactivation of corona virus SARS-CoV-2 (Click to enlarge!)

VialTweeter pro inaktivaci ultrazvukového viru

Výhody VialTweeter v kostce

  • Sonikace až 10 lahviček současně
  • Žádná křížová kontaminace
  • Žádná ztráta vzorku
  • Automatické zaznamenávání dat
  • Snadné a bezpečné ovládání
VialTweeter se také používá pro

  • Lyóza buněk
  • Narušení virových částic
  • Extrakce nukleové kyseliny: Izolace DNA/RNA
  • Fragmentace DNA/RNA
  • Solubilizace lyzátu
  • Sofistikované ultrazvukové disembrátory a buněčné disruptory

    Vícesměnný ultrasonicator VialTweeter je jen jedním z mnoha ultrazvukových roztoků pro přípravu vzorků v biologických, biochemických a klinických laboratořích. Hielscher Ultrasonics nabízí ideální ultrazvukový dismembrator pro vaši aplikaci, například lýzu buněk, extrakci buněk, homogenizaci tkání, solubilizaci lyzau, rozpouštění, odplynění vzorků atd.
    Dejte nám vědět, kolik vzorků budete muset zpracovat za hodinu a den, pokud dáváte přednost přímé nebo nepřímé použití ultrazvuku a co je cílem ultrazvukové ošetření vzorku. Doporučíme vám nejvhodnější ultrazvukovou jednotku pro každodenní pracovní rutinu!
    Hielscher Ultrazvuk 'digitální ultrazvukové procesory jsou vybaveny inteligentní software, automatické nahrávání dat, snadné pre-nastavení možnosti pro regulaci teploty, doba použití ultrazvuku, cyklus / pulzní režim, stejně jako osvětlení vzorku a dálkové ovládání prohlížeče. Snažíme se, aby naše ultrazvukové přístroje byly co nejchodnější, aby se vaše výzkumná a pracovní rutina stala co nejpohodlnější a nejúspěšnější.
    Klikněte zde, najít další aplikace, včetně protokolů ultrazvukové přípravy vzorku s VialTweeter!

    Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

    Požádejte o další informace

    Použijte prosím níže uvedený formulář a vyžádejte si další informace o ultrazvukových procesorech, aplikacích a ceně. Rádi s vámi probereme váš proces a nabídneme vám ultrazvukový systém splňující vaše požadavky!









    Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


    Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

    Hielscher Ultrazvuk vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory pro míchání aplikací, disperze, emulgaci a extrakce v laboratoři, pilotním a průmyslovém měřítku.

    Literatura / Reference



    Fakta Worth Knowing

    Co jsou buňky Vero?

    Vero E6, také známý jako Vero C1008 (ATCC č. CRL-1586) je klonová buněčná linie z Vero 76 a používá se ve výzkumu koronavirů SARS-CoV a SARS-CoV-2. Vero buňky jsou linie buněk používaných v buněčných kulturách. 'Vero’ linie byla izolována z ledvinových epiteliálních buněk extrahovaných z africké zelené opice (Chlorocebus sp.).
    Vero E6 buňky vykazují určitou kontaktní inhibici, takže jsou vhodné pro šíření virů, které se replikují pomalu. Buněčné linie Vero E6 se běžně používají k vyšetření cytopatologie koronavirů SARS-CoV a SARS-CoV-2, protože Vero buňky (africké zelené opičí ledvinové buňky) vykazují bohatou expresi enzymu 2 (ACE2) převádějícího angiotenzin. Receptory ACE2 jsou hlavním dokovacím místem koronaviru SARS-CoV-2.
    Ogando et al. (2020) například zjistil, že SARS-CoV-2 – ve srovnání se SARS-CoV – generoval vyšší hladiny intracelulární virové RNA, ale nápadně asi 50krát méně infekčního virového potomstvo bylo získáno z kultivačního média. Dále zjistili, že citlivost obou virů na tři zavedené inhibitory replikace koronaviru (Remdesivir, Alisporivir a chlorochin) je velmi podobná, ale že infekce SARS-CoV-2 byla podstatně citlivější na předléčbu buněk pegylovaným interferonem alfa. Důležitým rozdílem mezi těmito dvěma viry je skutečnost, že – při průchodu v buňkách Vero E6 – SARS-CoV-2 je zřejmě pod silným selekčním tlakem, aby získal adaptivní mutace v genu spike proteinu. Tyto mutace mění nebo odstraňují domnělé "furin-like štěpení" v oblasti spojující S1 a S2 domény a vedou k velmi výrazné fenotypové změně plaku.